Summary
Små djur avbildningstekniker tillåter seriella diagnostiska undersökningar och terapeutiska ingrepp in vivo. Nyligen har omfattningen av ansökningar väsentligt vidgats och idag omfattar bedömning av kolontumörutveckling, sårläkning och övervakning av inflammation. Detta protokoll illustrerar dessa olika potentiella tillämpningar av murin endoskopi.
Abstract
Musmodeller används ofta för att studera patogenesen av sjukdomar hos människor och utvärdera diagnostiska förfaranden samt terapeutiska ingrepp prekliniskt. Emellertid giltig bedömning av patologiska förändringar kräver ofta histologisk analys, och när det utförs ex vivo, nödvändiggör djurets död. Därför i konventionella experimentella inställningar intraindividuella uppföljande undersökningar är sällan möjligt. Således, utveckling av mus endoskopi i levande möss möjliggör utredare för första gången till både direkt visualisera mag-tarmslemhinnan och även upprepa proceduren för att övervaka för ändringar. Många tillämpningar för in vivo mus endoskopi finns, bland annat studera tarminflammation eller sårläkning, erhålla mucosal biopsier upprepade gånger och att lokalt administrera diagnostiska eller terapeutiska medel med hjälp av miniatyrinjektionskatetrar. Senast har molecular imaging utökad bilddiagnostik modalities möjliggör för detektering av distinkta målmolekyler med specifika fotoprober. Sammanfattningsvis har murina endoskopi vuxit fram som ett nytt spjutspetsteknik för diagnostik experimentella in vivo imaging och kan avsevärt påverka preklinisk forskning inom olika områden.
Introduction
Djurmodeller har berikat vår förståelse av många tarm patologier. Laboratoriet mus (Mus musculus) har vuxit fram som en främsta djurmodell inom biomedicinsk forskning på grund av dess rikliga genetiska och genomisk information och är lätt tillgänglig i transgena och knockout stammar. Förutom att förbättra förståelsen sjukdoms patogenes är djurmodeller också viktigare används för att testa läkemedelskandidater samt prekliniska diagnostiska eller terapeutiska ingrepp. Men trots olika musmodeller härma mänskliga sjukdomar, många diagnostiska och interventionella alternativ som rutinmässigt används inom vården är inte tillgängliga för möss. Därför att övervakningsstrategier övervaka loppet av murina sjukdom eller effekten av terapeutiska interventioner är ofta begränsade till indirekta observationer eller efter slakt analyser. Även icke-invasiva procedurer finnas för övervakning möss vitalitet liknande sjukdomsaktivitetsindex, quantification viktminskning eller vinst, blod, urin och avföring analyser, dessa är bara indirekta indikatorer och är förspända av interindividuell variabilitet. Dessutom post mortem analyser förhindra längsgående iakttagelser vid upprepade tidpunkter. Sofistikerad avbildningstekniker för att övervaka sjukdomsaktivitet i möss har nyligen införts 1,2. Även om dessa avbildningstekniker möjliggör upprepade analyser, de ger bara ett beskrivande och ofta oprecisa syn på tarmen, aktivera inte direkt mucosal visualisering eller tillåta diagnostiska eller terapeutiska ingrepp såsom biopsi förvärv eller aktuell och intramucosal tillämpning av läkemedelskandidater.
Nyligen har högupplösta endoskopiska system för användning i levande möss utvecklats 3,4. För första gången dessa endoskopiska tekniker medger direkt visualisering av endoluminala kolon sjukdoms patologier såsom sårläkning eller tarminflammation som tillhandahåller objektiva, realtidsstatus möjliggör longitudinella studier i samma djur vid upprepade tidpunkter. Bortsett från att ge upprepade biopsier i en individuell mus kan endoskopiska system även användas för att terapeutiskt påverka en distinkt tumör eller lokal inflammation genom att direkt tillämpning av ett ämne till det intressanta området. Dessutom som terapeutiska och kontrollämnen kan levereras direkt till det område av intresse, detta kan utföras i samma mus, exklusive interindividuella variabiliteten. Dessa system har nu varit anställd i bedömningen av kolon inflammation, sårläkning, laparoskopisk leverbiopsi och orthotopic induktion av levertumörer 8 och tumörutveckling med hjälp av olika poängsystem som den murina endoskopisk index för kolit svårighetsgrad (MEICS) 5-7. MEICS består av fem parametrar för att bedöma inflammation: förtjockning av kolonväggen, förändringar i kärlmönster, förekomst av fibrin, granularitet av mucosal ytan och avföring konsistens.
