Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.
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Artículo de método
El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones
En este artículo
Resumen
Resumen
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más agresivo de los tumores cerebrales sin tratamientos curativos disponibles hasta la fecha.
Los modelos murinos de esta patología se basan en la inyección de una suspensión de células de glioma en el parénquima cerebral después de la incisión de la duramadre. Considerando que las células se tienen que inyectar superficialmente para ser accesible a intravital microscopía de dos fotones, las inyecciones superficiales dejar de recapitular las condiciones fisiopatológicas. De hecho, escapando a través del tracto inyección mayoría de las células tumorales alcanzan el espacio extra-dural donde se expanden con mayor velocidad en ausencia de limitaciones mecánicas de la parénquima.
Nuestros mejoras consisten no sólo en focalmente la implantación de un esferoide de glioma en lugar de la inyección de una suspensión de células de glioma en las capas superficiales de la corteza cerebral, pero también en la obstrucción del sitio de la inyección por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado que está pegado a la surrounding parénquima y sellado de duramadre con cianoacrilato. En total, estas medidas hacen cumplir la expansión fisiológica y la infiltración de las células tumorales en el interior del parénquima cerebral. Craneotomía se cerró con una ventana de cristal cimentado en el cráneo para permitir imágenes crónica durante semanas en ausencia de desarrollo de tejido cicatricial.
Tomando ventaja de los animales transgénicos fluorescentes injertados con células tumorales fluorescentes hemos demostrado que la dinámica de las interacciones que se producen entre las células de glioma, las neuronas (por ejemplo, ratones Thy1-PPC) y la vasculatura (resaltado por una inyección intravenosa de un colorante fluorescente) se pueden visualizar por intravital microscopía de dos fotones durante la progresión de la enfermedad.
La posibilidad de una imagen del tumor en la resolución microscópica en un ambiente cerebral mínimamente comprometida representa una mejora de los actuales modelos de animales con GBM que debería beneficiar al campo de la neuro-oncología y la prueba de la droga.
Introducción
El glioblastoma multiforme se presenta como la forma más agresiva de tumor cerebral en adultos con una supervivencia media de 12 meses y una de 5 años la tasa de supervivencia de 5%. El manejo clínico se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia a menudo se usan en combinación. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos siguen siendo paliativa 1-3.
Hasta ahora, la mayoría de los estudios de neuro-oncología se basan en técnicas que sólo son capaces de proporcionar una visión estática y realizar en grandes cohortes de animales portadores de tumores se sacrificaron a diferentes puntos de tiempo (véase, por ejemplo, 4,5). El reciente desarrollo de métodos de seguimiento basado en intravital de imágenes permite el estudio del crecimiento glioma y las interacciones entre las células tumorales y su microambiente fisiopatológico en el mismo animal con el tiempo. Esto abre el camino a la exclusiva pieza de información que era hasta ahora inalcanzable 6. Los animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés puede ser de usod para estudiar las interacciones específicas entre las células tumorales y por ejemplo, las neuronas en este documento.
Durante la última década, intravital microscopía de dos fotones 7 se ha convertido en un estándar de oro en los estudios neuro-oncología fundamentales y ensayos preclínicos 8,9 por su capacidad para llevar a cabo la observación profunda intravital de cerebro de ratón (> 500 m por debajo de la duramadre) con una resolución espacial micrométrica 10. Uso de intravital microscopía de dos fotones con modelos animales orthotopical implantados con una ventana craneal crónica 11, es posible seguir la progresión del tumor con el tiempo en el mismo 9,12 ratón.
Uno de los principales inconvenientes de estos modelos animales publicados anteriormente es sin embargo que no imitan las limitaciones físicas que gobiernan el crecimiento del tumor como la duramadre no se sella después de la inyección de la suspensión celular 9,13,14. Células de glioma pueden tener fugas en elespacio extradural transformar un modelo de glioma ortotópico en uno heterotópico.
El modelo animal presentado aquí consiste en la inyección de un esferoide de células de glioma fluorescentes en la corteza cerebral a una profundidad de 200 micras seguido por el sellado de la duramadre con un gel de dextrano hemi-Bead reticulado y pegamento compatible con histo . El crecimiento del tumor se limita entonces a la parénquima cerebral que mantiene las limitaciones físicas fisiopatológicos. Una ventana de cristal crónica implantados por encima del tumor permite un acceso óptico fácil para intravital microscopía de dos fotones. El uso de animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés que es posible realizar un seguimiento de el crecimiento del glioma en el tiempo y para estudiar su interacción con su microambiente (aquí con las neuronas y la vasculatura resaltados con dextranos fluorescentes).
