Se describen procedimientos para cromatografía en capa fina (TLC) separación de extractos de plantas y el contacto bioautografía para identificar metabolitos antibacterianos. Los métodos se aplican a la selección de compuestos fenólicos de trébol rojo que inhiben las bacterias productoras de amoniaco hiper (HAB) nativas para el rumen bovino.
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Artículo de método
Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos
En este artículo
Resumen
Resumen
Una pantalla común para los compuestos antimicrobianos de plantas consiste en la separación de extractos de plantas por papel o cromatografía en capa fina (PC o TLC), la exposición de los cromatogramas a las suspensiones microbianas (por ejemplo hongos o bacterias en caldo o agar), dejando tiempo para que los microbios para crecer en un ambiente húmedo, y la visualización de zonas sin crecimiento microbiano. La eficacia de este método de detección, conocido como bioautografía, depende tanto de la calidad de la separación cromatográfica y el cuidado con las condiciones de cultivo microbianos. Este artículo describe los protocolos estándar para TLC y el contacto bioautografía con una novedosa aplicación a los amino ácidos bacterias que fermentan. El extracto se separa en (aluminio con respaldo) placas de TLC de sílice flexibles, y las bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta (UV). Las zonas se cortaron y se incubaron boca abajo en agar inoculado con el microorganismo de ensayo. Bandas inhibidoras se visualizaron por tinción de la placa de agars con tetrazolio rojo. El método se aplica a la separación de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) compuestos fenólicos y su programación para la actividad contra Clostridium sticklandii, una bacteria productora de amoníaco hiper (HAB) que es nativa al rumen bovino. Los métodos de TLC se aplican a muchos tipos de extractos de plantas y otras especies bacterianas (aeróbicas o anaeróbicas), así como hongos, pueden ser utilizados como organismos de prueba si las condiciones de cultivo se modifican para adaptarse a los requisitos de crecimiento de las especies.
Introducción
El ensayo para compuestos antimicrobianos en las plantas requiere la separación de los componentes de un extracto de la planta, la exposición de un microorganismo de ensayo a los componentes, y la determinación de si el crecimiento del microorganismo es inhibido por cualquiera de los compuestos. Separaciones por papel o la cromatografía en capa fina (PC o TLC) son convenientes porque muchos compuestos pueden ser separados en una superficie plana. La separación se basa en la polaridad, con algunos compuestos que se unen fuertemente al adsorbente (celulosa en el caso de la PC, y una variedad de adsorbentes en el caso de TLC) y la migración de menos que otros 1.
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Protocolo
1. Preparación del extracto de la planta
- Ver Kagan y Flythe 10 para la extracción de compuestos fenólicos de cv Trifolium pratense. Kenland.
- Para extraer otros compuestos en otras plantas, comprobar la literatura análisis fitoquímico para los métodos de extracción de plantas-o-metabolitos específicos (muchos se describen), o buscar protocolos tales como los de Khurram et al. 7,8 que aíslan muchos compuestos con una amplia gama de polaridades.
2. Preparación de las placas de capa fina
- Limpiar las placas de TLC mediante el desarrollo en uno o más disolventes polar....
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Resultados
Representante separaciones TLC de sílice de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) extractos, que contienen compuestos fenólicos, se muestran en la Figura 2. Separación de extracto de trébol rojo en acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), más de 8,5 cm, dio lugar a cinco bandas, una forma incompleta resuelto desde el origen (Figura 2A). Sin embargo, la Figura 2B demuestra que alrededor del doble de las bandas fueron reveladas cuando una muestra diferente de.......
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Discusión
Este protocolo describe un método sencillo para la separación de un extracto en subconjuntos de compuestos y ensayando esos subconjuntos por contacto bioautografía. El método es bastante similar a uno utilizado por Chomnawang et al. 15 para la detección de metabolitos vegetales inhibitorios para las bacterias que causan la gonorrea. El tipo de bioautografía empleado para la detección de compuestos antimicrobianos de plantas depende de muchos factores, incluyendo el microorganismo de ensayo, la config.......
