La evaluación de Liquidación fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular experimental por ligables Fluorescent Probes

Resumen

Se presenta una nueva técnica de fluorescencia para selectivo etiquetado in situ de las células fagocitarias activas, que claro off cadáveres de células en el accidente cerebrovascular. El enfoque es importante para evaluar la reacción del cerebro a la isquemia debido a que sólo una pequeña proporción de los fagocitos presentes en el cerebro isquémico participar en el aclaramiento de la muerte celular.

Resumen

Se describe un nuevo método histoquímico para la visualización del despacho fagocítica en la isquemia cerebral focal. El enfoque permite el estudio de la eliminación de las células muertas en el accidente cerebrovascular por los fagocitos de gestión de residuos de cualquier linaje celular. Aunque numerosas células de diferentes orígenes que son capaces de fagocitosis están presentes en el cerebro isquémico, sólo una parte de ellos engullir activamente y digerir cadáveres de células. La visualización selectiva, cuantificación y análisis de dicha gestión de residuos activa fagocítica son útiles en la evaluación de la respuesta cerebral a la isquemia. Despacho eficiente la muerte celular es importante para la recuperación de la lesión isquémica cerebral, ya que abre el camino para que los procesos de regeneración posteriores. La falta de limpieza de los cadáveres daría lugar a una reacción tóxica causada por el ADN no degradado y proteínas. El procedimiento descrito utiliza sondas fluorescentes ligadas selectivamente por una topoisomerasa viral a roturas en el ADN característicos producidos en todos los fagocitos durante la inmersióny la digestión de las células irreversiblemente dañado por la isquemia. El método es una nueva herramienta para la investigación de la reacción del cerebro a la lesión isquémica.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico induce cambios profundos en el tejido cerebral afectado. Se inicia la muerte celular masiva, que conduce a la rápida activación de las células fagocíticas residentes de origen microglial. También pone en marcha la infiltración de cerebro isquémico por varios tipos de fagocitos profesionales derivadas de la sangre incluyendo neutrófilos, macrófagos, dendríticas, y mastocitos ^1,2.

Todavía se debate si esta respuesta a la lesión isquémica desempeña un positivo o un papel negativo. Aunque la fagocitosis después del accidente cerebrovascular puede ser beneficioso, ya que borra las células muert....

Protocolo

El método es adecuado para, embebidos en parafina secciones de tejido fijadas con formaldehído. La técnica se demuestra aquí en su aplicación para el accidente cerebrovascular experimental en rata.

1. Componentes Preparación para tiramida amplificación de señal (TSA) Sistema

Aunque la mejora basada en la TSA se utiliza en la etapa final de etiquetado, la preparación para esta reacción puede tomar más de 1 hora. Por lo tanto es conveniente para hacer los reactivos TSA antes de iniciar el etiquetado.

1. Hacer tiramida fluoróforo solución madre. Utilice el reactivo tiramida fluoróforo en viales individual....

Resultados

El principio de la técnica para el etiquetado de los fagocitos de gestión de residuos activos se presenta en la Figura 1. El esquema demuestra que el producto de detección en tres pasos. La primera etapa comprende la activación de la sonda (Figura 1A); en el segundo paso la sonda activado se ligó a roturas en el ADN específicas en las secciones de tejido (Figura 1C); la tercera etapa incluye la amplificación de la señal fluorescente (Figura 1D). En una .......

Discusión

En este video se demuestra, en el formato de la sección de tejido, como etiquetar los fagocitos activos que clara la muerte celular en la isquemia cerebral focal. La técnica presentada es el primer enfoque que marca específicamente sólo las células de gestión de residuos, que han afectado y digerir activamente cadáveres celulares. Esto hace que sea ventajoso con respecto a otros métodos existentes para el etiquetado de las células fagocíticas, que no tienen esta capacidad.

El método utiliza .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Xileno	JT Baker	9490-22
etanol
proteinasa K	Roche	3115879001
PBS tampón	Invitrogen	AM9624
Vaccinia topoisomerasa I	Vivid Technologies		5 pmol/μ l stock
12-Base Overvoladizo Suicidio Oligonucleótido	IDT ADN		5'-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B – Biotina-dT; 100 pmol/μ l stock en ddH2O
Adaptador Oligonucleótido	IDT DNA		5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l stock en ddH2O
1 M Tris-HCl, PH 7.4	Lonza	51237
TSA, Sistema de fluoresceína	PerkinElmer
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Vectashield con	Vector Laboratories	H-1200
cubreobjetos			vidrio o plástico de 22 x 22 mm o 22 x 40 mm. Los cubreobjetos de plástico son preferibles durante la reacción, ya que son más fáciles de quitar de la sección.
Secciones de cerebro			de rata tomado 48 horas después de la reproducción de un accidente cerebrovascular isquémico como se describe en Didenko et al11. 5-6 μ Secciones de m-THICK cortadas a partir de bloques de tejido fijados en paraformaldehído e incluidos en parafina. Utilice portaobjetos cargados y previamente limpios.
Microscopio invertido	Olympus
y software	Micromax
Software	Metamorph

NEL701A001KT cubreobjetos DAPI de de rata Cerebro Cámara de vídeo digital