Con el fin de comprender los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la formación de neotejido y el desarrollo de estenosis en las válvulas del corazón de la ingeniería tisular, se desarrolló un modelo murino de trasplante heterotópico de válvula cardiaca. Una válvula cardíaca pulmonar fue trasplantado al receptor mediante la técnica de trasplante cardíaco heterotópico.
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Artículo de método
El trasplante de la válvula pulmonar Utilizando un modelo de ratón de heterotópico trasplante cardiaco
En este artículo
Resumen
Resumen
Ingeniería tisular las válvulas del corazón, válvulas especialmente descelularizado, están empezando a cobrar impulso en el uso clínico de la cirugía reconstructiva con resultados mixtos. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares de la neotejido desarrollo, engrosamiento de la válvula, y el desarrollo de estenosis no son investigados extensivamente. Para responder a estas preguntas, hemos desarrollado un modelo murino heterotópico de corazón Válvula de trasplante. Una válvula de corazón fue cosechada de un ratón donante y se trasplanta a la válvula de un ratón donante corazón. El corazón con una nueva válvula se trasplantó heterotópicamente a un ratón receptor. El corazón trasplantado mostró su propio latido del corazón, independiente de los latidos del corazón del destinatario. El flujo de sangre se cuantificó usando un sistema de ultrasonido de alta frecuencia con un Doppler pulsado. El flujo a través de la válvula pulmonar implantado mostró delante de flujo con regurgitación mínimo y el flujo pico fue cerca de 100 mm / seg. Este modelo murino de trasplante de válvulas cardíacas es highly versátil, por lo que puede ser modificado y adaptado para proporcionar diferentes entornos hemodinámicas y / o se puede utilizar con varios ratones transgénicos para estudiar el desarrollo neotejido en una válvula de corazón de ingeniería tisular.
Introducción
Defectos cardiovasculares congénitos son una de las principales causas de mortalidad infantil en el mundo occidental 1,2. Entre ellos, la estenosis de la válvula pulmonar y defectos en las válvulas aórticas bicúspides son una forma que ocurre con frecuencia 3. La cirugía de reemplazo de válvulas cardíacas es una elección habitual de cirugías reconstructivas; Sin embargo, las complicaciones, incluyendo la estenosis y la calcificación de la válvula del corazón, y la dependencia de por vida con anticoagulantes son una fuente importante de enfermedad crónica y muerte 4-7. Por otra parte, la falta de potencial de crecimiento requiere cirugías de revisión, lo que aumenta aún más la mortalidad de los pacientes jóvenes 4,8,9.
En un intento de desarrollar una válvula de corazón de sustitución funcional con potencial de crecimiento, Shinoka et al. Células autólogas sembradas en una válvula de corazón sintético biodegradable 8. La válvula sintética transformado en una válvula del corazón nativo como la estructura con potenciómetro crecimientoal. Los estudios en animales grandes preliminares demostraron la viabilidad de utilizar esta metodología para crear una válvula cardiaca funcional 10. Sin embargo, estudios de implantación a largo plazo demostraron poca durabilidad debido al engrosamiento progresivo de la neotejido válvula resulta en el estrechamiento de la válvula cardíaca. Trabaje desde Sodian et al. Utilizaron la metodología Shinoka, pero en última instancia, sustituyó a la matriz de la PGA con un elastómero biodegradable, que dio a las propiedades biomecánicas de la válvula de ingeniería tisular, la construcción de un perfil más fisiológico 9,11,12. En el estudio in vivo, a pesar del éxito de la implantación, no se formó un revestimiento de células endoteliales confluentes que podría limitar el éxito a largo plazo de este andamio 12.
Con el fin de diseñar racionalmente una válvula de corazón sintética segunda generación mejorada, un modelo murino de trasplante de válvula de corazón fue creado para investigar los mecanismos celulares y moleculares underlyinla formación de neotejido g, engrosamiento de la válvula, y el desarrollo de estenosis. Los modelos murinos ofrecen una amplia gama de reactivos moleculares, incluyendo los transgénicos, que no son fácilmente disponibles en otras especies 7. En este modelo de trasplante de válvulas cardíacas, un vivo de reemplazo de válvula cardíaca pulmonar ex syngeneic se realizó en primer lugar; y luego el corazón con la válvula de corazón implantado se implantó heterotópicamente en un hospedador singénico utilizando una técnica de microcirugía. Este modelo permite el reemplazo de la válvula del corazón sin la necesidad de la derivación cardiopulmonar.
En este trabajo, una explicación detallada de la cosecha de la válvula del corazón, preparaciones de corazón donante, trasplante de válvulas cardíacas y el trasplante cardíaco heterotópico se describe. Los resultados mostraron un latido continuo desde el corazón del donante, que era independiente de los latidos del corazón receptor. El flujo de sangre a través de la válvula pulmonar implantado se midió usando un sistema de ultrasonido de alta frecuencia con una onda pulsada hacerppler.