I detta protokoll beskriver vi användandet av stela endoskopi i musmodeller av tarm sårläkning, inflammation och cancer i tjocktarmen. Först visar vi endoskopisk utvärdering av sårläkning och kolon inflammation samt längd bedömning av kolit aktivitet och studiet av cancerogenesis i murina kolon. Bortom den beskrivande användning av mus endoskopi, ger vi detaljerade instruktioner om användningen av endoskopiska instrument för att få biopsier, samt aktuella och intramucosal tillämpning av olika komponenter av intresse (t.ex. läkemedelskandidater eller tumörceller). Slutligen visar vi att använda mus fluorescens endoskopi, som sysselsätter avancerade molekylära avbildningstekniker, i inställningen av kolorektala tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Lande für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) enligt den tyska djurskyddslagen.
1. Material och experimentuppställning
- Djurvård
- Använd kvinnlig eller manlig möss av något stam som väger 20 till 25 g och hysa dem enligt lokal lagstiftning djuromsorg.
- Feed möss med särskild chow för gnagare och tillämpa alfalfa fritt chow minst tre dagar före fluorescens undersökningar för att minimera endoluminal auto-fluorescens.
- Tillhandahålla autoklaverat dricksvatten ad libitum.
- Induktion av akut DSS-inducerad kolit
- Bered en 3% (vikt / vol) dextransulfat natrium (DSS, molekylvikt: 36,000-50,000 Da) lösning genom upplösning av 3 g av DSS i 100 ml autoklaveras vatten. Erbjuda denna lösning som exklusiv dricksvatten till möss efter behag och beräkna 5 ml DSS-lösning per mus / dag. Feed fortsrol möss med autoklaverat vatten utan DSS ad libitum 9.
- Induktion av kolorektal cancer
- Lös mutagen azoximetan (AOM) (VARNING! Kan orsaka cancer och genetiska skador!) I steril isotonisk saltlösning för att erhålla en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Applicera en enda dos av 10 mg AOM per kg kroppsvikt intraperitonealt med hjälp av en 1 ml spruta (30 G) 10.
- Challenge möss (exklusive kontrollmöss) med upprepade cykler av 3% (vikt / volym) DSS från dag 0 till 7, dag 14 till 21, dag 28-35 och dag 42 till 49 för att framkalla inflammatoriska driven kolorektal cancerogenesis. Feed möss med autoklaveras vatten endast mellan dessa utmaningar (se figur 4A för en detaljerad tidsplan). Feed kontrollmöss med autoklaveras vatten under hela experimentet.
- Beredning av fluorescens endoskopi (FE)
- Använd Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) - dextran (molekylvikt 70.000 Da, FITC: Glukos = 1: 250) för deteInsatser av kolonadenom genom visuell förstärkning av dysplasi tillhörande kärlmönster.
- Administrera 60 mg FITC-konjugerat dextran utspätt i 100 l PBS intravenöst 5 min före fluorescens endoskopisk undersökning.
- Anestesi
- Tillhandahålla kontinuerlig isofluran försörjningen för anestesi (1,5 LO 2 / min; 1,5-2 vol% isofluran [2-klor-2-(difluormetoxi) -1,1,1-trifluor-etan]). Använd speciell veterinäranestesiutrustning med en ansiktsmask för att tätt styra anestesi.
- Beredning av lavemang
- Ingjuta 2 ml vätska lavemang (innehåll: dinatriumvätefosfat 1,5% (vikt / volym) och natriumdivätefosfat 11% (vikt / volym)) i tjocktarmen vid misstanke betydande fekal lastning som kan skymma utsikten.
