Artículo de método

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

DOI:

10.3791/51492

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17 de enero de 2015

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1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

En este artículo

Resumen

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Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La demanda de los anticuerpos que se satisfagan las necesidades de las aplicaciones básicas y clínicas de investigación es alta y se incrementará dramáticamente en el futuro. Sin embargo, es evidente que las tecnologías tradicionales no son monoclonales solo hasta esta tarea. Esto ha llevado al desarrollo de métodos alternativos para satisfacer la demanda de alta calidad y reactivos de afinidad renovables a todos los elementos accesibles del proteoma. Con este fin, métodos de alto rendimiento para la realización de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos se han diseñado para aplicaciones que implican diversos antígenos y optimizado para un rendimiento rápido y el éxito. En la presente memoria, un protocolo se describe en detalle que ilustra con la demostración de vídeo la selección paralela de clones Fab fagos a partir de bibliotecas de alta diversidad contra cientos de objetivos usando un manipulador de líquidos 96 manual de canales o el sistema de robótica automatizada. El uso de este protocolo, un solo usuario puede generar cientos de antígenos,seleccionar anticuerpos a ellos en paralelo y validar la unión de anticuerpos dentro de 6-8 semanas. Se destacan: i) un formato antígeno viable, ii) caracterización del antígeno preselección, iii) los pasos críticos que influyen en la selección de clones específicos y de alta afinidad, y iv) las formas de efectividad selección monitoreo y etapa temprana caracterización anticuerpo clon. Con este enfoque, hemos obtenido fragmentos de anticuerpos sintéticos (FABS) a muchas clases de objetivos, incluyendo los receptores de un solo paso de membrana, hormonas de proteínas secretadas y proteínas intracelulares multi-dominio. Estos fragmentos se convierten fácilmente a los anticuerpos de longitud completa y se han validado para exhibir una alta afinidad y especificidad. Además, se han demostrado para ser funcionales en una variedad de inmunoensayos estándar, incluyendo transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia celular, inmunoprecipitación y ensayos relacionados. Esta metodología se acelerará el descubrimiento de anticuerpos y en última instancia, nos acercan a la realización del objetivo of generación de anticuerpos de alta calidad, renovables a la proteoma.

Introducción

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Con el inicio de la era post-genómica, la disponibilidad de reactivos de unión de alta calidad para caracterizar y modular proteínas es esencial para abrir nuevas investigaciones y vías terapéuticas. Los anticuerpos siguen siendo fundamentales para los investigadores académicos e industriales como la investigación básica y las herramientas de diagnóstico y terapéuticos potenciales. No en vano, se ha registrado un impresionante crecimiento de las empresas de desarrollo de anticuerpos contrato, la mayoría de los cuales se basan en tecnologías de hibridoma convencionales para generar anticuerpos personalizados. Sin embargo, la selección in vitro usando bibliotecas de anticuerpos en fagos se está convirtiendo en una tecnología poderosa alternativa que puede ofrecer ventajas únicas y éxito donde las tecnologías convencionales pueden enfrentar limitaciones 1, 2.

A la luz de la considerable demanda de anticuerpos de alta calidad como herramientas de investigación, dos retos principales para la generación de anticuerpos renovables son 1) el rendimiento de la selección y 2) av antígenodimensiones pueden ser. Un número de grupos han descrito en las tuberías de selección in vitro destinadas a aumentar el rendimiento y la tasa de identificación de anticuerpos. Estas descripciones detalle una variedad de enfoques viables que incluyen la selección a ya sea de longitud completa se dirige a 3,4, o dominios 5,6,7 estructuralmente relacionado, utilizando ya sea 6,8 o placa de base 3,4 esquemas de inmovilización del antígeno basado en perlas. Además, la creciente adopción de las tecnologías de síntesis de genes 9 ha hecho la generación de antígeno sistemática, en particular de dominios aislados, razonablemente rentable y puede potencialmente aliviar la dificultad en la obtención de cantidades suficientes de antígeno purificado, de longitud completa. Mediante el uso de las dos tecnologías en tándem, un oleoducto autónomo y generación antígeno escalable y selección de anticuerpos se ideó que permita el aislamiento paralelo de anticuerpos para grandes conjuntos de dominios de antígenos expresados ​​y facilitar el desarrollo de reactivos para characterizing clases enteras de proteínas estructuralmente o funcionalmente relacionados.

Con este objetivo, un gasoducto integrado que las parejas en la identificación in silico de dominios antígeno expresables, síntesis de genes, expresión bacteriana de alto rendimiento de antígenos y escalables fagos selecciones de anticuerpos se ha desarrollado. Este gasoducto requiere sólo la infraestructura básica disponible para la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida (incluidas las bibliotecas de anticuerpos que son cada vez más accesibles a través de un acuerdo de licencia o de transferencia de material), pero también es susceptible de automatización para el uso a escala industrial. El uso de este protocolo, es posible generar cientos de dominios antigénicos de afinidad de etiquetado, y aislar fragmentos de anticuerpos rutinariamente altamente específicos para muchos de estos antígenos.

La tecnología de presentación en fagos ha demostrado demostrado la compatibilidad con una amplia variedad de formatos de reactivo de afinidad recombinantes incluyendo Fab, scFv, Fv y los dominios autónomos y unacreciente variedad de pequeños "marcos alternativos" (proteínas ankyrin repetir diseñados (DARPins), fibronectina (FN), dominios de lipocalina y más 10). Discusión se limita en este ejemplo para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos Fab, aunque se presume que estos métodos pueden adaptarse a otros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnología, los Fab con baja afinidad nanomolar a pequeña, etiquetados dominios de la proteína incluyendo dominios del factor de transcripción, dominios SH2, proteínas y otros ARN vinculante se han seleccionado con éxito, muchos de los que se unen para pedir una proteína y son funcionales en inmunoensayos, como la inmunofluorescencia , inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Es importante destacar que los clones de unión recombinantes son totalmente renovable y se puede volver a generar a partir de construcciones de expresión a través de la producción bacteriana oferta mayor coherencia, la reproducibilidad y la rentabilidad, lo que justifica el gasto de validación clon riguroso.

En este protocol y video que lo acompaña, se demuestran los métodos básicos para la selección de anticuerpos de bibliotecas de fagos utilizando dominios de antígenos inmovilizados. Este método particular emplea dominios de la proteína marcada con GST inmovilizado por adsorción pasiva en placas de micropocillos, aunque otras etiquetas 11,12,13 y formatos de selección 13,14,2 también se han utilizado con éxito. Consideraciones críticas para la configuración y el comportamiento de las selecciones con control paralelo de parámetros de selección destinados a identificar y aislar anticuerpos monoclonales específicamente enriquecidos para la validación se detallan.

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Protocolo

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1. Antígeno Generación

NOTA: los dominios antígeno puede ser sintetizado y clonado por una variedad de vendedores comerciales en un constructo de expresión inducible por IPTG apropiado.

  1. Transformar los constructos de expresión en, T1-fago resistente químicamente competente, BL21 E. células de E. coli por mezcla de 10 ng de ADN que codifica en 20 l de 1X KCM en el hielo en una placa de PCR de 96 seguido de la adición de 20 L de las células químicamente competentes.
  2. Incubar la mezcla de células / ADN en hielo durante 20 min, a temperatura ambiente durante 10 min y luego en hielo de nuevo durante 2 min antes de salvamento con 100 l de caldo de súper óptima pre-calentado con glucosa (SOC) medios de comunicación, cubriendo con una junta de la placa transpirable y agitación a 37 ° C durante 1 hora a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm.
  3. Placa de 5 l de células transformadas a Luria-Bertani (LB) placas / agar suplementado con carbenicilina (100 g / ml) y crecer O / N para obtener colonias individuales utilizados paragenerar stocks de glicerol.
  4. Inocular 1 ml de 2YT media / carbohidratos con 5 l de glicerol y crecer durante 12 horas a 37 ° C en un bloque de 96 pocillos de pozo profundo con agitación a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm.
  5. Inocular NZY media15 (suplementado con 0,05% de glucosa, 2% de lactosa y 100 g / ml de carbenicilina) con una dilución 01:40 de este cultivo, a continuación, se agita durante 6-8 horas a 30 ° C y 200 rpm en un orbital 2,5 cm coctelera.
  6. Bacterias de pellets y purifican proteínas antigénicas en alto rendimiento en una placa de filtro de 96 pocillos que contenía 100 l de resina Ni-NTA como por protocols16,17 publicado previamente.
  7. Determinar la concentración de proteínas purificadas por Bradford assay18 de fijación de colorante y caracterizar para el tamaño y la pureza de la separación y visualización de 10-50 g con tinción de Coomassie en un gel de SDS-PAGE (Ver Figura 2).
    NOTA: En esta etapa proteínas puede caracterizarse adicionalmente por métodos que evalúan la agregación de proteínas 19 o plegable 20 dependiendo de la naturaleza del antígeno y los requisitos de la tubería de selección.

2. Preparación y titulación de la biblioteca de fagos

  1. Elija una sola colonia de T1 fago resistentes E. coli células en 1 ml de medio 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina.
  2. Una vez que el crecimiento celular se establece visualmente, diluir el cultivo en un volumen mayor de 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina para asegurar un volumen suficiente de células para la infección (generalmente 45 l por dilución biblioteca, ver a continuación.).
  3. Preparar la biblioteca para su uso por precipitar el fago de tampón de almacenamiento con 1 / quinto volumen de autoclave 20% de PEG-8000, M NaCl 2.5 (PEG-NaCl) incubar en hielo durante 30 min y la granulación precipitó el fago por centrifugación a 12.000 x g.
  4. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado de fago en un volumen apropiado de 1x PBS pH 7,4, 0,2% de BSA y 0,05% de Tween (PBT), ajustando to una concentración de fago apropiado para selecciones (si es necesario) para garantizar la cobertura de la biblioteca adecuada. Consulte el paso 2.9 y Discusión.
  5. Diluir una alícuota del fago 5 l en 45 l de 1x PBS pH 7.4 en una placa multi-pocillo estéril, mezclar y crear una serie de diluciones de 10 veces en el mismo tampón.
  6. Añadir 5 l de cada dilución de fago a 45 l de fago T1 resistentes E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 600 = 0,4 a 0,8) en otra placa de múltiples pocillos, cubren con un sello transpirable e incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 30 minutos en un agitador orbital 2,5 cm.
  7. Placa de 5 l de células infectadas de cada uno de los pozos en una placa de agar pre-calentado suplementado con 100 g / ml de carbenicilina y crecer O / N a 37 ° C hasta que las colonias son visibles.
  8. Calcular el total de fagos / ml como sigue:
    Los fagos / ml = número de colonias en una placa carbenicilina en el diluir la muestra x 200 x 10 i (con i = el num más máximoBER de diluciones en el que las colonias son evidentes).
  9. Para determinar el número de pocillos recubiertos de antígeno para asegurar la cobertura de la diversidad de la biblioteca, calcular como sigue:
    Número de pozos recubiertos de antígeno requerida =
    Cobertura pliegue deseado * diversidad de la biblioteca
    Nº de fagos por 100 l

3. Anticuerpo Selección de bibliotecas de fagos

3.1) Inmovilización de antígeno

  1. Para evitar los ciclos de congelación-descongelación que pueden afectar a la calidad del antígeno y para facilitar diluciones, preparar un plato proteína antigénica de almacenamiento normalizado a 100x concentraciones de trabajo (por ejemplo, 500 g / ml) y alícuotas a placas de 96 pocillos no vinculante.
  2. Preparar placas recubiertas de antígeno a partir de soluciones de stock de proteína un día antes de cada ronda de selecciones mediante la dilución de placas stock con PBS.
  3. Escudo placas de 96 pocillos de poliestireno de unión a proteínas de alto con 100 l de proteína antigénica GST-etiquetados o control negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a 5 mg / ml en PBS. Agitar a 250 rpm 4 ° CO / N en un agitador de microplacas.
  4. Eliminar la solución de proteína de la recubierto microplacas, bloquear las placas recubiertas de antígeno y la selección negativa con 200 l de tampón de bloqueo (0,2% de BSA en PBS 1x pH 7,4) y agitar a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
  5. Después del bloqueo, lavar las placas recubierto de proteína bloqueadas cuatro veces con 200 l de 1x PBS pH 7,4 con 0,05% de Tween (PT) de tampón ya sea manualmente o usando un lavador de microplacas automático.

3.2) Biblioteca Pre-liquidación y Antigen-fago Incubación

  1. Agotan la biblioteca de no (o TAG) clones específicos de unión de fagos de fragmentos de anticuerpos a través de la transferencia de 100 l (10 12) de fago de biblioteca de fagos preparado en tampón de PBT a una serie de pocillos recubiertos con proteína de control negativo o etiqueta de afinidad libre proteína (por ejemplo, GST) equivalente al número de objetivos e incubar fagoen pocillos durante 1-2 horas a RT con agitación a 250 rpm.
    NOTA: Como una alternativa o medios adicionales de selección negativa, la incubación puede también llevarse a cabo en presencia de un exceso (5-25 mM) etiqueta de afinidad de proteína soluble (por ejemplo, GST) para eliminar adicionalmente los clones de unión de etiquetas y mejorar la recuperación de la diana específica clones de unión.
  2. Transferencia de fago sobrenadante de selección negativa a las placas recubiertas con antígeno y se incuba durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación a 250 rpm para la captura de los clones de unión específicos.
  3. Retire fago no unido y se lavan los pocillos de la microplaca 8-15 veces con tampón PT ya sea manualmente o utilizando un lavador de microplacas. Retire el exceso de tampón de lavado justo antes de la elución.

3.3) elución, Infección y Fago amplificación

  1. Temprano en el día de elecciones, elegir una sola colonia de T1 fago resistentes E. coli células en 1 ml de medio 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina y crecer a 37 ° C wiº agitación a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm o equivalente.
  2. Una vez que se estableció el crecimiento celular y puede ser visto por el ojo, aumentar el volumen de los medios de comunicación con 2YT suplementado con 50 ug / ml de tetraciclina para asegurar un volumen suficiente de células para la infección (generalmente 100 l por selección bien).
  3. Cultivar las células hasta una DO 600 de 0,4-0,8 se alcanza (aproximadamente 5-7 horas), a continuación, para eluir el fago unido añadir 100 l de células a la placa de antígeno se lavó y agitar a 37 ° C durante 30 min.
  4. Añadir fago auxiliar M13K07 a una concentración final de 1 x 10 10 ufc / ml y se incuba a 37 ° C durante 45 min con agitación a 200 rpm.
  5. La transferencia de células a 1,2 ml de 2YT suplementado con 150 mg / ml de carbenicilina y 75 mg / ml de kanamicina en un bloque de 96 pocillos de pozo profundo con fondo en V y crecer O / N a 37 ° C con agitación a 200 rpm en un 2,5 cm agitador orbital.

3.4) Preparación Fago y repetidas rondas de Selección

  1. Bacterias de pellets por centrifugación a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  2. Mezclar volúmenes iguales de sobrenadantes de fagos de placas replicadas en un mini-tubo de 96 pocillos caja azul de microplacas estériles, neutralizar con 1/10 volumen de 10X PBT y mezclar. Repetir las rondas de selección (a partir del paso 3.1.1) por 3-4 rondas o hasta que se observa el enriquecimiento (Vea las Secciones 4. y 7.) en comparación con la proteína de control negativo.
    NOTA: En las primeras rondas de selección cuando no se espera un importante enriquecimiento / detectable (es decir, las rondas 1 y 2), la cuantificación de los títulos de entrada y salida de fagos (descritos en la Sección 7 y resultados representativos se muestra en la Figura 3) puede ser útil para asegurar concentraciones mínimas de fagos para selecciones exitosas (descritos en discusión) y son más apropiados que los ELISA agrupados.

4. Caracterización por Pooled ELISA

  1. 96 pocillos Escudo de alto valor proteico-binding placas de poliestireno con 100 l de GST-etiquetados proteína antígeno o proteína de control negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 mg / ml según la Sección 3.1 y agitar a 4 ° CO / N.
  2. Eliminar el exceso de antígeno, bloquear la placa con 200 l de tampón de bloqueo con agitación durante 1-2 horas a RT a 250 rpm en un agitador de microplacas y se lava cuatro veces con tampón PT 200 l, ya sea a mano o por lavador de placas automatizado.
  3. Aplicar 100 l de sobrenadante de fago (diluido 1: 10-1: 20 en tampón PBT), agitar a 250 rpm durante 15 min a TA, y se lava la placa ocho veces con tampón PT 200 l.
  4. Añadir 100 l de anti-M13-HRP (1: 5000 en tampón PBT). Agitar a 200 rpm durante 30 min a RT, a continuación, lavar la placa seis veces con tampón PT 200 l y dos veces con 200 l de PBS.
  5. Aplicar 100 l de 1: 1 de sustrato TMB y desarrollar durante 5-15 min (o hasta que el color sustancial ha desarrollado), y luego se detiene la reacción por adición de 100 l de 1 MH 3 PO 4 y leer la placa a 450 nm.
  6. En general, el enriquecimiento en grupos de fagos se puede observar en las rondas 3-4 como una relación de la unión específica frente a la unión no específica de> 2 (véase la Figura 4)
    NOTA: Es informativo observar que gran señal de unión absoluta de la proteína marcador de afinidad indica enriquecimiento de carpetas-etiqueta específica (en lugar de carpetas de destino), y que la señal de unión absoluta en lo alto de la proteína de control negativo indica enriquecimiento de no específica o " aglutinantes pegajosas ".

5. Clone Selección, secuenciación y caracterización

5.1) El aislamiento de clones individuales Fab-fago

  1. Para aislar clones individuales para la secuenciación y caracterización, infectar 1/10 volumen de la piscina de fago amplificado en al fago T1 resistentes a E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 600 = 0,4-0,8) en una placa de microtitulación de fondo redondo, cubrir con un Breathajunta de la placa ble e incubar con agitación a 200 rpm durante 30 min a 37 ° C.
  2. Preparar 10 veces diluciones seriadas en medios 2YT y placa sobre placas de agar separadas suplementadas con 100 g / ml de carbenicilina.
  3. Recoger colonias individuales en 450 l de medio 2YT / carb suplementado con 1 x 10 9 M13K07 fagos / ml y crecer O / N en un mini-tubo 96 caja azul de microplacas pocillo estéril de incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  4. Bacterias de pellets por centrifugación a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  5. Sobrenadante de fago clonal se puede utilizar para la secuenciación de clones Fab fagos (como se describe en la Sección 5.4), o para clonal-ELISA de unión directo para determinar la especificidad contra antígenos inmovilizados (como se describe en las Secciones 5.3 y 21) para los que los resultados representativos se muestran en la figura 5.

5.2) La expresión de los clones Fab para la caracterización

  1. Después de la clonación en un apropiado evector xpression (ver Discusión), recoger sola E. coli colonias transformadas con construcciones de expresión a 1 ml de 2YT media / carbohidratos en un 96 y placa de pozo profundo con un palillo o punta de la pipeta estéril y crecer durante 12-16 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Esto se puede hacer ya sea manualmente o con un selector automático de colonias.
  2. Transferencia de 40 l de cultivo en crecimiento de 1,5 ml de medio NZY suplementado con glucosa / lactosa / glicerol en un bloque bien para pozos profundos 96 según la metodología de Studier et al. 15
    NOTA: Como alternativa, las células se pueden cultivar durante 3-4 hr (OD 0,8-1,0) en la expresión no suplementada y la proteína inducida por la adición de 1 mM IPTG.
  3. Cubrir el bloque de cultivo (s) con un sello transpirable y expresar clones de Fab durante 6-8 horas a 30 ° C con agitación a 200 rpm. Placas giran a 4000 xg durante 15 min para sedimentar las células bacterianas, separar el sobrenadante, placas de recubrimiento con un sello de papel de aluminio y se congelan bolitas a -20 ° C hasta que la lisis.
  4. Liberar los Fab expresados ​​a partir de gránulos recogidos con 100 l de tampón de lisis (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% Triton X-100 de pH 8,0 con 1 mg / ml de lisozima y 10 inhibidores de benzonasa / ml de cultivo y de la proteasa u) y agitación durante 2 horas a 4 ° C.
  5. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C y se recoge el sobrenadante lisado crudo para su uso en la caracterización inicial de la especificidad por placas de ELISA (véase la Sección 5.3).

5.3) Caracterización Clon por la unión directa Clonal Fab ELISA

  1. Inmovilizar antígenos como se describe en la Sección 3.1 en lugar aliquotting 30 l de 2 mg / ml de antígeno en PBS a los pocillos de una placa de 384 pocillos. Diseños de antígeno basados ​​en Quad en la placa pueden facilitar la transferencia de reactivos cuando se usa 96 cabezales de distribución basadas en canal. Lave y bloquear las placas de ELISA según la Sección 3.1.
  2. Lisados ​​aclarados recogidos de Sección 5.2 se puede aplicar directamente al antígeno inmovilizado para evaluación de la unión. Incubar 30 l de lisado por pocillo durante 15 min a TA con agitación a 200 rpm.
    NOTA: proteína purificada clon Fab alternativamente se puede utilizar mediante la dilución de 10 g / ml en tampón de PBT y la aplicación de 30 l de cada clon a los pocillos bloqueados que contienen antígeno o proteína de control negativo (GST, BSA etc.) y el desarrollo de la misma manera descrita a continuación. Alternativamente, Fab-fago también se puede utilizar mediante la dilución de 10 l de sobrenadante de fago (que se describe en la Sección 5.1) en 20 l de tampón PBT (1: 3) y la detección con anticuerpos anti-M13-HRP (que se describe en los pasos 4.4 a 4.5)
  3. Retire el exceso de lisado y lavar los pozos ya sea manualmente o utilizando una placa automatizado lava 8x con 100 l de tampón PT y eliminar el exceso de buffer.
  4. Incubar 30 l de una dilución 1: 5000 de anticuerpo anti-FLAG secundaria en tampón PBT durante 30 min a RT con agitación a 200 rpm.
  5. Lave, desarrollar y cuantificar indicados en los puntos 4.3 a 4.5.
    NOTA: Los resultados representativosque ilustran clones de unión tanto específicas como no específicas se muestran en la Figura 5.

5.4) Secuenciación Clone

  1. Prepare una mezcla maestra de PCR como se indica en la Tabla 2.
  2. Añadir 2 l de la plantilla de PCR apropiado (ya sea fago sobrenadante o re-suspendido sola colonia bacteriana que contiene fagémido-) a 20 l de mezcla maestra de PCR preparados con los cebadores apropiados en los pocillos de una placa de PCR.
    NOTA: se requieren mezclas de reacción separadas para la secuenciación de ambos los genes de las cadenas pesadas y ligeras.
  3. Ejecutar la reacción de PCR usando los parámetros enumerados en la Tabla 2 - Configuración de la PCR.
  4. Verificar el éxito de la reacción de PCR mediante la mezcla de 5 l de la reacción completada con colorante de carga en un gel de agarosa al 1% suplementado con tinción de ADN y la visualización de imágenes en un transiluminador de 300 nm.
  5. Añadir 2 l de producto de PCR a 10 l de agua estéril que contiene 0,2; L cada uno de exonucleasa y la fosfatasa alcalina de camarón y se incuba a 37 ° C durante 20 min seguido de la inactivación de la enzima a 80 ° C durante 10 min para eliminar el exceso de cebadores en la preparación para la secuenciación.

6. Escala de Selección Automatizado

6.1) de manejo de líquidos a base de pipeta

  1. Preparar un 1% (w / v) de azul de bromofenol en agua y eliminar las partículas insolubles usando un filtro de 0,45 ml.
  2. Para determinar el rango lineal de la absorbancia en el lector de placa, preparar una dilución 1: 1.000 de la solución de azul de bromofenol 1% en agua, y continuar con dos veces diluciones en serie (diluciones 16 en total).
  3. Transfiera 100 l de cada dilución a una placa de fondo plano de 96 y leer la absorbancia a 590 nm. Terreno absorbancia absoluta frente factor de dilución y elegir una dilución en el medio a alto final del rango lineal para pruebas posteriores.
  4. Añadir azul de bromofenol al agua o a la solución realque se pipetearon en base a la dilución escogida en el paso anterior en un volumen suficiente para el pipeteado para tres placas de 96 pocillos, más el volumen muerto en el depósito.
  5. Calibrar una pipeta de un solo canal para entregar el volumen de ensayo pipeteando agua sobre una balanza analítica (100 l de agua pesa 100 mg a TA.)
  6. Usando la pipeta calibrada, transferir el volumen de ensayo de la solución de teñido para al menos tres pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano y leer sus absorbancias a 590 nm, por triplicado.
  7. Pesar tres pocillos vacíos de fondo plano de 96 en una balanza analítica y registrar sus masas.
  8. Volumen de ensayo de pipetas de depósito para cada uno de tres placas de 96 pocillos y medir sus absorbancias a 590 nm, por triplicado.
  9. Pesar cada placa y calcular la diferencia de masa.
  10. En primer lugar, evaluar si las absorbancias de cada bien son uniformes dentro del rango de tolerancia (por ejemplo., +/- 5%) y de su coherencia con la famie absorbancias obtenidas por mano de pipeteado con el Pipetman calibrado. Si los canales particulares son consistentemente más o de menos la entrega (por ejemplo, véase la Figura 6), siga los procedimientos de reparación y repita el procedimiento de evaluación hasta que todos los canales ofrecen volúmenes uniformes.
  11. En segundo lugar, una vez que todos los canales se confirman la entrega de volúmenes uniformes, comprobar la exactitud de ese volumen mediante el cálculo de la diferencia de masa promedio por pozo. Por ejemplo, un conjunto manipulador de líquidos perfectamente calibrado para 100 l entregará 9,60 g de agua por placa, o 0,10 g de agua por pocillo. Si el volumen real de entrega es consistentemente sobre o bajo el volumen deseado, a continuación, un factor de corrección se puede aplicar, es decir, la programación de 110 l con el fin de entregar en realidad 100 l.
    NOTA: Para pequeños volúmenes, por ejemplo, 10 l, utilice diez veces más azul de bromofenol en la solución de teñido, y pre-alícuota de 90 l de agua a las placas de 96 pocillos a mano, para asegurar que el absorbances son medibles y la caída en el rango lineal.

6.2) Lavado automatizado Plate

  1. Inmovilizar objetivo positivo y proteínas de control negativos en pocillos separados de microplacas de 96 pocillos (dos placas para cada condición a ensayar) como se describe en la Sección 3.1.
  2. Bloquear los sitios de unión no específica mediante incubación con solución de bloqueo durante una hora a RT.
  3. Añadir idénticas alícuotas de 100 l de una ufc 10 13 / ml objetivo vinculante solución de Fab-fago en PBT a todos los pocillos en todas las placas y se incuba con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 hr.
  4. Lávese las dos placas de acuerdo a cada estado, una placa para la infección y la titulación y una placa de ELISA.
  5. Evaluar la eficacia del lavado por la infección directa en bacterias y titulación (como se describe en la Sección 3.3 (sin M13K07 adición) y 7.2.1) o desarrollo con anti-anticuerpo M13 HRP y sustrato colorimétrico (como se describe en la Sección 4).
  6. Valoraciones de fagos from clones específicos a menudo producirán en el intervalo de 10 5 -10 7 fagos / ml de una proteína inmovilizada contra el cual se une específicamente el clon. Algunos unión residual de proteína de control negativo (por ejemplo, BSA) es de esperar y, en general 10 2 -10 5 fagos / ml se observan, sin embargo los títulos muy bajos (es decir., <10 1) puede tener señal de lavar excesivamente estrictas, lo que puede poner en peligro una selección.
  7. Para fago unión determinada por ELISA, comparar las señales absolutas vinculantes para las proteínas de control positivo y negativo para determinar si el lavado robótico es equivalente al establecido causa de lavado de manos (Figura 7).

6.3) La descontaminación Lavavajillas Placa

  1. Para comenzar, ejecutar el protocolo de descontaminación para ser probado.
    NOTA: Recomendamos el uso de al menos el doble del volumen total de la línea, y el primer y tomar la cabeza lavadora durante 5 minutos en el 0,5% de hipoclorito de sodio, fr recién diluidolejía comercial om (típicamente 6% de hipoclorito de sodio).
  2. Primer y tomar la cabeza lavadora durante 5 min en (autoclave) de agua estéril y, por último, cebe el sistema hasta que las líneas están llenas de aire.
  3. Primer de las líneas con agua estéril o tampón de lavado.
  4. Lavar una microplaca de 96 pocillos estériles una vez, retire de la lavadora y el sello con junta de la placa estéril. Esta es la placa de control previo a la contaminación.
  5. Alícuota de 100 l de O / N amplifican la cultura fago sobrenadante a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos.
  6. Lave la placa que contiene el fago-una vez, a continuación, retire de la lavadora y sellar con un sello de plástico o papel de aluminio placa. Esta es la placa de control de la contaminación.
  7. Llevar a cabo el protocolo de descontaminación está probando. En este ejemplo, repita los pasos 6.3.1 y 6.3.2.
  8. Lávese las microplacas estériles una vez, a continuación, retire de la lavadora y el sello. Esta es la placa de ensayo de descontaminación.
  9. Placa de 50 l de la fase de registro E. coli a las placas de titulación; este es el pre-infecciónplaca de control de la.
  10. Quitar el sello pre-contaminación, la contaminación y las placas de 96 pocillos de descontaminación y añadir 100 l de E. coli en la etapa de crecimiento en fase logarítmica a todos los pocillos, utilizando nuevos consejos para cada pozo.
  11. Sellar y se incuba a 37 ° C durante 30 min a 200 rpm.
  12. Placa de 50 l de células infectadas de tres pozos al azar de cada placa de 96 pocillos a placas 2YT / carb 10 cm y se incuba a 37 ° CO / N.
  13. Transferencia de 50 l de células infectadas de todos los pocillos de cada placa a placas de pocillos profundos que contienen 1 ml de 2YT más 100 g / ml de carbenicilina por pocillo y crecer O / N a 37 ° C.
  14. Repita el protocolo de descontaminación y dejar la lavadora líneas sequen.
    NOTA: No O crecimiento / N en placas o en un medio líquido debe ser observado en las placas de control previas a la infección, el control previo a la contaminación o las pruebas de descontaminación. Muchas colonias y el crecimiento deben ser observados en la placa de control de la contaminación; si no, no hay conclusiones sobre la eficacia de laprotocolo de descontaminación se puede hacer. Idealmente, las placas de descontaminación producirán colonias y no hay ningún crecimiento O / N en cualquiera de los pocillos en las placas de O / N. La rigurosidad del protocolo de descontaminación se puede aumentar con concentraciones más altas de blanqueo, ya remojo tiempos y ciclos adicionales.

7. Entrada / Salida de titulaciones

7.1) Las titulaciones de fagos de entrada

  1. Diluir una alícuota de 5 l de fago a 50 l con PBS estéril filtrada y mezclar.
  2. Preparar serie de dilución de 10 veces en PBS filtrada de forma estéril a 10 10 con una pipeta multicanal o una pipeta de 96 canales.
  3. Inocular 5 l de fago diluido en 45 l de fago T1 resistentes a E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 0,6-0,8) e incubar cubierto con un sello respirable durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Placa de 5 l de células infectadas en un / placa de agar LB suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba O / N at 37 ° C.
  5. La concentración de fago puede estimarse a partir de la muestra más diluida en la que aparecen colonias de acuerdo con los cálculos detallados en la Sección 2.8.

7.2) Salida de Fago Pitrations

  1. Después de la elución de fago unido a la placa mediante la adición de E. coli células, diluir una alícuota de 5 l de células infectadas con fago a 50 l con medio 2YT en autoclave
  2. Preparar serie de dilución de 10 veces en medio 2YT autoclave a 10 6 usando una pipeta multicanal o pipeta de 96 canales.
  3. Placa de 5 l de células infectadas en que una placa de agar suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba O / N a 37 ° C.
  4. La concentración de fago puede estimarse a partir de la muestra más diluida en la que aparecen colonias de acuerdo con los cálculos detallados en la Sección 2.8.
    NOTA: En ambos casos (es decir, los títulos de entrada y salida de fago, la comparación con el número de colonias en tanto tetraciclina (cel total del número) y kanamicina (fago auxiliar título) también pueden ser de carácter informativo.

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Resultados

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El protocolo descrito en el presente documento se ha utilizado para aislar fragmentos de anticuerpos a una variedad de ambos dominios de antígenos estructuralmente y funcionalmente relacionados con bibliotecas combinatorias de Fab presentados en fagos en paralelo. Cuestiones relacionadas con la disponibilidad de antígeno pueden eludirse, en muchos casos, por la identificación in silico de dominios antígeno expresables que son adecuados para la selección de anticuerpos 23. Mediante el acoplamiento de la expres...

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Discusión

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Al llevar a cabo en la selección de anticuerpos in vitro, los dos determinantes principales de éxito selección son 1) el aislamiento de dianas antigénicas bien plegadas para seleccionar sobre y 2) la disponibilidad de una biblioteca de anticuerpos de alta diversidad funcional. En muchos casos, la disponibilidad de cantidades suficientes de bien plegada, proteína de longitud completa puede ser limitante. Un enfoque para superar esta limitación es el uso de dominios identificados a partir del análisis bi...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría reconocer el Fondo Común NIH - Proteína Programa de reactivos de captura para financiar el desarrollo de la selección y caracterización de anticuerpos tubería recombinante de anticuerpos de red y de la Fundación Canadiense para la Innovación para la compra de financiación de la plataforma de selección robótica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MATERIALES
New Brunswick Innova44 incubadora agitadora apilableEppendorfM1282-0004
Liquidator 96 canales sistema de pipeteo manual de sobremesaAnachem LtdLIQ-96-200
Agitador de microplacasVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de sobremesaThermo Product
ELx405 Select Lavadora de microplacas de pozo profundoBiotekELX405USD
Robot de selección de fagos automatizado de alto rendimiento personalizadoS& P Robotics
Tubo cónico de plástico Falcon: 50 mlVWR21008-178
Tubo cónico de plástico Falcon: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1,7 ml Tubos de microcentrífugaCorningMCT-175-L-C
Placa Maxisorp de 96 pocillos/384 pocillos SigmaM9410-1CS
Corning Bloque de pozos profundos con fondo en V de 96 pocillosCorning3960
Axygen Minitubo Microplaca estéril de 96 pocilloscaja azul CorningAXY-MTS-06-C-R-S
Placa adhesiva transpirable película de selladoVWR60941-084
REACTIVOS
NombreEmpresaNúmero de catálogo
Bioshop PEG800.1
extracto de levaduraBioshopYEX401.1
bio-triptonaBioshopTRP402.1
N-Z aminaSigmaC7290
glucosaSigmaG8270-1KG
lactosaBioshopLAC234
glicerolBioshopGLY001.500
carbenicilina BioshopCAR544.10
kanamicinaBioshopKAN201.25
tetraciclina BioshopTET701.25
Tween 20 BioshopTWN510.500
fosfato de potasio monobásicoBioshopPPM302.1
fosfato sódico dibásicoAnachemia84486-440
cloruro sódicoBioshopSOD001.10
cloruro potásicoBioshopPOC308.1
cloruro de calcioBioshopCCL302.500
sulfato de magnesioEMDMX0070-1
cloruro de magnesioBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe Tinción de gel de ADNInvitrogenS33102
ácido fosfóricoAcros Organics201140010
lisozimaBioshopLYS702.25
benzonasaNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
cóctel inhibidor de proteasas comprimidosRoche11 836 170 001
resina Ni-NTA Qiagen1018240
1.000x fago auxiliar (M13K07) stock (1013 fago por ml)NEBN0315S
HRP anticuerpo conjugado específico M13 (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
Sustrato TMB: mezcle volúmenes iguales de TMB y sustrato de peroxidasa H2O2KPL50-76-00
dNTPsBiobásicoDD0056
Taq polimerasaGenscriptE00007
ExonucleasaGE Healthcare EZ0073X-EZ
Camarones fosfatasa alcalinaGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525 polietilenglicol

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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