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Protocolo
Nota: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité del Hospital Institucional Cuidado de Animales y Uso de los Niños de Nationwide.
1. Válvula pulmonar del corazón de la cosecha de un donante de la válvula del corazón del ratón
- Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía: 1x tijeras finas, 3x fórceps micro, pinzas vasculares micro de 2x, abrazadera 1x fórceps soliciten, sostenedor 1x micro aguja, tijeras de primavera 1x, 1x retractor.
- Un 6-8 semanas de edad hembra C57BL / 6 de ratón se utiliza como un donante de válvula cardíaca pulmonar. Retire el ratón de su jaula y se pesa, y luego practicar la eutanasia con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 200 mg / kg y xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosis.
- Clip de la zona del pecho y coloque el ratón en una posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla. A continuación, realice la toracotomía. Exponer el corazón, hacer un pequeño corte en la aurícula derecha y el ventrículo izquierdo perfundir con hielo salina fría.
- Francamente diseccionar la arteria pulmonar (AP) de la ascendente aorta. Corte la válvula pulmonar (PV), junto con 2 mm manguito de arteria pulmonar. Deseche el resto del corazón.
- Guarde el PV en heparina frío y solución salina (100 unidades / ml). Nota: El PV se puede mantener en la solución durante dos horas antes del trasplante a el corazón del donante.
2. Preparación corazón del donante
- Un 6-8 semanas de edad hembra C57BL / 6 de ratón se utiliza como un donante de corazón. Retire el ratón de su jaula y se pesa, y luego practicar la eutanasia con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 200 mg / kg y xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosis. Este es un procedimiento terminal.
- Clip de la zona del pecho y coloque el ratón en una posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla. A continuación, realice la toracotomía. Francamente separar el corazón, la vena cava inferior (VCI), la vena cava superior (VCS), la aorta ascendente, PA, y la vena pulmonar. Perfundir la VCI con helado salina estéril.
- Ligar el IVC, SVC, y la vena pulmonar con sutura de seda 6-0 a continuación, cortar superior a laligaduras.
- Cortar la aorta y PA con 2 mm manguito.
- Recorta el PV y disponer de ella.
3. Válvula de Trasplante Cardiaco en un donante de corazón
- Inmediatamente después de la etapa 2.5, colocar la válvula de corazón de la etapa 1.5 en el corazón del donante y orientar la válvula de corazón.
- Asegure el PV con una puntada en el lado derecho de la válvula utilizando 10-0 monofilamento en las agujas afiladas y empezar a suturar continuamente con 5-6 puntos de sutura desde el otro lado de la PV.
- Después de terminar el lado delantero, girar el corazón horizontalmente y empezar a suturar la parte trasera de la PV en el corazón del donante.
- Almacenar el corazón en una solución de heparina / solución salina estéril fría. Nota: El corazón del donante se puede mantener en la solución durante dos horas antes de la implantación para el ratón receptor.
4. Heterotópico trasplante cardiaco a un destinatario Ratón
- Un 6-8 semanas de edad hembra C57BL / 6 de ratón se usó como una reciprocidadnatario. Retire el ratón de su jaula y se pesa, y luego anestesiados con cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg y xilazina 10 mg / kg). Ketoprofeno (5 mg / kg) se usa como analgésico preanestesia.
- Después de comprobar el nivel de sedación por la cola pellizcar, cortar el pelo en el pecho y el abdomen. Lubricar los ojos con un ungüento oftálmico estéril y colocar el ratón en una posición de decúbito dorsal sobre una almohadilla. Desinfectar el abdomen con almohadillas de betadine y alcohol. Luego cubra el ratón con un paño estéril y exponer sólo el área de la incisión.
- Hacer una laparotomía de la línea media de la incisión por debajo de la xifoides a la región suprapúbica, e insertar un retractor de auto retención. Envuelva los intestinos en solución salina gasa humedecida. Francamente definir la aorta infrarrenal y la vena cava.
- Coloque dos 6-0 suturas de seda proximal y distal alrededor de la aorta y la vena cava inferior para frenar la circulación sanguínea.
- Coloque el corazón del donante en el lado derecho de la aorta abdominal y la cubrirá con gau estérilze. Hidratar con solución salina.
- Hacer una aortotomía en la aorta abdominal con una aguja de 30 G y extender la abertura con tijeras para el tamaño de la aorta de donantes.
- Realizar un extremo a lado anastomosis utilizando estériles suturas monofilamento 10-0 sobre agujas afiladas. Asegure la aorta del donante con una puntada en el extremo proximal de la abertura en la aorta abdominal y empezar a suturar continuamente con 4-5 puntos de sutura desde el extremo distal de la aorta abdominal.
- Voltear el corazón hacia el lado izquierdo, cubrir con solución salina infundido gasa, y empezar a suturar continuamente con 4-5 puntos de sutura desde el extremo distal de la aorta abdominal.
