Método in vitro para observar interacciones mediadas por E-selectina Entre próstata células tumorales circulantes derivadas de pacientes y las células endoteliales humanas

Resumen

Nuestro informe se describe un método único para visualizar y analizar las interacciones CTC / CE en el cáncer de próstata en condiciones de flujo fisiológico.

Resumen

La metástasis es un proceso en el que las células tumorales se desprenden de tumor intravasate vascular de la sangre primaria y el sistema linfático, de ese modo, obtener el acceso a la extravasación y formar un nicho secundaria. La extravasación de las células tumorales desde el sistema vascular de la sangre puede ser estudiada usando células endoteliales (ECs) y las células tumorales obtenidas a partir de diferentes líneas celulares. Se llevaron a cabo estudios iniciales usando condiciones estáticas, pero se ha documentado bien que los EC se comportan de manera diferente bajo condiciones de flujo fisiológico. Por lo tanto, los diferentes conjuntos de cámara de flujo actualmente se utilizan para el estudio de las interacciones celulares de cáncer con EC. Ensambles de cámara de flujo actuales ofrecen resultados reproducibles, ya sea utilizando diferentes líneas celulares o de líquido a diferentes condiciones de estrés de cizalla. Sin embargo, para observar y estudiar las interacciones con las células raras, como las células del tumor (CTCs) en circulación, se requieren ciertos cambios que deben introducirse en el conjunto de la cámara de flujo convencional. CTCsson una población de células raras entre millones de células sanguíneas. En consecuencia, es difícil obtener una población pura de CTC. La contaminación de las CTC con diferentes tipos de células que se encuentran normalmente en la circulación es inevitable el uso de presente de enriquecimiento o técnicas de agotamiento. En el presente informe se describe un método único para la etiqueta circular las células de cáncer de próstata con fluorescencia y estudiar sus interacciones con EC en un sistema de cámara de flujo auto-ensamblado. Esta técnica se puede aplicar además a observar las interacciones entre CTC próstata y cualquier proteína de interés.

Introducción

La metástasis es un proceso de múltiples pasos compleja que sigue siendo poco conocida. El eje ligando E-selectin/selectin se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral mediante la promoción de interacciones adhesivas primarias entre el endotelio vascular y células de cáncer de ^1,2. Endotelial (E)-selectina es una proteína transmembrana expresada por las células endoteliales activadas, mientras diferente ligando (s) de E-selectina se expresan por las células tumorales ^3. Numerosos enfoques in vitro se han empleado con éxito para modelar las interacciones de ligando E-selectin/selectin entre las células tum....

Protocolo

1. El cultivo de HUVEC microportaobjetos para Interacciones de Observación del CTC-endoteliales

1. Bajo la campana de cultivo de tejidos, primero enjuague el microportaobjetos, ancho de canal de 1 mm con PBS. Suavemente la capa MicroSlide con 200 l de 50 mg / ml de fibronectina (disuelto en PBS) usando una jeringa de cierre Luer de 1 ml.
2. Cubrir el MicroSlide con la tapa y mantenerlo dentro de la campana de cultivo de tejido durante 30 min. De dispensación lenta del líquido en el MicroSlide impide la formación de burbujas en el canal.
3. Perfundir 200 l de agua tibia (37 ° C) de HUVEC medio de crecimiento (medio M199, HEPES 1 M, 20% de FBS, 5 ....

Resultados

La figura 1 muestra un cultivo O / N de una monocapa de EC en la MicroSlide. Los batiduras en la Figura 1A muestra que el 100% de la MicroSlide es visible usando objetivo 5X mientras que el 70% es visible utilizando un objetivo de 10 aumentos (figura 1B). Para E-selectina mediada por las interacciones, las células de rodadura en los bordes no se consideran que hace más de 70% de la MicroSlide disponible para la grabación en vídeo y análisis de la reproducción. En nuestr.......

Discusión

Debido al bajo número de CTC entre las células de la sangre, es difícil aislar los CTC como una población pura de células. Con el fin de estudiar las interacciones CTC / CE, la población rara e impuro de los CTC plantea dos grandes retos: a) Identificación de los CTC entre las células de la sangre; b) Observación de las interacciones CTC / CE.

Para superar la primera limitación de la identificación de los CTC de próstata entre los glóbulos, tomamos ventaja del hec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microportaobjetos	Ibidi	80331
Fibronectina	Millipore	FC010
Tubo de plástico	Cole Parmer	EW-96115-08
Adaptador Luer macho	GlycoTech	31-001
Adaptador Luer hembra	GlycoTech	31-001
Bomba de jeringa	Chemyx Inc	Fusion 100
Jeringa Luer-lock	BD Biosciences	309628
M199 medio	Sigma	M7653
Mitógeno endotelial	Tecnologías biomédicas	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Laboratorio de Oncología
Interleucina-1 beta	Peprotech	200-01B
Tripsina	Millipore	SM-2002-C
Heparina	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Departamento de Cirugía		proporcionado por Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x	objetivo Zeiss Plan Neofluar
Reactivo de disociación de células libres de enzimas	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02