Artículo de método

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

DOI:

10.3791/51721

⸱

25 de octubre de 2014

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos ensayos bioquímicos que se pueden utilizar para caracterizar las enzimas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP por sus capacidades para 1) catalizar el deslizamiento de nucleosomas dependientes de ATP, 2) interactuar con sustratos de nucleosomas y 3) hidrolizar ATP de una manera dependiente de nucleosomas o ADN.

Resumen

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Los miembros de la familia SNF2 de ATPasas a menudo funcionan como componentes de complejos de remodelación de cromatina de múltiples subunidades que regulan la dinámica de los nucleosomas y la accesibilidad del ADN mediante la catalización de la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. La disección bioquímica de las contribuciones de las subunidades individuales de dichos complejos a la reacción de remodelación de la cromatina dependiente de ATP de varios pasos requiere el uso de ensayos que monitoreen la producción de productos de reacción y midan la formación de intermedios de reacción. Este protocolo JOVE describe ensayos que permiten medir las actividades bioquímicas de los complejos o subcomplejos de remodelación de la cromatina que contienen varias combinaciones de subunidades. La remodelación de la cromatina se mide mediante un ensayo deslizante de nucleosoma dependiente de ATP, que monitorea el movimiento de un nucleosoma en una molécula de ADN mediante un método basado en el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). La actividad de unión a nucleosomas se mide mediante el seguimiento de la formación de mononucleosomas unidos a complejos de remodelación utilizando un método similar basado en EMSA, y la actividad de la ATPasa dependiente del ADN o de los nucleosomas se analiza mediante cromatografía en capa fina (TLC) para medir la tasa de conversión de ATP en ADP y fosfato en presencia de ADN o nucleosomas. Usando estos ensayos, se pueden examinar las funciones de las subunidades de un complejo de remodelación de cromatina comparando las actividades del complejo completo con las que carecen de una o más subunidades. El complejo de remodelación de la cromatina humana INO80 se utiliza como ejemplo; Sin embargo, los métodos descritos aquí se pueden adaptar al estudio de otros complejos de remodelación de la cromatina.

Introducción

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Complejos remodeladores de cromatina familia SNF2 incluyen una SNF2 como ATPasa subunidad central de 1,2. Algunos ATPasas función como SNF2 como enzimas de subunidades individuales, mientras que otros funcionan como la subunidad catalítica de complejos de múltiples subunidades más grandes. Dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales cada una de las subunidades de la cromatina complejos remodeladores de contribuir a sus actividades requiere la capacidad de realizar ensayos bioquímicos que diseccionan el proceso de remodelación.

Remodelación nucleosoma dependiente de ATP por el complejo INO80 humana y otras enzimas remodelación de la cromatina puede ser concebido como un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión de la enzima a la remodelación nucleosomas, seguido por la activación de su ADN y / o nucleosoma-ATPasa dependiente, translocación de la enzima sobre el ADN nucleosomal remodelación, y la eventual reposicionamiento de los nucleosomas 1,2. La comprensión de los detalles moleculares de la ATP-dependiente proceso de remodelación de la cromatina requiere disección de la reacción de remodelación en sus pasos individuales y definición de las contribuciones de las subunidades individuales del complejo de remodelación de la cromatina a cada etapa de la reacción. Tales análisis requieren la capacidad de analizar la remodelación nucleosoma y otras actividades utilizando sustratos moleculares definidos in vitro.

En un protocolo JOVE anterior, describimos los procedimientos utilizados para generar complejos remodeladores de cromatina INO80 y subcomplexes con composiciones de subunidades definidas 3. A continuación, presentamos tres ensayos bioquímicos que permiten el análisis cuantitativo de la unión, ADN y-nucleosoma activado ATPasa, y actividades de remodelación de nucleosomas asociados con tales complejos de nucleosomas.

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Protocolo

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1. ATP-dependientes Nucleosome Remodelación ensayos

Para medir las actividades de remodelación nucleosoma dependiente de ATP, inmunopurificado INO80 o subcomplexes INO80 se incuban con ATP y un sustrato mononucleosomal, que contiene un único nucleosoma posicionado en un extremo de un fragmento de ADN de 216 pb, marcado con P 32. Los productos de reacción se someten después a electroforesis en geles de poli-acrilamida nativos.