- Hacer una venotomía en la vena cava inferior usando una aguja de 30 G y extender la abertura con el tamaño de la arteria pulmonar del donante.
- Lleve a cabo el fin de la anastomosis lateral con estériles suturas monofilamento 10-0 sobre agujas afiladas. Asegure el donante PA con una puntada en el extremo proximal de la abertura en la VCI y empezar a suturar continuamente con 4-5 puntos de sutura deel extremo distal de la vena cava inferior. Esta vez, debido a que la aorta es en la forma, asegúrese de que la sutura de la pared izquierda de PA del donante está en el interior de la vena cava inferior.
- Enjuague el lumen de VCI con heparina y solución salina (100 unidades / ml). Cierre la pared de la derecha del donante y el receptor PA IVC mediante la sutura de forma continua hasta el extremo distal.
- Retire la ligadura distal y controlar la hemorragia mediante la aplicación de un agente de hemostato absorbible estéril tópica. Cuando la hemorragia se detiene por completo, retire la sutura proximal y controlar la hemorragia de la misma manera.
- Volver a los intestinos y cerrar la musculatura abdominal y la piel de dos capas usando una sutura monofilamento 6-0 poliamida negro.
- Inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea y colocar el ratón en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica hasta que el ratón es completamente móvil. Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula con ropa de cama de papel. Déle medicina para el dolor (ibuprofeno, 30 mg / kg, el agua potable) durante 48 horas. HacerNo devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía de la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
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Resultados
La Figura 1 ilustra los esquemas de la modelo de trasplante de válvula de corazón usando el trasplante heterotópico de corazón. La válvula de corazón fue cosechada de un corazón de un donante y se implanta en un corazón de un segundo ratón donante. Entonces el corazón con la nueva válvula cardíaca se implanta en el abdomen de un ratón receptor. La figura 2 muestra una ilustración del corazón implantado en el espacio abdominal (A), justo después de trasplante de corazón ...
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Discusión
La tasa de mortalidad de este procedimiento es cercana al 20%, que se debe principalmente a la hemorragia en el lugar de trasplante de PV y anastomosis en la aorta del donante a la aorta abdominal destinatario. En la mayoría de los casos, la tasa de mortalidad disminuye significativamente después de la cirugía 48 horas. Los ratones de supervivencia mostraron fuertes latidos del corazón y el flujo de sangre a través de la PV implantado. Todo el proceso tarda cuatro horas para un cirujano experimentado micro. Tomará aprox...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del NIH (HL098228 SR1) de CKB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscopio | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Femenino | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 semanas |
| Inyección de clorhidrato de ketamina | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Solución estéril de xilacina | Akorn Inc. | NADA # 139-236 | |
| Ketoprofeno | Fort Dodge Salud Animal | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofeno | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparina | Sódica Sálmina Productos farmacéuticos | NDC 25021-400 | |
| Solución salina (Cloruro de sodio estéril al 0.9%) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Inyección de cloruro de sodio al 0,9% | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Ungüento oftálmico de vaselina | Productos veterinarios Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Almohadillas de preparación de yodo | Triad Desechables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Almohadillas de preparación de alcohol | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Aplicadores con punta de algodón | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Tijera | fina FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Pinza | FST | 11018-12 | |
| Pinza de aplicación de pinza | FST | 00072-14 | |
| S& T Pinza vascular | FST | 00396-01 | |
| Tijeras de muelle | FST | 15008-08 | |
| Retractores Colibrí | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Pinza | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Pinza fina | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Pinza | FST | 11251-35 | |
| Tish Portaagujas/ Pinzas | Micrinas | MI1540 | |
| Sutura de Monofilamento de Poliamida Negra, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Para suturar el injerto |
| Sutura de Monofilamento de Poliamida Negra, 6-0 | AROSurgido Instruments | SN-1956 | Para la musculatura y el cierre de la piel |
| Esponjas no tejidas | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Hemostático reabsorbible | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Jeringa | BD 309659 | ||
| 3 ml Jeringa | BD | 309657 | |
| 10 ml Jeringa | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Aguja | BD | 305190 | |
| 25 G 1 pulg., Aguja | BD | 305125 | |
| 30 G 1 pulg., Aguja | BD | 305106 | |
| Circulador de Agua Caliente | Gaymar | TP-700 | |
| Almohadilla Calentadora | Gaymar | TP-22G | |
| Recortadora | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 Ultrasonido de Alta Frecuencia | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | El número de catálogo y el precio se pueden adquirir de los representantes de ventas. |
| Gel de transmisión de ultrasonidos | Parker Laboratories, INC. | 01-02 | |
| Sistema de anestesia de mesa para animales de laboratorio | VetEquip, INC. | ||
| Isoflurano | Baxter | 1001936060 |
Referencias
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- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
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Reimpresiones y permisos