2 Teknisk utrustning
- Använd en veterinär endoskopisk arbetsstation som är utvecklad och godkänd för användning av små djur endoskopi. Anslut workstation till en kameraenhet, en xenon ljuskälla, en luftpump och en vanlig datorskärm för vitt ljus endoskopi. Anslut sedan kameran och miniatyr stela teleskopet (1,9 mm ytterdiameter, 10 cm längd, Figur 5).
- Använd endoskop slida med arbetskanalen (Figur 5D) för tillämpningen av biopsitänger eller insprutningsröret. Använd fodralet utan arbetskanal för diagnostisk koloskopi.
- Konfigurera inställningarna för ljuskälla för fluorescens endoskopi för att excitera begagnade spårämnen (t.ex. 490 nm för FITC-konjugerat dextran). Dessutom integrerar ett lämpligt bandpassfilter mellan teleskopet och kameran (t.ex. 525 nm för FITC-konjugerat dextran).
- Sätt flexibla biopsitänger (3 Charr., 28 cm) genom arbetskanalen av endoskopet för att få biopsier.
- Införa flexibla insprutningsröret (0,96 mm) genom arbetskanalen för lokal, intramucosal eller endoluminal endministration av diagnostiska eller terapeutiska medel.
- Använd en uppvärmbar undersökningsbord med en temperatur på 42 ° C. Detta förhindrar att möss blir hypotermi vid undersökningen.
3 Anestesi av djur
- Placera musen i en liten men tät låda och administrera isofluran (100% (v / v), 5 vol%, 3 L / min). Vänta tills musen förlorar medvetandet.
- Överför musen på undersökningsbord för endoskopi. Fortsätt isofluran inandning via ansiktsmask med en dos 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Applicera alltid ögonsalva att förhindra torra ögon under anestesi.
- Utvärdera effekten av anestesi genom att kontrollera reflexer. Kontrollera "vända reflex ': om tillräckligt nedsövd, bör en mus om på rygg inte vända. Kontrollera "tårna reflex ': När bedövningen är tillräcklig, mjuk klämma in mellan djurets tår bör inte leda till en återkallelse av benet (etappen avkirurgisk tolerans).
4. koloskopi
- Lägg sövda mus liggande / på rygg på undersökningsbordet.
- Administrera 2 ml lavemang via knäppt kanyl in i tjocktarmen, om man misstänker betydande fekal belastning som kan skymma utsikten. Vänta möss för att uträtta sina behov efter administrering av lavemang. Sätt endoskopet mycket noga för att undvika perforering.
- Öppna båda ventilerna av manteln med en av dem är ansluten till luftpumpen. Täta andra ventilen med pekfingret för att fördela luften. Blås kolon med luft, långsamt och försiktigt, särskilt i fall av biopsi eller injektion.
- Advance endoskopet endast så långt som det högra kolon böjning för att undvika perforering (4-5 cm från anus).
- Diagnostisk koloskopi
- Undersök slemhinnan för inflammatoriska eller maligna förändringar samtidigt som du drar tillbaka endoskopet. Dra tillbaka långsamt för att bedöma hela omkretsen av tarmen. Bedöm intraluminala pathologies med lämpliga etablerade poängsystem efter behov.
- För att motivera identiska endoskopisk läge för bildtagning under repetitiva visualiseringar av lindade områden, notera avståndet mellan murina anus och mucosal lesion. Dessutom använder spetsen på biopsitång som ett distanselement för att uppnå identiska avstånd mellan endoskopet och sårområdet under bilden förvärvet. Såret storlek är relaterad till storleken av endoskopet mantel, vilken innefattar 3 mm.
OBS: Placera endoskop i samma position genom optisk jämförelse med fotodokumentation av tidigare undersökningar. Mät lesioner i samma vinkel och avstånd vid varje uppföljnings endoskopisk undersökning.
- Biopsi förfarande
- Ta biopsier med hjälp av två utredare. Presentera de biopsitänger försiktigt genom arbetskanalen tills spetsen av tången syns på bildskärmen till den andra utredare. Öppna och stäng pincett försiktigt till envoid perforering.