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Divulgaciones
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en el artículo es el único fin de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el USDA. Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias al difunto Dr. Norma Taylor, Dept. Vegetal y Edafología de la Universidad de Kentucky, por permitirnos usar muestras de sus parcelas de trébol rojo para este estudio. Este proyecto fue financiado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sílice F254 Placas TLC, con respaldo de aluminio, 0,2 mm de espesor, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | Estas placas están recubiertas con sílice que contiene un indicador fluorescente a 254 nm. Los compuestos que se absorben en esa longitud de onda aparecen oscuros sobre un fondo verde fluorescente. Las fuentes alternativas incluyen Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Es posible que se necesiten adsorbentes distintos de la sílice. Las placas con respaldo de plástico pueden ser adecuadas, dependiendo de los solventes que se utilicen. |
| Tijeras afiladas y resistentes | cualquier empresa de suministros | de costura similar a Fiskars 175800-1002 | para cortar placas TLC. También se puede usar un cortador de papel con una cuchilla afilada. No inhale polvo de sílice. |
| Horno de secado a 100 & grados; C (convección mecánica) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc., Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| Cámara TLC | Kimble Chase | 416180-0000 | Fuentes alternativas: Aldrich. Los vasos de precipitados o tarros de conserva Pyrex se pueden utilizar para platos pequeños (por ejemplo, de 5 cm x 10 cm). Cubra con papel de aluminio (las tapas de los frascos pueden contener material extraíble por vapores de solventes). |
| 50 y micro; l Jeringa con punta de aguja plana | Hamilton | 80965 | Para cargar cantidades de patrón o muestra superiores a 5-10 µl. Las fuentes alternativas son equivalentes. |
| Micropipetas | Drummond | 2-000-001 | Para cargar pequeñas cantidades de patrones o muestras. Fuentes alternativas: VWR. Además, las pipetas Pasteur se pueden estirar hasta un diámetro más delgado con un soplete de butano. |
| Papel de filtro (grado #1) | Whatman | 1001 917 | Sirve como mecha de cámara. Otros grados de papel de filtro están bien. Este tamaño se puede recortar para las cámaras que contienen placas de 20 cm x 20 cm. |
| Pinzas para vasos de precipitados | Fisher Scientific | 15-186 | Para colocar placas dentro y fuera de una cámara TLC grande. Fuentes alternativas: VWR |
| Pinzas de borde plano | Fisher Scientific | 10-275 | Para colocar placas dentro y fuera de una cámara pequeña. Fuentes alternativas: VWR |
| Pequeña lámpara UV portátil con bombillas de 4 W o 6 W para la iluminación con luz UV de onda corta y larga (254 y 365 nm, respectivamente) | Productos ultravioleta | 95-0271-01 | Fuentes alternativas: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Gabinete de visualización para uso con lámpara UV de mano | Productos ultravioleta | Chromato-Vue C-10E | Las bandas activas a los rayos UV se enmarcan más fácilmente en un círculo si las placas se pueden colocar aquí. Fuentes alternativas: Spectronics Corporation. |
| Sistema de fotodocumentación con lámpara UV de techo y lámpara visible | Kodak | Gel Logic 200 | Fuentes alternativas: Productos ultravioleta (www.uvp.com). Consulte el protocolo para la alternativa casera. |
| Cámara Anaeróbica, Tipo A, Vinilo | Coy | 7150000 | Esta cámara es apropiada para bacterias anaeróbicas, como Clostridium sticklandii, como se describe. Sin embargo, las condiciones de crecimiento deben adaptarse al organismo utilizado en el ensayo. Se debe tomar una cabina de bioseguridad y otras precauciones si se utilizan organismos patógenos. Fuentes alternativas: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, otros |
| Tetrazolio rojo | Sigma-Aldrich | T8877 | Fuentes alternativas: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | Para esto y para todos los demás reactivos de esta tabla, las fuentes alternativas son equivalentes. |
| Riboflavina | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Tiamina HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| D-Pantotenato de calcio | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Ácido lipoico | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| ácido p-aminobenzoico | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Ácido fólico | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamina | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Piridoxina | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Sulfato de hierro · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Sulfato de zinc · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Cloruro de manganeso · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cloruro de cobalto · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Cloruro de cobre · 2H2O | Sigma-Aldrich | ||
| Cloruro de níquel · 6H2 | O Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Molibdato de sodio · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Tripticasa (digestión pancreática de la caseína) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Fosfato de potasio monobásico anhidro | Thermo Fisher | P284 | |
| Carbonato de sodio · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Sulfato de magnesio · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Cloruro de calcio · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cisteína HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potasio fosfato dibásico anhidro | Thermo Fisher | P290 | |
| Cloruro de sodio | Thermo Fisher | BP358 |
Referencias
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
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Reimpresiones y permisos
