Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.
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Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos
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Resumen
Resumen
La toma de muestras seriadas de la composición celular de la médula ósea (BM) es un procedimiento de rutina crítico para la hematología clínica. Este protocolo describe un procedimiento técnico detallado paso a paso para un procedimiento análogo en ratones vivos que permite la caracterización en serie de las células presentes en el BM. Este procedimiento facilita los estudios dirigidos a detectar la presencia de células administradas exógenamente dentro de la BM de ratones, como se haría en estudios de xenoinjertos, por ejemplo. Además, este procedimiento permite la recuperación y caracterización de células enriquecidas en el BM, como las células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) sin sacrificar ratones. Dado que la composición celular de la sangre periférica no refleja necesariamente las proporciones y los tipos de células madre y progenitoras presentes en la médula, los procedimientos que proporcionan acceso a este compartimento sin requerir la terminación de los ratones son muy útiles. Aquí se ilustra el uso de la aspiración de médula ósea femoral para el análisis citológico de las células de la médula, la caracterización citométrica de flujo del compartimento hematopoyético/progenitor y el cultivo de HSPC clasificadas obtenidas por aspiración de MO femoral en comparación con la recolección convencional de médula.
Introducción
Todas las células sanguíneas se derivan de células madre hematopoyéticas (HSC). Los procedimientos que permiten el acceso a la médula ósea (MO), el sitio de la gran mayoría de las HSC en ratones y hombres, sin requerir el sacrificio de animales, proporcionan un recurso para monitorear el origen de la hematopoyesis en serie. El objetivo general del procedimiento descrito aquí es proporcionar un protocolo detallado para el muestreo de células BM del fémur de ratones vivos que proporcione material representativo de las células que se recuperarían mediante la recolección convencional de células BM mediante el sacrificio de los ratones. La ventaja de este procedimiento sobre la recolección convencional de células BM es que este procedimiento no requiere el sacrificio de ratones y, por lo tanto, permite el estudio longitudinal del compartimento de la médula ósea de los ratones a lo largo del tiempo.
Aunque este procedimiento de aspiración de médula ósea murina se ha utilizado en varios estudios y se ha descrito anteriormente (véase Sundberg et al. Para una revisión histórica1), no se han publicado previamente procedimientos formales paso a paso que ilustren esta técnica. Este protocolo permite la toma de muestras seriadas rutinarias de la MO con fines tales como la evaluación del injerto en la MO de las células introducidas exógenamente en el ratón (como se haría en los estudios de xenoinjertos, por ejemplo2,3), el análisis del quimerismo en la MO para su comparación con el de la sangre periférica (donde los resultados no son necesariamente congruentes), el seguimiento de la abundancia de tipos celulares específicos normalmente enriquecidos en la médula, como las células madre hematopoyéticas y progenitoras, y recuperación de células BM para cultivo ex vivo y/o trasplante. Además, la evaluación del contenido de médula puede ser muy útil en modelos murinos de enfermedad hematológica, ya que la aspiración es útil para evaluar la carga de enfermedad hematológica en momentos en que la enfermedad puede no ser evidente en la sangre periférica3-5. Además, esta técnica puede utilizarse para evaluar la respuesta de la enfermedad hematológica en la médula ósea a los fármacos administrados en estudios terapéuticos. Por lo tanto, el procedimiento descrito aquí es ideal para los investigadores que desean obtener acceso a las células hematopoyéticas de la médula ósea de ratones para análisis citológicos, análisis de citometría de flujo, cultivo in vitro y/o estudios de trasplante in vivo sin requerir sacrificio o daño a los ratones.
El protocolo para la toma de muestras de BM descrito aquí es bastante similar a la técnica utilizada para la inyección intrafemoral de material directamente en la cavidad medular3,6. La diferencia clave es que este protocolo detalla el procedimiento para la extracción de células de la médula ósea en lugar de instilar material directamente en el espacio de la cavidad de la médula, como se hace con la inyección intrafemoral.
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Protocolo
Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering.