- Flytta pincett till platsen för patologi.
- Injektion förfarande
- Utför injektionen med hjälp av två utredare. Pre-fill flexibelt insprutningsröret (0,96 mm) helt med medel som skall administreras. Skjut röret genom arbetskanalen tills kanylen (30 G) syns på bildskärmen till den andra utredare. Förbered den fina sprutan och försiktigt administrera det begärda beloppet för diagnostiskt eller terapeutiskt medel. Injektionsvolymerna bör vara 50 ^ maximum.
- Stick in nålen i submocosa i en vinkel på 15-30 grader. Face avfasning i riktning mot slemhinnan. Slemhinnan visar en karakteristisk lyfttecken efter lyckad injektion.
- Fluorescens endoskopi (FE)
- Administrera 60 mg FITC-konjugerat dextran utspätt i 100 l PBS intravenöst före fluorescens endoskopisk undersökning.
- Kontrollera den optimala tidpunkten mellan injektion avfluorescerande märkt spårämne och avbildningsförfarande som är beroende av spårämne farmakologi. Konfigurera inställningarna för bandpassfilter-system i enlighet med excitation och emissionsvåglängd av spårämnet som används. Utför fluorescens endoskopi för icke-specifika blodvolymspårämnen (t ex FITC) omedelbart efter intravenös injektion av det fluorescerande färgämnet för att bedöma vaskulär mönster av slemhinneytan.
- Överväg avbildning flera timmar efter spår tillämpning vid riktade spårämnen eller smarta prober "för att ge en bättre target bakgrund-förhållande.
- Utför foto- och video-dokumentation av resultaten.
5. Post koloskopi
- Separera den mus i en ledig bur och lägga den på en pappershandduk för att skydda mus från aspire kullen. Värm musen med en redlight lampa för att förhindra hypotermi. Följ musen och lämna inte utan uppsikt tills den har återfått tillräckligtmedvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. En gång helt medvetet placerar musen tillbaka till sin respektive bur.
- Vid slutet av experimentet, plats mus i en liten men tät låda och administrera CO 2 (100% (volym / volym), 100 vol%, 3 L / min). Vänta tills musen förlorar hela medvetandet och slutar andas. Dispatch mus med nackfraktur. Utför abdominal laparotomi och explantera kolon. Öppna kolon längdled och tvätta den för vidare histologisk eller molekylär utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo övervakning av intestinal sårläkning
Under rutin endoskopi, var mucosal sår inducerade mekaniskt genom miniatyrbiopsitång med en diameter på 3 French (motsvarar 1 mm; Figur 1A). Därefter blev sårläkning övervakas av dagliga endoskopiska undersökningar och kvantifieras genom mätning av rest sårområdet med hjälp av bildbehandlingsprogram, t.ex. ImageJ (Figur 1B). Individen sårtillslutning över tiden uttrycks genom kvoten av faktisk sårområdet / initial sårområdet. Till exempel, på dag 3 efter lindas generation, var 41% ± 4,1% av sårområdet återvinnas, medan vid dag 7 såret var oftast helt läkt (Figur 1C). Dessutom, vid slutet av experimentet, sår kan resekeras för histologisk utvärdering ex vivo. Avbildad är representativa bilder av hematoxylin och eosin (H & E) -stained lindade sängar på day 0 och dag 5 (Figur 1D).
Endoskopi styrd intramucosal injektion terapi
För intramucosal tillämpning av farmakologiska medel, blev ett flexibelt rör (diameter 0,96 mm) med en kanyl fastsatt vid änden (30 G) introducerades till arbetskanal hos endoskopet (Figur 2A). Efter intramucosal placering av nålen, var högst 50 ^ noggrant injiceras. Indikerar lyckad intramucosal ansökan, kan häva kolonmukosa lätt observeras makroskopiskt (Figur 2B, C).