  1. Para generar el fragmento de ADN marcado con 32P '601', amplificar de pGEM-3Z-601 4 un fragmento de ADN de 216 pb que contiene una secuencia de 601 el posicionamiento de nucleosomas final ubicado, utilizando los oligonucleótidos 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG y 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG como adelante y atrás primers.
    1. Configurar una reacción de PCR 100 l como se describe en la Tabla 1.
    2. Lleve a cabo las reacciones de PCR en un termociclador con el siguiente programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando con 7 min a 72 ° C.
    3. Después de que se terminó la reacción de PCR, eliminar los nucleótidos no incorporados haciendo pasar los productos de reacción dos veces a través de columnas de centrifugado sin nucleasa.
    4. Ejecutar 5 l de producto de PCR purificado en un gel de agarosa al 1,2% para confirmar que la reacción de PCR generó el fragmento de ADN de ~ 216 pb deseado.
    5. Diluir 5 l de producto de PCR purificado de 20 veces, y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. El rendimiento promedio es de ~ 40 ng / l.
    6. Medir la radiactividad de 1 l de producto de PCR purificado en un contador de centelleo. Estimar el etiquetado de eficiencia mediante el cálculo de la cpm / ng. Se espera una reacción de marcado con éxito para producir ~ 15.000 cpm / ng de fragmento de ADN de 601.
  2. Transferencia de células HeLa nucleosomas en el ADN marcado 601 utilizando un método de dilución en serie 5.
    1. Mezclar 2 pmol de32 P-etiquetados 601 fragmento de ADN con 6 g de nucleosomas Hela (preparado como se describe 5) en 50 l de un tampón que contenía NaCl 1,0 M, Tris-HCl 10, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y 1 mM TDT y se incuba a 30 ° C durante 30 min.
    2. Secuencialmente se diluye la mezcla a 0,8 M, 0,6 M y NaCl 0,4 M por dilución con 12,5 l, 20,8 l, y 41,6 l, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y DTT 1 mM, con una incubación de 30 min a 30 ° C después de cada dilución.
    3. Además se diluye la mezcla a 0,2 M y luego a NaCl 0,1 M mediante la adición de 125 l y luego 250 l de la misma solución tampón que contiene 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, y 200 mg / ml de BSA, con una incubación de 30 min a 30 ° C entre las dos últimas diluciones. Almacenar el sustrato mononucleosome a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
  3. Realizar reacciones nucleosoma deslizamiento dependientes de ATP en un volumen total de 10 l. El reaction componentes se enumeran en la Tabla 2. Puesto que la concentración de NaCl óptima para INO80 actividad de remodelación nucleosoma es de ~ 50 mM de NaCl (resultados no publicados), ajustar la concentración total de NaCl en cada reacción a 50 mM, teniendo en cuenta la cantidad de contenido en NaCl preparaciones de nucleosomas y enzima.
    1. Antes de comenzar a configurar los ensayos, emitidos geles poli-acrilamida nativos (18 x 16 cm). Para preparar un solo gel que contiene 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida 37.5: 1), TBE 0,5 x (Tris 45 mM borato, EDTA 1 mM), persulfato de amonio 0,01% (APS), y 0,001% de N, N, N ', N 'tetrametiletilendiamina (TEMED), mezclar los ingredientes enumerados en la Tabla 3. Deje que el gel se polimerice por lo menos durante 2 horas a RT.
    2. Mientras tanto, para que se realice cada reacción, se combinan en un tubo de 1.5 ml con silicona previamente enfriado ~ 20 nM INO80 o subcomplejo INO80 (preparada como se describe 3) con una cantidad de tampón EB100 ( Tabla 4) suficiente para dar un volumen de 4,75 l. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-que quedan en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido.
    3. Establecer un cóctel principal con el resto de los ingredientes, la ampliación por un factor de 'X' (donde X = número total de reacciones 3). La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción de 10 l se enumera en la Tabla 5; la receta debe ampliarse de acuerdo con el número de reacciones a realizar. Mezclar bien tocando el tubo o pipeta hacia arriba y hacia abajo con un Pipetman y hacer girar el tubo durante unos segundos en una microcentrífuga de sobremesa.
    4. Dispensar 5,25 l de cóctel de maestro a cada uno de los tubos de reacción preparada en el paso 1.3.2. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Iniciar las reacciones mediante la transferencia de los tubos de reacción a un baño de 30 ° C o bloque de calor de agua y se incuba durante 2 hr.
    5. Mientras tanto, preparar 'la eliminación de mezcla' cóctel que contiene ADN competidory nucleosomas, la ampliación por un factor de X (X = número total de reacciones + 4). La cantidad de cada ingrediente necesario para preparar 1,5 l de la mezcla para la eliminación de una sola reacción se enumera en la Tabla 6; la receta debe ser ampliado en función del número de ensayos a realizar.
    6. Terminar reacciones mediante la adición de 1,5 l de la mezcla de la eliminación. Mezclar bien, girar hacia abajo, y se incuba a 30 ° C durante 30 min.
    7. Mientras tanto, pre-ejecutar el gel de poliacrilamida nativo en una unidad de electroforesis vertical en 100 V durante 30 min a 4 ° C, utilizando TBE 0.5x como tampón con una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener la circulación de tampón constante.
    8. Para cargar la muestra, añadir 2,5 l de colorante de carga que contiene 3x TBE, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol, y 0,25% de xileno cianol FF. Mezclar bien, girar brevemente las muestras, y la carga en el gel usando puntas de carga.
    9. Correr el gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C con circulación de buffer.
    10. Para detectar la señal, transferir el gel a una pila de dos hojas de papel de filtro. Envuelva el papel de filtro con el gel en la parte superior mediante una envoltura de plástico transparente, y luego exponerlo a una pantalla de fósforo de almacenamiento a 4 ° C durante el tiempo deseado.
    11. Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analizar los datos utilizando un software adecuado.