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y en cumplimiento de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La investigación en animales ha sido autorizada por la Dirección Départementale des Servicios Veterinarios des Bouches-du-Rhône (licencia D-13-055-21) y aprobado por el comité ético de Provence Côte d'Azur n ° 14 (Proyecto 87-04122012) .
1. Preparación Esferoides
- Preparación de los platos de agarosa recubiertas de Petri
- Mezclar 1 g de agarosa con 100 ml de medio de cultivo celular no suplementado con suero bovino fetal. Utilice un horno de microondas (850 vatios durante 40 segundos, a continuación, 3 x 15 seg, y mezclar la solución entre cada sesión de microondas) a hervir la solución y para disolver completamente la agarosa. Autoclave esta solución de agarosa al 1% durante 20 min a 120 ° C para asegurar Steri. dad Nota: Tenga cuidado para disolver completamente la agarosa antes de que el protocolo de autoclave. Falta de homogeneidad puede comprometer la formación de esferoides.
- Una vez recuperado de la autoclave, se vierten 10 ml de la solución de agarosa al 1% en 100 x 20 mm placas de Petri. Deje la placas Petri 20 min a temperatura ambiente para permitir la solución de agarosa al 1% que se solidifique.
- Añadir 10 ml de PBS por encima de la agarosa para mantener la humedad. Sellar la tapa de los platos de agarosa recubiertas de Petri envolviéndolos con parafilm para evitar la evaporación. Cajas de Petri se pueden almacenar durante un máximo de 2 meses a 4 ° C si humedecido adecuadamente por la capa de PBS.
- Cultura esferoide
- En un frasco, la cultura 75 cm 2 las células de glioma en su medio recomendado como una monocapa.
- Sustituir el PBS de uno de los 1% de agarosa recubiertas de placa de Petri por 1,5 ml de "medio preacondicionado" recogidos desde el matraz que contiene la monocapa celular de glioma de 2Ds.
- Retire el medio del matraz que contenía la monocapa 2D de células de glioma.
- Enjuague suavemente la monocapa con 10 ml de PBS.
- Añadir 2 ml de 0,05% de una solución de tripsina / EDTA y se incuba el matraz de 4 min a 37 ° C. Nota: El tiempo de incubación puede variar de acuerdo con la línea celular utilizada.
- Añadir 8 ml de medio de cultivo para detener la acción de la tripsina, lave suavemente la suspensión celular Nota:. Tenga cuidado de no eliminar el aire en la suspensión de células a medida que aumenta la muerte celular.
- Ponga 6 ml de la suspensión celular en un vial estéril.
- Centrifugar el vial de 4 min a 800 rpm.
- Eliminar el sobrenadante y suavemente de suspender el sedimento celular en 3 ml de medio de cultivo.
- Sembrar la suspensión de células en la placa de Petri de agarosa recubiertas de preparado.
- Poner la placa de Petri a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 durante 2 a 3 días hasta que se forman esferoides de diámetro deseado.
2. Esferoide y ventana de implantación
- Preparación del sistema de inyección
- Capilares de vidrio limpio (1 mm de diámetro) por sonicación en etanol al 70% durante 10 min. Enjuague dos veces con agua antes de colocar dentro de una incubadora hasta que se seque.
- Tire de varios capilares de vidrio limpios con un extractor de pipeta con el fin de preparar un pequeño stock.
- Romper la punta del capilar tirado por rascado la extremidad en un trozo de papel de seda para obtener un extremo biselado del tamaño deseado: típicamente un diámetro externo de 300-350 micras y un diámetro interno de 250-300 micras. Durante este proceso de conformación, controlar el diámetro del capilar usando un macroscopio cuya ocular está equipado con una mira graduada.
- Conectar el extremo no biselado del capilar a un colector de 3 vías usando un pedazo de tubo de plástico cuyo diámetro interior se ajusta al diámetro exterior del capilar.
- Usando tubin plásticog, conecte las otras dos formas del colector a un 25 l microjeringa y para una jeringa de 1 ml cargado con aceite mineral con capacidad para un histo.
- Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre la jeringa de microlitro y la jeringa de 1 ml. Eliminar el pistón de la jeringa de microlitro e inyectar aceite mineral hacia atrás en la jeringa de microlitro hasta que se escapa por empujar el pistón de la jeringa de 1 ml. Vuelva a colocar el émbolo de la jeringa de microlitro, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo.
- Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre el capilar y la jeringa de 1 ml. Llene el capilar con aceite mineral hasta que se escapan de la punta, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo.
- Ajuste el selector de colector para establecer una conexión entre la jeringa de microlitro y el capilar. Expulsar aproximadamente 10 l de aceite mineral.
- Sumerja la punta capilar en solución de PBSy utilizando el medidor de la jeringa de microlitros, aspirar 5μl de PBS en el capilar. Tenga en cuenta que el menisco entre el aceite y PBS es claramente visible.
- Fijar el capilar en un ajuste bajo la macroscopio cirugía micromanipulador 3 ejes. Este sistema se puede usar para dirigir el capilar para el sitio de la inyección bajo control visual.
- Implantación del esferoide
- Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en el aire durante 1 a 1,5 min).
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Tenga en cuenta que la anestesia a menudo reduce la temperatura del cuerpo del animal. Se recomienda proceder con la cirugía en una habitación a 26 º C y para mantener al animal caliente con una almohadilla térmica termolaminado subyacente.
- Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
- Afeitar el cuero cabelludo del animal.
- Lugarel animal en un marco estereotáctico usando barras de oído y una boquilla.
- Limpiar la piel con povidona yodada (3% de jabón, a continuación, solución al 10%).
- Hacer un 1 cm de largo incisión longitudinalmente en el centro del cuero cabelludo con un escalpelo. Con una tijera cortar y quitar la piel encima de los huesos parietales.
- Con una hoja de bisturí eliminar suavemente el periostio encima del cráneo. Aplicar generosamente cianoacrilato en la parte superior del hueso de generar una superficie rugosa para la adhesión posterior de cemento.
- Perforar el hueso parietal bajo un macroscopio quirúrgica para generar una craneotomía de 4 mm de diámetro. Añadir generosamente PBS enfriado con hielo que contiene penicilina (1000 U / ml) y estreptomicina (1 mg / ml) durante todo el procedimiento para evitar el calentamiento. Quite los pequeños fragmentos de hueso con una pinza y una gasa estéril húmeda. Tenga cuidado para perforar al menos 1 mm de distancia de las suturas craneales parietales para evitar hemorragias.
- Thin hueso en el borde de la craneotomía en la que se selló la ventana de cristal. Objetivo es esegurar más tarde de posicionamiento plano de la ventana de vidrio con superficie de contacto máxima entre el cerebro y el vidrio. Retire lentamente el hueso utilizando una pinza y limpie la duramadre expuesta con la solución de PBS.
- Tome un cubreobjetos de cristal redonda de 5 mm de diámetro, límpielo con alcohol y secarla con papel de seda. Trate de usar el cubreobjetos como una tapa para la craneotomía y confirmar que una gran superficie plana del cerebro entra en contacto con el vidrio. Si es necesario quitar el cubre a más delgado que los huesos laterales. Continúe hasta que el cerebro puede quedar apretado plano, si la aplicación de una suave presión sobre el portaobjetos una vez en su lugar.
- Limpie nuevamente el cubreobjetos con alcohol, séquela con un pañuelo de papel y guárdelo aparte.
- Con una aguja de calibre 26 hacer un orificio en la duramadre en el centro de la craneotomía pero evitando principales vasos sanguíneos. Asegúrese de no dañar el parénquima cerebral como el propósito de este paso es sólo para abrir la duramadre.
- Limpie suavemente la wi duramadreth solución PBS para eliminar la sangre hemorrágica. Cubrir con un trozo de papel de seda mientras se prepara la inyección de esferoide.
- Con el sistema de inyección de esferoide preparado en la etapa 2.1, chupar un esferoide ronda de montar el diámetro interno capilar (aproximadamente 200-250 micras) de la placa de Petri preparado en la etapa 1.2. Esferoide debe venir junto con aproximadamente 5 l de medio de cultivo. Se debe caer hacia abajo a la punta de la capilaridad en virtud de su peso.
- Retire el papel de tejido húmedo se utiliza para cubrir la craneotomía y coloque el animal en el sistema de inyección.
- Baje la pipeta de inyección hasta que toque el orificio hecho en la duramadre. Luego, baje de nuevo por 250 micras. Espere 30 seg.
