Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.
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Artículo de método
El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones
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Resumen
Resumen
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más agresivo de los tumores cerebrales sin tratamientos curativos disponibles hasta la fecha.
Los modelos murinos de esta patología se basan en la inyección de una suspensión de células de glioma en el parénquima cerebral después de la incisión de la duramadre. Considerando que las células se tienen que inyectar superficialmente para ser accesible a intravital microscopía de dos fotones, las inyecciones superficiales dejar de recapitular las condiciones fisiopatológicas. De hecho, escapando a través del tracto inyección mayoría de las células tumorales alcanzan el espacio extra-dural donde se expanden con mayor velocidad en ausencia de limitaciones mecánicas de la parénquima.
Nuestros mejoras consisten no sólo en focalmente la implantación de un esferoide de glioma en lugar de la inyección de una suspensión de células de glioma en las capas superficiales de la corteza cerebral, pero también en la obstrucción del sitio de la inyección por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado que está pegado a la surrounding parénquima y sellado de duramadre con cianoacrilato. En total, estas medidas hacen cumplir la expansión fisiológica y la infiltración de las células tumorales en el interior del parénquima cerebral. Craneotomía se cerró con una ventana de cristal cimentado en el cráneo para permitir imágenes crónica durante semanas en ausencia de desarrollo de tejido cicatricial.
Tomando ventaja de los animales transgénicos fluorescentes injertados con células tumorales fluorescentes hemos demostrado que la dinámica de las interacciones que se producen entre las células de glioma, las neuronas (por ejemplo, ratones Thy1-PPC) y la vasculatura (resaltado por una inyección intravenosa de un colorante fluorescente) se pueden visualizar por intravital microscopía de dos fotones durante la progresión de la enfermedad.
La posibilidad de una imagen del tumor en la resolución microscópica en un ambiente cerebral mínimamente comprometida representa una mejora de los actuales modelos de animales con GBM que debería beneficiar al campo de la neuro-oncología y la prueba de la droga.
Introducción
El glioblastoma multiforme se presenta como la forma más agresiva de tumor cerebral en adultos con una supervivencia media de 12 meses y una de 5 años la tasa de supervivencia de 5%. El manejo clínico se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia a menudo se usan en combinación. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos siguen siendo paliativa 1-3.
Hasta ahora, la mayoría de los estudios de neuro-oncología se basan en técnicas que sólo son capaces de proporcionar una visión estática y realizar en grandes cohortes de animales portadores de tumores se sacrificaron a diferentes puntos de tiempo (véase, por ejemplo....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y en cumplimiento de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La investigación en animales ha sido autorizada por la Dirección Départementale des Servicios Veterinarios des Bouches-du-Rhône (licencia D-13-055-21) y aprobado por el comité ético de Provence Côte d'Azur n ° 14 (Proyecto 87-04122012) .
1. Preparación Esferoides
- Preparación de los platos de agarosa recubiertas de Petri
- Mezclar 1 g de agarosa con 10....
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Resultados
Una vez que el protocolo quirúrgico se lleva a cabo (Figura 1), los animales pueden ser observados por medio de microscopía fluorescente sobre semanas hasta el sacrificio. Una reacción inflamatoria puede ser observada después de la cirugía que desaparece en una o dos semanas. El crecimiento del tumor se puede observar por diversas técnicas de microscopía incluyendo macroscopía fluorescente y microscopía de dos fotones (Figura 2). Imágenes de ejemplo representadas aquí se realizaron en u.......
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Discusión
Este enfoque permite el uso de métodos de formación de imágenes ópticas para supervisar más de días y semanas el crecimiento de un glioma de ortotópicamente implantado. El mismo animal, posteriormente, puede ser sometido a prácticamente cualquier modalidad de formación de imágenes del cerebro durante el curso de la patología; sin embargo, la preparación específica microscopía de dos fotones ofrece la oportunidad única de conseguir una resolución subcelular dentro del cerebro del animal vivo. Nuestro protocolo presenta l.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen calurosamente al Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber y A. Jaouen útil para los debates; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, el personal del Bioterio del IBDML y el personal de la plataforma de imágenes PicSIL en IBDML para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) para FD, por becas de la Federación de la Recherche Médicale y Cancéropole PACA a CR.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Taladro | Dremel (Alemania) | 398 | cualquier taladro de hueso quirúrgico de alta calidad sería suficiente |
| Taladro Fresa (# 1/4 Fresa redonda de carburo) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 501860 (# 1/4) | también vendido por Harvard Apparatus |
| Tijeras de tejido World | Precision Instruments (EE. UU.) | 14395 | |
| Pinzas Dumont M5S | World Precision Instruments (EE. UU.) | 501764 | |
| Cemento dental | GACD (EE. UU.) | 12-565 y 12-568 | |
| Cianoacrilato | Eleco-EFD (Francia) | Cyanolit 201 | |
| Capilares de vidrio sin filamento | Clark Electromedical Instruments (Reino Unido) | GC100-15 | |
| Jeringa de microlitros (25 & micro; l) | Hamilton (EE. UU.) | 702 | |
| Micromanipulador | World Precision Instruments (EE. UU.) | Derivación de cometa R | |
| (llave de paso de 3 vías - bloqueo Luer) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 14035-10 | |
| Marco estereotáctico (adaptador de ratón) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 502063 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Warner Instruments (EE. UU.) | CS-5R (64-0700) | |
| Gel de dextrano reticulado (Sephadex) G50 Grueso 100-300 µ m perlas | Disponible de varios proveedores, entre ellos Sigma (Alemania) | ||
| Pomada para los ojos | TVM (Francia) | Ocry-gel | |
| Microscopio de fluorescencia | Leica MZFLIII (Alemania) | también vendido por otras empresas | |
| Microscopio de dos fotones | Zeiss LSM 7MP (Alemania) | también vendido por otras empresas (Nikon, …) | |
| Láser infrarrojo de femtosegundo sintonizable (Maï-Taï) | Spectra Physics (EE.UU.) | también vendido por otras empresas |
Referencias
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al.
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Reimpresiones y permisos
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