2. Mononucleosome ensayos de unión

Para ensayar la afinidad de unión de un complejo INO80 dado para mononucleosomes, realice un cambio de movilidad electroforética de ensayo (EMSA) utilizando el sustrato mononucleosomal generada en el paso 1.2.

  1. Configurar la reacción de mezclas para ensayos de unión como se ha descrito para los ensayos de remodelación de nucleosomas, pero omitir la ATP y la eliminación de la mezcla de las reacciones; incubar a 30 ° C durante 30 min.
  2. Añadir 2,5 l de colorante de carga a cada mezcla de reacción, y se aplican a un gel de poliacrilamida nativo que contiene 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37.5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% de APS, 0,001% y TEMED.
  3. El uso de TBE 0.5x como tampón, ejecute el gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C con circulación de tampón y se exponga a una pantalla de fósforo de almacenamiento.

3. ADN y Nucleosoma-ATPasa dependiente Ensayos

Realizar ensayos de ATPasa en las mezclas de reacción 5 l que contenía 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 60 mM, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 Ci de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complejo INO80 o cantidad de complejo INO80 a ensayar establecer tres reacciones paralelas, una memoria intermedia que contiene EB100 para medir ADN o nucleosoma-ATPasa independiente, uno que contiene ADN plásmido circular cerrado (5.000 pb, ~ 30 nM) para medir el ADN ATPasa dependiente, y una que contiene Hela oligonucleosomas (~ 185 nm) para medir-nucleosoma ATPasa dependiente. Configure todas las reacciones en hielo.

  1. Para cada reacción, se combinan 10-50 nm de la INO80 o INO80 subcomplexes inmunopurificados con una cantidad de tampón EB100 suficiente para dar un volumen de 2,2 l en 1,5 ml tubos de microcentrífuga lubricados pre-refrigerados. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido.
  2. Establecer un cóctel maestro. La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción se enumera en la Tabla 7. Escala la receta por la ampliación por un factor de 3 (X + 2) 1, donde X = el número de preparaciones INO80 a ensayar.
  3. Para preparar conteniendo buffer 'sub-cócteles' solamente, ADN, o nucleosomas, dispensan 2.5 (X + 2) l del cocktail master en tres tubos separados. Añadir 0,3 (X + 2) l de cualquiera de EB100, el ADN plásmido circular cerrado (1,5 g / l), o Hela oligonucleosomas (1,5 g / l) y mezclar bien.
  4. Prescindir de 2,8 l de la sub-cóctel apropiado para los tubos de reacción que contienen enzimas con base en St.ep 3.1. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar; evitar la introducción de burbujas.
  5. Para iniciar reacciones, transferir los tubos de reacción a un bloque de calor a 30 ° C.
  6. Después de 5, 15, 30, y 60 min de incubación, detectar 0,5 l de cada mezcla de reacción en una cromatografía de polietilenimina celulosa de capa fina (TLC) placa (20 x 10 cm) en una línea recta al menos 1,5 cm del borde inferior . Devolver inmediatamente tubos de reacción a la 30 ° bloque de calor C por lo que múltiples puntos de tiempo se pueden tomar de un solo tubo. Después de las salpicaduras, seque las placas de TLC utilizando un secador de pelo.
  7. Transferir las placas de TLC a una cámara de vidrio que contiene suficiente fosfato de potasio 0,375 M (pH 3,5) para permitir que la parte inferior 0,5 cm de la placa de TLC se sumergieron en la solución.
  8. Cubra la cámara, y esperar que el frente de la fase líquida alcanza la parte superior de las placas de TLC. Inmediato secar las placas a fondo con un secador de pelo.
  9. Exponga las placas de TLC secas a una pantalla de fósforo de almacenamiento a temperatura ambiente.Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y determinar la cantidad de sustrato ATP radiactivo y producto ADP.
  10. Para calcular la cantidad de ATP hidrolizado, multiplique el ATP% hidrolizado por la cantidad de ATP presente en la mezcla de reacción de partida utilizando la siguiente fórmula: ATP hidrolizado pmol = 10 ATP pmol en el inicio de la reacción x [ADP / (ATP + ADP)]

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Resultados

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Las cifras muestran resultados representativos de ensayos bioquímicos utilizados para caracterizar las actividades INO80, incluyendo nucleosoma deslizamiento (Figura 1) y vinculante (Figura 2) y ensayos de ADN o ATPasa ensayos nucleosomas dependiente (Figura 3).

El experimento mostrado en la Figura 1 compara la capacidad de los complejos de INO80 intactas purificó a través de FLAG-NIF N ° 2 o FLAG-INO80E y de INO80 subcomple...

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Discusión

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Para asegurarse de que la remodelación nucleosoma y actividades de ATPasa se observa en los ensayos dependen de la actividad catalítica de complejos INO80, y no en la contaminación de la remodelación y / o enzimas ATPasa, que nucleosoma ensayo de forma rutinaria la remodelación y la actividad ATPasa de versiones catalíticamente inactivos de Ino80, purificado en en paralelo con el tipo salvaje INO80 utilizando el mismo procedimiento. Una reacción de control negativo que carece de ATP también se debe realizar cuando el en...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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El trabajo en el laboratorio de los autores está respaldado por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM41628) y por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson en la Fundación Comunitaria del Gran Kansas City.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cóctel de inhibidores de proteasa SigmaP8340
10x Tampón de reacción PCR Roche Ciencias Aplicadas 
Roche Taq ADN polimerasaRoche Ciencia aplicada 
Columnas de espín sin nucleasa NucAway AmbionCat. # AM10070
ATP ultrapuro;USB/Affymetrix77241 25 UM
albúmina sérica bovina SigmaA9418 
40% Acrilamida/Bis 37.5:1Amresco0254-500ML
ADN de esperma de salmón sonicado GE Healthcare27-4565-01
persulfato de amonio al 10% (APS)Thermo Scientific17874
benzonasa NovagenCat. Nº 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmolPerkinElmerBLU013Z250UC
PCR termociclador PTC 200MJ ResearchPTC 200
Hoefer unidad de electroforesis vertical HoeferSE600X-15-1.5
tubos de microcentrífuga lubricados de 1,5 ml Costar3207
Pantalla de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics63-0034-79
3MM papel de filtroWhatman 28458-005VWR
Typhoon PhosphorImager GE Healthcare8600
Software ImageQuantHealthcarever2003.02
TLC Placas de vidrio, PEI-Celulosa FMillipore5725-7
Membrana de transferencia Immobilon-FL 7 x 8.4MilliporeIPFL07810
Medidor topográfico de uso general con ventana final o panqueque Sonda GM (Geiger-Mueller)BiodexModelo 14C
1143509400111435094001 GE

Referencias

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