Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en snabb, billig strategi för noggranna masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik. Här visar vi en robust metod för beredning och analys av proteinblandningar med hjälp av redi strategi som kan tillämpas på nästan alla prov typ.
Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en metod att exakt kvantifiera proteinuttrycksskillnader mellan prover med masspektrometri. Redi märkning utförs med antingen vanlig (ljus) eller deutererade (tunga) former av formaldehyd och natriumcyanoborhydrid att lägga två metylgrupper till varje fri amin. Här visar vi en robust protokoll för redi märkning och kvantitativ jämförelse av komplexa proteinblandningar. Protein prover för jämförelse smälts in i peptider, märkt att bära antingen lätta eller tunga metyl-taggar, blandade, och co-analyseras av LC-MS/MS. Relativa protein abundances kvantifieras genom att jämföra jonkromatogram toppytorna för tunga och lätta märkta versioner av drifts peptiden extraheras från hela MS-spektra. Metoden som beskrivs här innefattar provberedning genom omvänd fas-fast fas-extraktion, i kolonnen Redi märkning av peptider, peptid fraktionering med basiskt pH reversed-fas (BPRP) kromatografi och StageTip peptidrening. Vi diskuterar fördelar och begränsningar med Redi märkning med avseende på andra metoder för stabila isotopen inkorporering. Vi belyser nya applikationer med hjälp Redi märkning som en snabb, billig och säker metod för att jämföra protein abundances i nästan alla typer av prov.
Att mäta koncentrationsskillnader av många proteiner mellan komplexa prover är en central utmaning i proteomik. Alltmer, detta görs genom att märka proteiner i varje prov med olika isotop-taggar, som kombinerar proverna, och med hjälp av masspektrometri för att kvantifiera skillnaderna koncentrations. Det finns flera metoder för stabil isotopisk märkning av proteiner och peptider. 15 N märkning 1 och SILAC 2 införa isotopmarkörer metaboliskt in vivo, medan ICAT 3, iTRAQ 4, och reduktion dimetylering 5 lägga stabila isotoptaggar efter proteinextraktion och matsmältning. Bland dessa metoder är reduktiv dimetylering (redi märkning) ökar i popularitet som en billig och reproducerbar metod för att kvantifiera proteinkoncentrations skillnader i nästan alla typer av prov.
Redi märkning involverar reagerande peptider med formaldehyd för att bilda en Schiffsk bas, som därefter reducerasav cyanoborhydrid. Denna reaktion dimethylates fria aminogrupper på N-terminalen och lysinsidokedjor och monomethylates N-terminal proliner. Protokollet som beskrivs här metylerar peptider i prov 1 med en "lätt" etikett med reagenser med väteatomer i sin naturliga utbredning isotop-och prov 2 med en "tung" etikett med deutererad formaldehyd och cyanborhydrid (figur 1). Varje dimetylerade aminogrupp på en peptid resulterar i en massa skillnad på 6,0377 Da mellan lätta och tunga former, som används för att skilja mellan de två formerna med hjälp av en masspektrometer. Närmare bestämt är de relativa peptid abundances kvantifierats som förhållandet MS1 extraherade jonkromatogram utrymmen (MS1 topparea-förhållande) av lätt och tung version för varje peptid jonpar. Den relativa förekomsten av ett protein beräknas som median MS1 toppareaförhållandet mellan alla peptider i proteinet. I denna rapport beskriver vi ett robust protokoll för uppförandeing Redi märkningsexperiment genom LC-MS/MS som inkluderar omvänd fas peptid fastfasextraktion, on-column Redi märkning, peptid fraktionering med basiskt pH med omvänd fas (BPRP) kromatografi och rening av peptidblandningar med användning StageTips (Figur 2) . Vi diskuterar fördelar och begränsningar med att använda Redi märkning av kvantitativa proteomik.
Flera punkter gör stabila isotopen märkning av peptider med hjälp av reduktiv dimetylering (redi märkning) en attraktiv metod för kvantitativ proteomik: billiga märkningsreagens (reagenser kostar mindre än $ 1 per prov), snabb reaktionshastighet (~ 10 min), frånvaro av sidoprodukter, hög reproducerbara (figurerna 3, 4), stabila reaktionsprodukter, förmåga att använda något proteas, och hög joniseringseffektivitet av märkta peptider. Kemisk märkning av Redi är också fördelaktigt i för…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |