Artículo de método

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

DOI:

10.3791/51544

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6 de agosto de 2014

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.

Resumen

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La creciente conciencia de que tanto la regulación temporal y espacial de la expresión génica puede tener consecuencias importantes sobre la función celular ha llevado al desarrollo de diversas técnicas para visualizar las transcripciones de ARN individuales en células vivas individuales. Una técnica prometedora que ha sido recientemente descrito utiliza una sonda de oligonucleótidos basados ​​en óptica, radiométrica faro bimolecular (rbmb), para detectar transcritos de ARN que fueron diseñados para contener al menos cuatro repeticiones en tándem de la secuencia diana rbmb en la región 3 'no traducida. RBMBs están específicamente diseñados para emitir una señal fluorescente brillante tras la hibridación con ARN complementario, pero por lo demás permanecen apagados. El uso de una sonda sintética en este enfoque permite fotoestable, desplazada al rojo, y colorantes orgánicos altamente emisivo para ser utilizado para la imagen. La unión de múltiples RBMBs a las transcripciones de ARN de ingeniería resultados en puntos discretos de fluorescencia cuando se observa bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. En consecuencia, el movimiento de transcritos de ARN individuales puede ser visualizado fácilmente en tiempo real mediante la adopción de una serie temporal de imágenes fluorescentes. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega en las células mediante formación de microporos y vivimos de células de formación de imágenes de transcritos de ARN individuales.

Introducción

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La expresión y la regulación de las transcripciones de ARN es un proceso complejo y dinámico que es en gran parte responsable de controlar el comportamiento de las células y el destino. Aunque la importancia de ARN en función de la célula dictando ha sido conocido durante algún tiempo, a menudo es difícil establecer conexiones claras entre los dos ya que la mayoría de las herramientas de análisis de ARN carecen de la resolución espacial y temporal requerida para capturar eventos regulatorios importantes, tales como rotura de la transcripción, ARN el tráfico y el procesamiento del ARN localizada. Esto ha llevado a la llegada de varias técnicas que permiten transcritos....

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Protocolo

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En este protocolo, un oligonucleótido (RBMB1) fue marcado en su extremo 5 'con un colorante indicador CF640R y tiene la secuencia: 5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. Dominios autónomos complementaria, que impulsan la formación de la estructura de horquilla, están en negrita. El segundo oligonucleótido (RBMB2) se marcó en el extremo 3 'con un extintor Iowa Negro RQ-Sp y tiene la secuencia: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1 Preparación de RBMBs

  1. Realizar un giro rápido de los t....

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Resultados

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Poco después de la formación de microporos de las células HT1080 en presencia de RBMBs, transcripciones de ARN individuales que fueron diseñados para contener múltiples sitios de unión rbmb en su 3'-UTR aparecen como puntos fluorescentes brillantes cuando reflejada por el amplio campo de la microscopía de fluorescencia (Figura 2). Mientras que las transcripciones de ARN individuales con sitios de unión tan sólo cuatro rbmb se pueden obtener imágenes en las células vivas, más sitios en la 3'-UTR vinculan.......

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Discusión

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La capacidad de las transcripciones de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas usando un microscopio de campo amplio convencional requiere una señal fluorescente brillante y fotoestable de estar asociado con cada una transcripción de ARN y un fondo fluorescente bajo que emana de sondas fluorescentes no unidos. En este método, una señal fluorescente brillante se logra mediante la hibridación de múltiples (hasta 96) sondas fluorescentes basados ​​en oligonucleótidos, es decir, RBMBs, en cada tr.......

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Divulgaciones

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Dr. Mark Behlke y el Dr. Ling Huang son empleados de IDT que ofrece oligonucleótidos en venta similares a algunos de los compuestos descritos en el manuscrito. IDT es, sin embargo, no es una empresa que cotiza en bolsa y que personalmente no posee acciones / capital en IDT.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Premio CARRERA (0953583) y el Instituto Nacional de Salud NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agua sin nucleasasLife TechnologiesAM9932sin tratamiento con DEPC
DPBSLife Technologies14190-144sin Ca2+ y Mg2+
Cary 100 Espectrofotómetro UV-VisAgilent Technologies
Fosfato de potasio dibásicoFisher ScientificP290-500
Fosfato de potasio monobásicoFisher ScientificP284-500
Fosfato de sodio monobásicoFisher ScientificS381-500
Tubos de microcentrífugaEppendorf223641111,5 ml
Columna de cromatografíaKimble Chase Life Science420400-07200,7 x 20 cm
Superdex 75 grado de preparaciónGE healthcare17-1044-01
Bomba de jeringaBraintree ScientificBS-300
JeringaBD30103560 ml, punta Luer-lok
Unidades de filtro centrífugoMilliporeUFC501096MW 10.000 corte
Centrífuga 5418Eppendorf
Poly-D-lisinaSigma-AldrichP7280-5MGpolvo liofilizado, irradiado con g
Cubreobjetos de 8 pocillosFisher Scientific 155409Volumen de trabajo 0,2-0,5 ml
HT1080ATCCCCL-121Línea celular de fibrosarcoma humano
Matraz de cultivo celularCorning43063925 cm2
DMEMLife Technologies11965084DMEM de alta glucosa
sin rojo de fenolLife Technologies21063029con alto contenido de glucosa
Sigma-AldrichF2442-500ML
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15140122
TripsinaLife Technologies253000540,05% Trypsin-EDTA
Sistema de transfección de neónTechnologiesMPK5000
Kit de sistema de transfección de neónLife TecnologíasMPK1096
HemacitómetroFisher Scientific02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 Microscopio de fluorescencia invertida Motor de luzOlympus
SOLALumencor
MetamorphDispositivosmoleculares Control de software microscopio
Immerssol oil 518FFisher Scientific12-624-66B
Suero fetal bovino Life

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-....

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Etiquetas

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