1. Aspiración de médula ósea (MO) Las células del Fémur
- Se anestesia el ratón que se someterá a la aspiración de médula ósea femoral con isoflurano (1-4%), administrado con un vaporizador de precisión. Profundidad de la anestesia debe ser monitoreado cada 5-10 minutos durante todo el procedimiento por la observación de que no hay ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación quirúrgica y / o la oreja, dedo del pie, y de pinzamiento del rabo. La anestesia se indujo con isoflurano y también mantiene durante todo el procedimiento con isoflurano. Una dosis previa al procedimiento preventivo de la buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6-12 h se puede utilizar para prevenir el dolor asociado con el procedimiento como un adjUNCT al Carprofeno.
- Aplicar pomada oftálmica a los ojos del ratón después de la inducción de la anestesia para evitar el secado de la córnea.
- La piel es cuidadosamente cortados por un área de piel de aproximadamente 150% mayor que el área de la zona de la aspiración previsto. Piel floja se elimina con una gasa húmeda. Por favor, mantenga el ratón sobre un relleno aislante de agua caliente que circula u otra superficie con control termostático de seguridad para prevenir la hipotermia durante el procedimiento.
- Desinfectar la pierna entera que contiene el fémur, que se someterá a la aspiración con tres conjuntos de matorrales alterna (alternando con ya sea un povidona-yodo (Betadine) o una de clorhexidina (Nolvasan) de fregado y 70% de alcohol isopropílico o 70% de etanol empapado esponjas de gasa).
- Moje un 0,5 ml de tuberculina jeringa (volumen: 0,5 cc; calibre: 27,5 G) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), antes de aspirar el BM. Llene la jeringa con 200-500 l de PBS y expulsar inmediatamente a la PBS. Repita este procedimiento 2-3 times.
- Mantenga la inclinación de la tibia del fémur empujando la tibia, ya sea con el dedo anular o el dedo meñique. Confirme que un plano anestésico adecuado se ha alcanzado. La jeringa se lleva a cabo utilizando el pulgar y el dedo índice. Esto permite que los cóndilos a estar expuestos y facilita la inserción de la aguja.
- Después de humedecer la jeringa, insertar la aguja a través del tendón rotuliano de manera que la aguja está alojada de forma segura entre los dos cóndilos del fémur. Por la celebración de la diáfisis cerca de la epífisis del fémur con el pulgar y el dedo índice, la aguja se inserta en el eje del fémur fácilmente.
- Girar la aguja hacia fuera y hacia arriba de manera que es paralelo con el eje del fémur. Esta acción facilita la recuperación de los contenidos de la médula ósea del eje del fémur.
- Gire la aguja hacia la derecha y hacia la izquierda mientras empuja lentamente en la cavidad medular femoral. Confirmar la colocación correcta de la aguja moviendo suavemente el SYRinge lateralmente.
- Tire suavemente el émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa, mientras se mueve la aguja de un lado a otro dentro de la cavidad del BM. Nota: El volumen de aspirado de BM será de aproximadamente 5 l que típicamente corresponde a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. El éxito de aspiración será confirmada visualmente por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja en la base de la jeringa. Si no hay sangre se ve en la jeringa es probable que un fragmento de hueso o tejido pequeña se ha quedado atascado en la aguja. Esto puede ser retirado de la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS (esta es una razón por la jeringa debe ser previamente llenada con PBS antes de aspirar el BM). Si el tejido no puede ser desalojado de la jeringa, use una nueva aguja y jeringa (de nuevo mojar la jeringa con 200-500 l de PBS).
- Una vez que BM se aspira con éxito del fémur, retire la aguja y la jeringa del fémur y el ratón.
- Mueva aspirado BM a un pr tubo de microcentrífugaefilled con 500 l de PBS. Para la mayoría de las aplicaciones, las células de la MO entonces deben mantenerse en hielo hasta su procesamiento posterior, si es posible.
- Tras la finalización del procedimiento, administrar analgésico con carprofeno 5 mg / kg por vía subcutánea. A continuación, retire del ratón de la anestesia y colocar en un cojín calentado hasta que se recupere completamente. NOTA: No debe haber ninguna complicación o sufrimiento experimentado tras el procedimiento de aspiración si se hace correctamente.
