FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

Summary

Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

Abstract

En la era de la biología computacional, nuevos sistemas experimentales de alto rendimiento son necesarios con el fin de poblar y refinar los modelos para que puedan ser validados para fines predictivos. Idealmente estos sistemas serían bajo volumen, que se opone a los análisis de muestreo y destructivas cuando los datos de curso de tiempo se han de obtener. Lo que se necesita es una herramienta de supervisión in situ en la que puede reportar la información necesaria en tiempo real y de forma no invasiva. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de concentraciones intracelulares a base de proteínas. Una clase particular de in vivo biosensores que ha encontrado aplicaciones en la cuantificación metabolito se basa en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular, que tienen tiempos de respuesta rápidos y su cha espectralrísticas cambios de acuerdo a la concentración del metabolito dentro de la célula. En este documento, se describe el método para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS para la glucosa y la glutamina y la calibración de los FIBS in vivo en cultivo celular por lotes con el fin de permitir que el futuro cuantificación de la concentración de metabolito intracelular. Los datos de fed-batch cultivos de células CHO demuestra que los FIBS fue capaz en cada caso para detectar el cambio resultante en la concentración intracelular. Uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la concentración intracelular se determinó con precisión como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente.

Introduction

Monitoreo metabolito tiene diversas aplicaciones en el procesamiento biológico, incluyendo el desarrollo del proceso, los medios de comunicación y el diseño de alimentación, y la ingeniería metabólica. Varios métodos están disponibles para las mediciones de concentración a través de la utilización de ¹ enzimática, química ^2, o ensayos de unión ^3. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de la concentración intracelular de metabolitos clave a base de proteínas. En los ensayos de volumen ultra bajo, la fluorescencia es una herramienta conveniente como la miniaturización realmente mejora la relación de ^{4,5-señal-ruido} y sensores basados ​​en proteínas puede ser codificado genéticamente el sentido de que no hay reactivos exógenos son necesarios para el análisis de metabolitos. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) biosensores consisten en dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET es una transferencia de energía no radiante de un donante fotoexcitado a un aceptor fluorescente molécula locat ed en estrecha proximidad (<100). La escisión ligando o unión provoca un cambio conformacional en el sensor, que, a su vez, induce un cambio en la proximidad de los fluoróforos, lo que lleva a un cambio en la eficiencia de FRET medido por el cambio en el espectro de emisión. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular y sus características espectrales cambian en función de la concentración del metabolito dentro de la célula. FIBS tienen tiempos de respuesta rápidos lo que es ideal para la toma de mediciones para los modelos dinámicos ^6. Aplicaciones anteriores incluyen el monitoreo individuales ^7-9 y múltiples ¹⁰ metabolitos y proporcionar datos sobre la distribución espacio-temporal ^11. FIBS se pueden crear en dos configuraciones: Apo-Max, donde la unión del ligando altera la proximidad de los fluoróforos bajada de transferencia de energía y Apo-Min, donde la unión del ligando trae los dos fluoróforos en contacto más estrecho (Figura 1).

_content "> En este trabajo, se presenta un protocolo para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS de un metabolito, glucosa o glutamina. Se establece una metodología para la calibración del sensor in vivo para permitir el futuro cuantitativa mediciones de la concentración de metabolito intracelular, tal como se presenta en la Figura 2. Sobre la base de esto, la concentración intracelular de glucosa o glutamina pueden determinarse en discontinuos alimentados cultivos de células CHO, al que se añadieron los dos nutrientes en altas concentraciones en-proceso. Los resultados demuestran que el uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la predicción precisa de la concentración intracelular es posible, como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre tecnologías analíticas actuales, ya que no es invasiva y de bajo costo y rápido, dando una señal en tiempo real de los FIBS que pueden ser lunmonitoriza todo el cultivo.