In vivo utvärdering av experimentell kolit
Efter induktion av kolit, möss uppvisade viktförlust från dag 3 med maximal förlust av kroppsvikt på 19% uppträder vid dag 7 (figur 3A). Förutom daglig mätning av kroppsvikten var sjukdomsaktivitet övervakas av repetitiva endoskopier och makroskopisk kvantifiering av inflammation genom den murina endoskopisk index för kolit svårighetsgrad (MEICS). I enlighet med en förlust av kroppsvikt, var MEICS Poängen ökade på dag 7 efter DSS start indikerar en massiv inflammatorisk skada på kolonslemhinnan, som lindras vid dag 13 (figur 3B). För ex vivo korrelation av histologiska skador, var inflammatoriska förändringar av kolon H & E-färgade snitt kvantifieras enligt Dieleman Score 11. Vid dag 7 efter DSS start, var histologiska skador signifikant högre i DSS-behandlade möss jämfört med kontroller som återspeglas av epitelial denudation ades mucosal sår samt ökad neutrofil infiltration och avsevärt förbättrat vid dag 13 (figur 3C, E). Dessutom histologisk utvärdering av slemhinnor biopsier, rutinmässigt som erhållits under endoskopiska undersökningar, bekräftas den långt gångna kolit på dag 7 (Figur 3F-H).
Cirka 80 dagar efter tumörinduktion genom AOM och tre cykler av DSS (Figur 4A), flertal colonic tumörer (Figur 4C) samt makroskopiska tecken på kronisk inflammation såsom granulerad slemhinna (figur 4B) 10 observerades endoskopiskt. Histologisk utvärdering av kolorektala tumörer av H & E-färgning avslöjade adenom med och utan höggradig intraepitelial neoplasi. Därför liknar AOM-DSS-modellen en perfekt modell för att studera molekylära processer av cancer 12, samt att utvärdera nya diagnostiska enheter 13. Fluorescens avbildning inriktning specifika molekyler gör in vivo molecular imaging med "fotografiska metoder '14,15. För att demonstrera genomförbarheten av FE, använde vi FITC, en allmänt använd fluorokrom. För specifik FITC upptäckt, ett bandpassfilter-system i kombination med light källa förutsatt specifik excitationsvåglängd behövs (490 nm, Figur 4D). För noggrann detektering av FITC-specifik emissionsvåglängd (525 nm), var ett andra bandpassfilter placerat mellan kamerahuvudet och endoskopet (Figur 4E). FE utan spår ansökan upptäckte inte någon specifik signal och ingen interaktion med kolonvävnad eller fekal autofluorescens (Figur 4F, G). Däremot omedelbart efter intravenös applicering av FITC-dextran, fluorokromen kunde observeras vid kolonslemhinnan och kan användas för bedömning av ökad kärlteckning i regioner med kronisk inflammation (figur 4H) samt malignt slemhinna (Figur 4I). Följaktligen kvantifiering av fluorescensintensiteten med ett bildredigeringsprogram visade signifikant ökat upptag av fluorokromen inom malign vävnad jämfört med icke-påverkade kolonslemhinna (Figur 4K).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 1 Endoskopisk övervakning av epitel sårläkning in vivo samt kvantitativ och histologisk utvärdering av sårläkning. Efter generering av kolon sår, sår gränsen och sårtillslutning lätt kan upptäckas. Sårområdet (vita pilar) bedöms under dagliga uppföljnings endoskopier att kvantitativt följa epitelial sårläkning (A - C) Ex vivo, har sår opererande och H & E-färgade för histologisk analys av sårläkning (D).. Vågar definieras av avbildas skal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
re 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2 Endoskopi styrd intramucosal injektion terapi. Under visuell kontroll är nålspetsen (A) slappt placeras i kolonslemhinnan och 50 ul av lösta ämnen injiceras (B). Därefter kan markeras mucosal lyft erkännas (asterisk) utan några tecken på akut blödning (C). Vågar definieras av avbildas skal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Endoskopisk utvärdering av kursen i experimentell DSS kolit. Förloppet kolit var att utvärderad av förändringar i kroppsvikt, endoskopiska undersökningar samt histologiska analysen av inflammerade kolon avsnitt och endoskopiska biopsier. I linje med omfattande förluster av kroppsvikt och avancerad histologiska skador på dag 7 (A, C, E, förstoring 10X), endoskopiska undersökningar och histologisk