Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

Lu Chen; Soon-Keat Ooi; Ronald C. Conaway; Joan W. Conaway

doi:10.3791/51720

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Artículo de método

Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

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DOI:

10.3791/51720

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23 de octubre de 2014

Lu Chen¹^,² , Soon-Keat Ooi¹ , Ronald C. Conaway¹^,² , Joan W. Conaway¹^,²

¹Stowers Institute for Medical Research, ²Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Resumen

Complejos remodeladores de cromatina INO80 regulan la dinámica de nucleosomas y la accesibilidad de ADN al catalizar la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Ino80 Humanos constan de 14 subunidades de proteínas incluyendo Ino80, un SNF2-como ATPasa, que sirve tanto como la subunidad catalítica y el andamio para el ensamblaje de los complejos. Funciones de las otras subunidades y los mecanismos por los que contribuyen a la actividad de remodelación de la cromatina del complejo INO80 siguen siendo poco conocidos, en parte debido al desafío de generar subconjuntos INO80 en células humanas o sistemas de expresión heteróloga. Este protocolo JOVE describe un procedimiento que permite la purificación de subcomplexes remodelación de la cromatina INO80 humanos que carecen de una subunidad o un subconjunto de subunidades. N-terminal BANDERA epítopo etiquetados cDNA Ino80 se introducen de manera estable en el riñón embrionario humano (HEK) 293 líneas celulares que utilizan la recombinación mediada por FLP. En el caso de que un subconjunto de subunidades del complejo INO80 es abe borrado, uno expresa las proteínas mutantes Ino80 vez que carecen de la plataforma necesaria para el montaje de esas subunidades. En el caso de una subunidad individual es a agotarse, uno transfecta siRNAs dirigidos a esta subunidad en una línea celular HEK 293 que expresan establemente FLAG etiquetados Ino80 ATPasa. Nuclear extractos se preparan, e inmunoprecipitación FLAG se realiza para enriquecer las fracciones de proteínas que contienen derivados Ino80. Las composiciones de subcomplexes INO80 purificados a continuación, se pueden analizar utilizando métodos tales como la inmunotransferencia, la tinción con plata, y espectrometría de masas. Los subcomplexes INO80 y INO80 generados de acuerdo con este protocolo se pueden analizar posteriormente utilizando diversos ensayos bioquímicos, que se describen en el protocolo JOVE acompaña. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar para los estudios de las propiedades estructurales y funcionales de cualquier remodelación de la cromatina multi-subunidad de mamíferos y en complejos de modificadores.

Introducción

Complejos remodeladores de cromatina familiares SNF2 conservadas evolutivamente son reguladores clave de la organización de la cromatina y la accesibilidad de ADN ^1. Estos complejos de remodelación siempre incluyen una subunidad ATPasa-SNF2 como central, que, en algunos casos, se reúne con diversas proteínas accesorias y forma de múltiples subunidades asambleas macromoleculares. Para estudiar los detalles moleculares del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, es importante para entender las contribuciones de los subconjuntos dados de subunidades y / o estructuras de dominio a las actividades de los complejos. Tales análisis requieren l....