- Antes de devolver los ratones con el área de vivienda, aseguran que son capaces de deambular y llegar a los alimentos y el agua. Observar los ratones en busca de signos de malestar o procedimiento después de la infección en la siguiente 24 horas. Las señales incluyen: sangrado constante, anemia, letargo. Si alguno de estos síntomas son vistos después del procedimiento, el animal (s) debe ser sacrificado. Nota: la aspiración BM / muestreo se puede repetir, pero la repetición del procedimiento se debe realizar en el fémur opuesto para evitar traumatismos repetidos en la misma pierna. Hay poca información disponible sobre la frequency que la aspiración BM se puede realizar. Aspiración de médula ósea femoral generalmente se repite con más frecuencia de cada 2 semanas.
2. Evaluación del contenido celular en células de aspirado BM
- Precipitar las células recuperadas de BM aspiración y colocar en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 ° C o RT.
- Aspirar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en 500 l de ACK sangre roja tampón de lisis celular ("amonio-cloruro de potasio" tampón de lisis).
- Se incuban las células en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 10 min y a continuación, añadir 1 ml de PBS y centrifugar la mezcla de nuevo a 300 xg durante 5 min a 4 º C o temperatura ambiente. Nota: El pellet lisado de glóbulos rojos ahora consiste en células mononucleares de BM. Estos pueden ser resuspendidas para la tinción de FACS, el recuento de células, trasplante, análisis de citospina y / o cualquier otro uso (tal como se utilizarían las células BM recogidas de ratones sacrificados).
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Resultados
Femoral BM aspiración de un ratón C57/B6 vivo se utilizó para obtener células mononucleares de BM seguido de la cosecha BM convencional del mismo ratón después del sacrificio. Células mononucleares BM obtenidos por los dos métodos fueron analizadas mediante (1) el análisis citológico de células de la MO, (2) determinar la frecuencia relativa de células madre / progenitoras hematopoyéticas (HSPCs), y (3) el cultivo ex vivo de HSPCs ordenados. En el experimento, Sca1 de linaje negativo última + c-KIT + c...
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Discusión
De serie aspiración BM es un procedimiento de rutina crítica para investigación clínica de los trastornos hematológicos en seres humanos. La capacidad de realizar un muestreo en serie análoga de BM en ratones para la caracterización de la composición celular y componentes de la BM a lo largo de largos experimentos es también muy valiosa. Este procedimiento es útil para la caracterización de HSPC de sin sacrificar el ratón, sino también para detectar la presencia de tipos de células adicionales en el BM en casos en los q...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
O.A.-W. está respaldado por un Premio al Investigador Clínico K08 de los NIH (1K08CA160647-01), un Premio de Becario Postdoctoral del Departamento de Defensa de EE. UU. en Investigación de Insuficiencia de Médula Ósea (W81XWH-12-1-0041), el Programa de Investigadores Josie Roberston y un Premio al Investigador Clínico Damon Runyon con el apoyo de la Fundación Evan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Albúmina sérica bovina | PAA | K41-001 | |
| ACK tampón de lisis | Hecho | en casa en 1 L. Ajuste el pH 7.2 ~ 7.4 y filtre estéril con 0.22 μ m Filtro de vacío. | |
| 8,3 g Cloruro de amonio | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Bicarbonato de potasio | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 ml Jeringa de tuberculina 27,5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Colador de células estériles 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurano, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Aguja roma | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Aguja PrecisionGlide 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Jeringa Luer-Lok | Becton Dickinson 309657 | ||
| Placa tratada sin cultivo de tejidos, 6 pocillos | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubos | Becton Dickinson | 352054 | Tinción FACS |
| 12 x 75 mm Tubos de 5 ml con tapón de filtro de células | Becton Dickinson | 352235 | Tinción FACS |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Para el cultivo de metocelulosa |
| Carprofeno | Crescent Chemical Compañía | C11045850 | 1 dosis (5 mg/kg) |
| Citómetro de flujo, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Pomada veterinaria Puralube (pomada oftálmica estéril de vaselina) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Referencias
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
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- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
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