- Inyecte lentamente el esferoide con el émbolo de la jeringa de microlitro (2-3 l) mientras se bombea el exceso de líquido con un trozo de papel de seda. Espere 30 segundos y luego levante suavemente la pipeta de inyección por 50 m hacia la superficie. Espere 30 segundos y de nuevo REPEAt el procedimiento de elevación por pasos de 50 micras hasta la superficie. Tiempos de espera evita la extracción del esferoide que se adhieren a la pipeta.
- Confirmar la presencia de la esferoide en el cerebro utilizando un macroscopio de fluorescencia.
- Mezclar 100 a 300 micras de diámetro perlas de gel de dextrano reticulado con una solución de PBS en una placa de Petri. Espere 1 minuto y pescar algunos granos hidratados. Colóquelos en el hueso adyacente a la craneotomía.
- Bajo el control macroscópico, elegir una bola con un diámetro similar al tamaño de la abertura de duramadre. Cortar el cordón de gel de dextrano reticulado en dos mitades utilizando fórceps.
- Coloque cuidadosamente un dextrano gel hemi-grano entrecruzado en el agujero de la inyección con la cara convexa hacia el esferoide. Tenga cuidado de no eliminar el esferoide y presione suavemente hacia abajo hasta la frontera de la parte cóncava entrar en contacto con la duramadre que rodea.
- Ponga una gota de pegamento de cianoacrilato en un portaobjetos de vidrio; moje la punta de un palillo en el visualizadorp para tomar una pequeña cantidad de pegamento. Sellar rápidamente los bordes del gel de dextrano hemi-Bead reticulado a la duramadre adyacente por estampación pegamento alrededor. Tenga cuidado al realizar movimientos rápidos y precisos para evitar el pegado del dextrano gel hemi-grano entrecruzado con el palillo de dientes. Evite el exceso de pegamento que se puede propagar e impedir, si no prevenir de imágenes una vez seco. Espere 2 minutos para que el pegamento se seque y luego limpiar la craneotomía y el hueso circundante con solución de PBS.
- Implantación ventana
- Ponga el diámetro 5 mm ronda cubreobjetos encima de la craneotomía (véase 2.2.12). Los bordes del cubreobjetos deben estar en el cráneo adelgazada en el exterior de la craneotomía. El cubreobjetos debe estar en contacto con la duramadre y el hueso adelgazado en los bordes. Es muy importante tener un contacto directo entre la duramadre y el cubreobjetos de vidrio de otro modo el tejido cicatrizal puede desarrollar e impiden la claridad óptica.
- Con un pañuelo de papel, absorber el PBS en thbordes e cubreobjetos de modo que la solución no cubre totalmente la craneotomía al aplicar una pequeña presión en el centro del cubreobjetos. Esto asegurará que el hueso, el vidrio y el cerebro se pegan juntos en el lado de la región de interés.
- Mantener una pequeña presión en el centro del cubreobjetos con un fórceps mientras se aplica suavemente cianoacrilato en la frontera entre el hueso y el cubreobjetos. El pegamento se extendió de forma espontánea hasta que la interfaz con solución de PBS. Solución actuará como una barrera debido a la hidrofobicidad de la cola. Sellado debe ser efectiva en menos de un minuto, pero tomar un extremo cuidado de no mover el cubreobjetos hasta que esté arreglado. Esto sería lo contrario provocar fugas de cianoacrilato en la duramadre, por tanto llevar a un fracaso de la cirugía.
- En caso de que el pegamento se habría extendido en la parte superior de la copa, y eliminar el uso de una cuchilla de micro-bisturí haciendo movimientos en espiral, ya que de lo contrario puede reducir la claridad óptica. Tenga cuidado de no romper el cubreobjetos During el procedimiento debido a la presión excesiva.
- Consolidar la fijación de vidrio mediante la aplicación de cemento dental en los bordes del cubreobjetos hacia el cráneo adyacente. Asegúrese de cubrir todo el cráneo expuesto hasta el cuero cabelludo. El uso de cemento extra, construir paredes laterales alrededor del cubreobjetos para crear el grupo necesario para la inmersión del objetivo. El cemento dental se cura en menos de 10 min.
3. Cuidados postoperatorios y Preparación de la Imagen
- El cuidado post-operatorio
- Retire el ratón del marco estereotáctico, inyecte Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre las regiones pélvicas y su sentar en una jaula con un pañuelo de papel-nido cálido.
- Monitorear el animal hasta que los efectos de la anestesia hayan desaparecido. En general de 2 a 3 horas después de la cirugía, los ratones son totalmente móviles. Asegúrese de que el animal tiene un fácil acceso a los alimentos y el agua. Proporcionar al animal con agarosa que contiene glucosa (agarosa3%, glucosa 3%).