Protocol

1. Línea Celular Revival y mantenimiento

1. Revive células CHO en 9 ml de medio de CD-CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina y ml / L de suplemento de hipoxantina 100x / timidina 10 (medio de crecimiento completo).
2. Se centrifuga a 100 × g durante 5 min.
3. Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento completo fresco.
4. Extraiga una muestra de 1 ml y determinar la concentración de células viables mediante microscopía óptica utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano en un hemocitómetro.
5. Iniciar un cultivo a una densidad de siembra de 3 x 10 ⁵ células / ml en 125 ml agitar frascos.
6. Mantener el cultivo en una incubadora a 37 ° C, una atmósfera humidificada de 5% de CO _2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 120 rpm.
7. Subcultura cada 3-4 días en el medio de crecimiento completo a una densidad de siembra de 2 x 10 ⁵ células / ml.

2. La transfección de la línea celular con el plásmido Containing el biosensor Gene

1. Preparar ADN plásmido usando un kit de purificación de plásmido a gran escala.
2. Mantener las células en las condiciones apropiadas (37 ° C, 5% de CO ₂₎ 12-24 h antes de la transfección para asegurar las células se están dividiendo activamente en el momento de la transfección.
3. Contar las células usando el método de exclusión del colorante azul de tripano, y luego preparar un volumen de trabajo de 20 ml de cultivo de células en un matraz de agitación de 125 ml a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml.
4. Utilice un kit de transfección adecuado para la línea celular en uso. El ADN plásmido relación de reactivos de transfección a será dependiente de la línea celular y el vector. Se recomienda que este se optimiza mediante pruebas de un intervalo de relaciones dentro del rango especificado por el fabricante antes de realizar las transfecciones finales. También mantener al menos un cultivo de control negativo que contiene las células, pero sin ADN.
5. Incubar durante 4 días en modo estático y luego transferir a una Shaking plataforma que gira a 125 rpm.
6. Añadir el antibiótico apropiado para la selección del plásmido a una concentración adecuada como se determina por una curva de muerte. En este estudio, se añadió zeocina a una concentración final de 400 g / ml para la selección de las células transfectadas.
7. Cambie los medios en un intervalo de tiempo apropiado para la línea celular, añadiendo antibióticos cada vez, hasta que las células en el control así han muerto.
8. Utilice los pozos más confluentes de progresar a temblar culturas.
9. Establecer un banco de células mediante la congelación de las células en viales criogénicos que contienen 10 ⁷ células viables en 1 ml de mezcla de congelación. En este trabajo, esta consiste en medio de crecimiento 92,5% y 7,5% de sulfóxido de dimetilo.

3. Lote y Fed-batch Curva de Crecimiento Celular

1. Siga las instrucciones para el mantenimiento de células arriba para establecer cultivos de células por triplicado de las células CHO transfectadas en 250 ml de matraces de agitación con un volumen de trabajo de 50 ml.
2. Mantener la cultures en un incubador humidificado de células a 37 ° C, con 5% de CO _2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 125 rpm, y retirar 4,1 ml muestras de cada cultivo en crecimiento a intervalos de 24 hr.
3. Utilice 100 l de la muestra para determinar la concentración celular y la viabilidad celular viable con el método de exclusión del colorante azul de tripano.
4. Repetir hasta que la concentración de células viables se reduce a cero.
5. Repetir para los cultivos de células de alimentación por lotes se completa con la cantidad apropiada de glucosa o glutamina en el día 6 para restaurar sus concentraciones a sus valores iniciales de 36 mM y 4 mM, respectivamente. Se recomienda que también se mantienen los cultivos de control adicional, que han de ser alimentados con el mismo volumen (12 ml en este caso) de agua pura.

4. FRET mediciones de la relación

1. Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C.
2. Resuspfinalizado el pellet de células en 2 ml de hielo frío tampón fosfato salino (PBS). Transfiera esta en una placa de 6 pocillos y añadir una muestra en blanco que no contiene células a un pocillo.
3. Medir los niveles de fluorescencia azul y amarillo de inmediato a una longitud de onda de excitación de 430/435 nm y de emisión de longitudes de onda de 465/435 nm (azul) y 520/510 nm (amarillo).
4. Calcular los ratios de FRET (relación de fluorescencia amarilla detectado más de fluorescencia azul detectada).

5. Metabolito Ensayos

1. Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
2. Resuspender el sedimento celular en 3 ml de PBS enfriado en hielo y se centrifuga de nuevo a 100 xg durante 5 min.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 3 ml PBS helado que el anterior. Sonicar el 5x muestra durante 3 minutos cada uno en un pulso de 15 segundos encendido y 15 segundos apagado. En este punto, la celda adicionalcts pueden congelarse si se desea.
4. Utilice un kit de ensayo de glucosa adecuado, según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración intracelular de glucosa (ver tabla de materiales).
   Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-100 mM.
5. El uso de las lecturas de las normas, construir la curva patrón y encontrar la ecuación lineal de mejor ajuste (en este caso: y = 1310.51x - 723,43 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa).
6. Cálculo de las concentraciones de glucosa utilizando la curva estándar y teniendo en cuenta la dilución. La concentración intracelular de la glucosa puede entonces ser calculado utilizando la siguiente ecuación:
   
   Para las células CHO, el volumen de una sola célula se calculó utilizando un diámetro de célula de 12 M ¹²
7. Utilice un kit de ensayo de glutamina adecuada según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración de glutamina intracelular (ver tabla de materiales).
   Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-2 mM.
8. Como en 5.5 anteriormente, construir la curva de calibración (en este caso y = 203.1x + 17,1 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa)
9. Utilizando la curva estándar, calcular la concentración de glutamina de las muestras, teniendo en cuenta la dilución. La concentración de glutamina intracelular se puede calcular utilizando la Ecuación 1 anterior.

Results

Una visión general de la metodología se presenta en la Figura 2. En el trabajo presentado en este documento, las células CHO fueron transfectadas con el vector de FIBS y líneas celulares estables se seleccionaron a una presión de antibiótico de 400 mg / ml de zeocina. Por lo tanto, se crearon dos líneas celulares estables que expresan constitutivamente separados los sensores de glucosa y glutamina. Figura 1 representa las configuraciones de los dos biosensores utilizados en este estudio...

Discussion

Los FIBS permiten in vivo y en la cuantificación in situ de moléculas clave, en este caso nutrientes limitantes del crecimiento, la eliminación de incertidumbres derivadas de temple y métodos de extracción. Los hallazgos sugieren que existe una buena correlación entre la señal FIBS y las concentraciones intracelulares en el rango de 1-5 mm para la glucosa y 0,3-2 mM de glutamina. En el lote de cultivo de células CHO, estas concentraciones se encuentran en las fases de declive exponencial, esta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	variará en función de los objetivos del estudio:
vector pCDNA4/TO	Life Tecnologies
TransIT-PRO Reactivo de transfección	Mirus Bio	MIR 5700	Las transfecciones se pueden realizar utilizando cualquier método adecuado para la línea celular en estudio
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	El medio de crecimiento celular depende de las células en estudio
100x HT Supplement	Life Tecnologías	11067-030
L-Glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Lector de placas InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Cualquier lector de placas de fluorescencia de 96 pocillos que pueda acceder a las longitudes de onda requeridas puede ser sustituido
Filtros para lector de placas	Tecan	30000463
Maxiprep Kit de purificación de plásmidos	Qiagen	12163	Cualquier kit adecuado puede ser sustituido por
Amplex Red kit de ensayo de glucosa/glucosa oxidasa	Invitrogen	A22189	Cualquier kit adecuado puede ser sustituido
por EnzyChrom  Kit de ensayo de glutamina Sistemas	de ensayo BioAssay	EOAC-100	Cualquier kit adecuado puede ser sustituido
por Hemocitómetro Neubauer mejorado	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubadora	Nuaire	NU-5510E