Enfoque Formación: Un análisis basado en células para determinar el potencial oncogénico de un gen

Resumen

El ensayo Focus Formación ofrece un método sencillo para evaluar el potencial de transformación de un oncogén candidato.

Resumen

< clase p = 'jove_content'>La transformación maligna de las células se asocia típicamente con un aumento de la proliferación, pérdida de la inhibición del contacto, adquisición de potencial de crecimiento independiente del anclaje y la capacidad de formar tumores en animales de experimentación¹. En las células NIH 3T3, se sabe que la vía de transducción de señales Ras desencadena muchos de estos eventos, lo que se conoce como transformación Ras. La introducción de un gen sobreexpresado en las células NIH 3T3 puede promover la transformación morfológica y la pérdida de la inhibición del contacto, lo que puede ayudar a determinar el potencial oncogénico de ese gen de interés. Un ensayo que proporciona un método sencillo para evaluar un aspecto del potencial transformador de un oncogén es el ensayo de formación de foco (FFA)². Cuando las células NIH 3T3 se dividen normalmente en cultivo, lo hacen hasta que alcanzan una monocapa confluente. Sin embargo, en presencia de un oncogén sobreexpresado, estas células pueden comenzar a crecer en focos^{densos y} multicapa 1 que se pueden visualizar y cuantificar mediante tinción de cristal violeta o Hema 3. En este artículo describimos el protocolo FFA con transducción retroviral del gen de interés en células NIH 3T3, y cómo cuantificar el número de focos mediante tinción. La transducción retroviral ofrece un método más eficiente de administración de genes que la transfección, y el uso de un retrovirus murino ecotrópico proporciona un control de bioseguridad cuando se trabaja con posibles oncogenes humanos.

Introducción

Las células tumorales se pueden distinguir de sus homólogos normales por una amplia gama de alteraciones, a partir de patrones de expresión génica a epigenomics a cambios morfológicos y proliferativas. Entre estos últimos, la reducción de la dependencia de suero, la pérdida de contacto (densidad) la inhibición, la adquisición de la proliferación independiente de anclaje y, en última instancia, la capacidad de formar tumores cuando se inyectan en animales son útiles, indicadores medibles de la transformación maligna ^3. Varios in vitro y en ensayos in vivo se han desarrollado para la transformación celular. Los ensayos in vitro....

Protocolo

1. Hacer los vectores virales

Las secuencias de codificación para el gen de interés, así como los controles positivos y negativos, se insertan en pBabePuro por los métodos tradicionales de clonación (amplificación por PCR, digestión de restricción y ligadura). Hay cuatro sitios de restricción en el vector donde se puede insertar el ADN: BamHI, SnaBI, EcoRI y SalI.

1. Preparar transfección grado plásmido de ADN a partir de células competentes utilizando el kit de plásmido QIAGEN midi.
2. Medir la concentración de ADN usando un espectrofotómetro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Producción

Resultados

MXD3 es un factor de transcripción de la cremallera de leucina básica hélice-bucle-hélice (bHLHZ) que es un miembro de la MYC / MAX / MAD red. Es un miembro atípico de la familia MAD ^13-15, y se ha informado a participar en la carcinogénesis ^16,17. Cuando se compara con pBabePuro (control negativo) y MYC (control positivo), los platos NIH 3T3 donde se sobreexpresa MXD3 tuvieron significativamente menos focos (Figura 1A). Los datos en la Figura 1B se recogieron a pa.......

Discusión

La FFA proporciona un método rápido y fácil de evaluar la transformación maligna in vitro. Es susceptible a la detección de un número relativamente grande de genes candidatos, y sus requisitos técnicos modestos que sea rentable. Además, dos o más genes pueden ser coexpressed (a veces conocido como un ensayo de la "cooperación") para evaluar el potencial tumorigénico de la combinación. Las ventajas de este ensayo se basan en su técnica sencilla, su facilidad de cuantificación y su relativamente corto t.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vector pBABE-puro	Addgene	Plasmid 1764	vector de clonación
Línea celular de empaquetado retroviral Platinum-E, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	Línea celular RV-101	para producción viral
NIH 3T3 Cell Line 93061524 murina	Sigma-Aldrich		para ensayo de formación de focos
10 ml Jeringa de punta BD Luer-Lok	BD Biosciences		309604 reactivo de producción viral
0,45 μ m Filtro de jeringa Puradisc Whatman		6750-2504	reactivo de producción viral
Polietilenimina (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	reactivo de transfección celular
Polybrene infection / reactivo de transfección	EMD Millipore	TR-1003-G	reactivo de transfección celular
Crystal	Violet Fisher Scientific	C581-25	reactivo de tinción celular
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	purificación de plásmidos
BD Falcon Placas de cultivo de tejidos	BD Biosciences	353003	Suministros para cultivos celulares
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065	medios de cultivo celular
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054 suministros de	cultivo celular
Opti-MEM I medio de suero reducido Gibco		31985-062	medios de cultivo celular
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000-044	medios de cultivo celular