- Monitorear el peso de los animales todos los días y se inyecta Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc por primera 10d después de la cirugía. Por razones éticas, la eutanasia a los ratones cuando la pérdida supera el 15% de su peso original. La presión intracraneal se incrementa con el tamaño del tumor que lleva a deficiencias motoras para el animal. Esta es la línea de células tumorales dependientes y se produce a diversos retrasos después de la cirugía. Especial cuidado se debe tomar para caracterizar el punto final del experimento con la línea celular utilizada.
- Preparación para la formación de imágenes
- Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en aire durante 1 a 1,5 min).
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal anestesia permite típicamente 45 minutos de observación. Para llevar a cabo sesiones de formación de imágenes más largos, el ratón se coloca debajo de la inhalación continua de isoflurano enaire (0,25-0,75%).
- Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
- Ponga el animal en un marco estereotáctico y bloquear el cráneo con los earbars.
- Para visualizar los vasos sanguíneos, un colorante fluorescente puede ser inyectado por vía intravenosa.
- Si la ventana se ve sucio, se puede limpiar suavemente quitando los escombros con una hoja delgada y la esquina de un pañuelo de papel. No utilice alcohol para limpiar la ventana, ya que no siempre es compatible con el cemento dental y puede enfriar el cerebro por debajo de la ventana.
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Resultados
Una vez que el protocolo quirúrgico se lleva a cabo (Figura 1), los animales pueden ser observados por medio de microscopía fluorescente sobre semanas hasta el sacrificio. Una reacción inflamatoria puede ser observada después de la cirugía que desaparece en una o dos semanas. El crecimiento del tumor se puede observar por diversas técnicas de microscopía incluyendo macroscopía fluorescente y microscopía de dos fotones (Figura 2). Imágenes de ejemplo representadas aquí se realizaron en u...
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Discusión
Este enfoque permite el uso de métodos de formación de imágenes ópticas para supervisar más de días y semanas el crecimiento de un glioma de ortotópicamente implantado. El mismo animal, posteriormente, puede ser sometido a prácticamente cualquier modalidad de formación de imágenes del cerebro durante el curso de la patología; sin embargo, la preparación específica microscopía de dos fotones ofrece la oportunidad única de conseguir una resolución subcelular dentro del cerebro del animal vivo. Nuestro protocolo presenta l...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen calurosamente al Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber y A. Jaouen útil para los debates; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, el personal del Bioterio del IBDML y el personal de la plataforma de imágenes PicSIL en IBDML para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) para FD, por becas de la Federación de la Recherche Médicale y Cancéropole PACA a CR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Taladro | Dremel (Alemania) | 398 | cualquier taladro de hueso quirúrgico de alta calidad sería suficiente |
| Taladro Fresa (# 1/4 Fresa redonda de carburo) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 501860 (# 1/4) | también vendido por Harvard Apparatus |
| Tijeras de tejido World | Precision Instruments (EE. UU.) | 14395 | |
| Pinzas Dumont M5S | World Precision Instruments (EE. UU.) | 501764 | |
| Cemento dental | GACD (EE. UU.) | 12-565 y 12-568 | |
| Cianoacrilato | Eleco-EFD (Francia) | Cyanolit 201 | |
| Capilares de vidrio sin filamento | Clark Electromedical Instruments (Reino Unido) | GC100-15 | |
| Jeringa de microlitros (25 & micro; l) | Hamilton (EE. UU.) | 702 | |
| Micromanipulador | World Precision Instruments (EE. UU.) | Derivación de cometa R | |
| (llave de paso de 3 vías - bloqueo Luer) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 14035-10 | |
| Marco estereotáctico (adaptador de ratón) | World Precision Instruments (EE. UU.) | 502063 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Warner Instruments (EE. UU.) | CS-5R (64-0700) | |
| Gel de dextrano reticulado (Sephadex) G50 Grueso 100-300 µ m perlas | Disponible de varios proveedores, entre ellos Sigma (Alemania) | ||
| Pomada para los ojos | TVM (Francia) | Ocry-gel | |
| Microscopio de fluorescencia | Leica MZFLIII (Alemania) | también vendido por otras empresas | |
| Microscopio de dos fotones | Zeiss LSM 7MP (Alemania) | también vendido por otras empresas (Nikon, …) | |
| Láser infrarrojo de femtosegundo sintonizable (Maï-Taï) | Spectra Physics (EE.UU.) | también vendido por otras empresas |
Referencias
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