utvärdering av erhållna biopsier avbildade tecken på allvarlig inflammation (B, D, G, H, förstoring 5X och 10X), medan på dag 13 efter DSS starta inflammatoriska förändringar signifikant förbättras. Vågar definieras av avbildas skal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 FE av kolorektala tumörer. Efter induktion av kolorektal cancerogenesis med AOM och cykliska DSS administration för 11 veckor (A), vitt ljus endoskopi upptäckts granulerad mukosa indikerar kronisk kolit (B) och många endoluminala lesioner (C), som diagnostiserades som adenom med höggradig intraepitelial neoplasi av H & E-färgning ex vivo (G). Även visualisering av kronisk inflammation (H) och tumörer (I) var lätt möjligt med hjälp av FE riktade FITC, FE utan spår ansökan tillät inte definitiva tumördetektion (F, G). Följaktligen kvantifiering av fluorescensintensiteten ökade signifikant i malign vävnad jämfört med icke-drabbade kolonslemhinna, visas av gråskala profiler (E, F). Växla till fluorescens-läge under vitt ljus colonoscopy, är en särskild bandpassfilter dessutom ansluten till kalljuskällan att lämna särskild excitationsvåglängd (t.ex. 490 nm för FITC, D). Detta filter underlättar växling (vit pil) mellan vitt ljus och fluorescens lägen (D). För att fånga den specifika emissionsvåglängd (t.ex. 525 nm för FITC), ett andra bandpassfilter är placerat mellan endoskopet och kamerahuvud med hjälp av en bajonettkoppling (E). Vågar definieras av avbildas skal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Försöksuppställning för endoskopisk arbetsstationen. Den endoskopiska arbetsstation (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitelial sårläkning är en pågående process. Kontinuerlig fysiologisk exfoliering av ytliga celler i mag-tarmslemhinnan inträffar som kräver frekvent regenerering av epitelceller 16. Följaktligen har försämrad sårläkning en enorm inverkan på flera sjukdomar, inklusive gastrointestinala sår och 17 anastomotic läckage 18. Utvärdering av molekylär bakgrund samt potentiella läkemedelskandidater för att stimulera epitelial läkning får endast ofullständigt utföras i cellodlingssystem in vitro 19,20. Således är mer sofistikerade experimentella uppställningar såsom mus koloskopi med generation av definierade slemhinnor sår av en biopsitänger behövs för att tillförlitligt in vivo utvärdering av gastrointestinal sårläkning och för att bedöma möjliga interaktioner mellan tarminflammation och sårläkning processer.
Dessutom kan en injektionsnål användas för lOCAL intramucosal administration av diagnostiska färgämnen eller potentiella läkemedelskandidater. Detta kan uppnås med användning av ett flexibelt rör (diameter 0,96 mm) med en nål fäst vid änden kan införas genom arbetskanalen. Med tanke på att ett testmedel samt kontroll placebo kan levereras i separata inflammatoriska eller neoplastiska skador inom samma djur, ger denna metod en fördel i tillförlitlighet jämfört med traditionella experimentella inställningar. Ytterligare en tillämpning av lokala injektioner är implantation av humana eller murina tumörceller att generera orthotopic tumörer i murina kolon 21.
Murina modeller av kolit behövs för att klarlägga patofysiologi samt att utvärdera potentiella terapeutiska medel prekliniskt. Därför är av yttersta vikt noggrann övervakning av sjukdomsförloppet. Konventionellt, är svårighetsgraden av sjukdomen vanligen bedömas genom indirekta parametrar såsom kroppsvikt, haemoccult testning samt analysav blod och avföring. Däremot är direkt bestämning av kolit svårighetsgrad ofta begränsade till histologisk analys efter slakt, vilket kräver att djuret dör. Dock erbjuder murin koloskopi en direkt visualisering av kolonslemhinna av levande möss. Dessutom är direkt och upprepad övervakning av funktioner i kolit möjligt, vilket är en förutsättning i experimentella modeller med inhomogen sjukdomsdebut, t.ex. IL-10 brist möss eller i modellen av transfercolitis i RAG-brist möss. Följaktligen har en mus endoskopisk index för kolit etablerats 6 som möjliggör objektiv kvantifiering av mucosal inflammation och serie uppföljande undersökningar av samma djur.
I samband med kolorektal cancer, erbjuder koloskopi olika välgörande möjligheter. Till exempel, i motsats till icke-invasiva metoder, är endoskopi den första metoden för att tillåta in vivo-bestämning av tumörstorlekoch tumör nummer. Vidare användning av fluorescerande fotoprober riktar specifika molekyler möjliggör visualisering och kvantifiering av molekylära processer. I en translationell studie utförd av Foersch et al. särskild inriktning på VEGF uttryck inom malign kolonslemhinna visade sig vara genomförbara och kan användas för karakterisering och prediktion av behandlingssvar hos människor med kolorektal cancer 22. Dessutom kan information som följer av detta molekylära avbildningsteknik kunna översättas för att användas i mänskliga patienter. Detta skulle möjliggöra levande karakterisering av misstänkta lesioner under endoskopi. Slutligen så kallade "smarta sonder" ökad specificitet dessa spårämnen genom aktivering av fluoroforema genom enzymatiska processer vid sidan av riktade lesionen 23.
När du utför mus endoskopi, vissa steg i givet protokoll är särskilt kritisk. Till exempel olika mostammar använder skiljer sig i sin känslighet för anestesi och DSS koncentrationer. Därför detta protokoll kan krävas för att anpassas till lokala inställningar. Vidare är erfarenhet av att utföra endoskopiska undersökningar och exakt kunskap om mus anatomi krävs för att utföra optimal mus endoskopi som är säker och målinriktat. När det gäller eventuella begränsningar av denna teknik, markerar vi att endoskopet system som används är stel, därför begränsa förfarandet till kolon så långt som den högra fotled. Dessutom är de flesta fluorokromer gäller för FE närvarande utvärderas om sina säkerhetsprofiler och därmed samtidigt för murina studier ännu inte är godkända för användning i mänskliga patienter.
Följande är kritiska steg som gäller de praktiska förfarandet: (1), eftersom känsligheten för DSS-inducerad kolit kan variera mellan olika stammar, kan induktionen av akut DSS kolit riskerar döden av djur om det finns advserad svårighetsgrad av kolit. Därför anser utvärdera flera DSS koncentrationer för att identifiera de mest lämpade för en enskild stam och den specifika DSS batch används. Endoskopisk undersökning kan vara svårt i närvaro av stora intrakolonisk avföringsmassor. Induktion avföring innan proceduren med rektal applicering av 2 ml lavemang vätska via knäppt kanyl kommer att förbättra sikten vid misstanke betydande fekal belastning som kan skymma utsikten. Om höga perforerings priser under biopsi inträffar, minska lufttillförseln in i tjocktarmen innan erhålla mucosal biopsier och minska trycket från biopsitänger på slemhinneytan före stängning grenarna.
Tagna tillsammans, i motsats till konventionella metoder för bedömning av sjukdomsaktivitet av experimentell kolit eller cancerogenesis genom indirekta parametrar såsom kroppsvikt, förekomst av fekalt blod, analys av perifert blod eller post mortem histologisk analys, slutoscopy baserade tekniker möjliggör live-övervakning av sjukdomsförlopp med möjlighet att utföra biopsier under visuell kontroll. Dessutom sårläkning och terapeutiska effekterna av topiskt applicerade läkemedelskandidater kan utvärderas in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Sonja Dufentester och Elke Weber för teknisk experthjälp. Vi tackar Faekah Gohar för korrekturläsning av manuskriptet och Stefan Brückner för medicinsk informatik support. Detta arbete stöddes av ett tvärvetenskapligt anslag från Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth fick stöd av ett forskningsstipendium från Medicinska fakulteten, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner fick stöd av ett "Gerok" rotationsläge Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Vi tackar Heike Blum för illustration av tecknad mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al.
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H.
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
