Summary
Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.
Abstract
Los modelos de ratón se utilizan ampliamente para estudiar la patogénesis de las enfermedades humanas y para evaluar los procedimientos de diagnóstico, así como las intervenciones terapéuticas preclínica. Sin embargo, la evaluación válida de alteraciones patológicas a menudo requiere el análisis histológico, y cuando se realiza ex vivo, requiere la muerte del animal. Por lo tanto en entornos experimentales convencionales, los exámenes de seguimiento intra-individuales son raramente posible. Así, el desarrollo de la endoscopia murino en ratones vivo permite a los investigadores por primera vez tanto a visualizar directamente la mucosa gastrointestinal y también repetir el procedimiento de supervisión para las alteraciones. Existen numerosas aplicaciones para la endoscopia murino in vivo, incluyendo el estudio de la inflamación intestinal o la cicatrización de heridas, la obtención de biopsias de la mucosa en varias ocasiones, y para administrar localmente agentes de diagnóstico o terapéuticos que utilizan catéteres de inyección en miniatura. Más recientemente, la imagen molecular se ha extendido mo de diagnóstico por imágenesdalidades que permiten la detección específica de moléculas diana diferentes utilizando fotosondas específicos. En conclusión, la endoscopia murino se ha convertido en una novedosa tecnología de vanguardia para el diagnóstico experimental de imágenes in vivo y puede tener un impacto significativo en la investigación preclínica en diversos campos.
Introduction
Los modelos animales han enriquecido enormemente nuestra comprensión de numerosas patologías intestinales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) se ha convertido en un modelo animal de primera en la investigación biomédica, debido a su abundante información genética y genómica y es fácilmente disponible en cepas transgénicas y knockout. Además de mejorar la comprensión patogénesis de la enfermedad, los modelos animales se utilizan también importante para probar los fármacos candidatos, así como las intervenciones diagnósticas o terapéuticas preclínicos. Sin embargo, a pesar de la variedad de modelos de ratones que imitan las enfermedades humanas, muchas opciones de diagnóstico y de intervención que se utilizan de forma rutinaria en la atención al paciente no están disponibles para los ratones. En consecuencia, las estrategias de vigilancia para monitorear el curso de la enfermedad murino o el efecto de las intervenciones terapéuticas a menudo se limitan a observaciones indirectas o análisis post mortem. Si bien existen procedimientos no invasivos para los ratones de vigilancia vitalidad como índices de actividad de la enfermedad, quantification de la pérdida o ganancia de peso, la sangre, la orina y las heces análisis, estos son sólo indicadores indirectos y están sesgadas por la variabilidad interindividual. Además, los análisis post mortem prevenir observaciones longitudinales en puntos de tiempo repetitivos. Sofisticadas técnicas de imagen para monitorear actividad de la enfermedad en ratones han sido recientemente introducido 1,2. Aunque estas técnicas de imagen permiten el análisis repetitivos, que sólo proporcionan una visión descriptiva y, a menudo impreciso en el intestino, no permitir la visualización directa de la mucosa o permitir las intervenciones diagnósticas o terapéuticas, tales como la adquisición de la biopsia o la aplicación tópica y intramucosa de los fármacos candidatos.
Recientemente, los sistemas endoscópicos de alta resolución para uso en ratones vivos se han desarrollado 3,4. Por primera vez estas técnicas endoscópicas permiten la visualización directa de las patologías de la enfermedad del colon endoluminales tales como la curación de heridas o inflamación intestinal proporcionar objestado reflexivo, en tiempo real permitiendo estudios longitudinales en el mismo animal en puntos de tiempo repetitivos. Aparte de permitir biopsias repetidas en un ratón individual, sistemas endoscópicos también se pueden utilizar para influir terapéuticamente de un tumor distinto o inflamación localizada al permitir la aplicación directa de una sustancia para el área de interés. Además, como sustancias terapéuticas y de control pueden ser entregados directamente a la zona de interés, esto se puede realizar en el mismo ratón, con exclusión de la variabilidad inter-individual. Estos sistemas ahora se han empleado para la evaluación de la inflamación del colon, curación de heridas, biopsias de hígado ortotópico laparoscópicos y la inducción de tumores hepáticos 8 y el desarrollo del tumor usando varios sistemas de puntuación tales como el índice endoscópica murino de gravedad de la colitis (MEICS) 5-7. MEICS consta de cinco parámetros para evaluar la inflamación: engrosamiento de la pared del colon, los cambios del patrón vascular, presencia de fibrina, la granularidad de los mucosal de la superficie, y la consistencia de heces.
En este protocolo se describe el uso de la endoscopia rígida en modelos murinos de cicatrización de la herida intestinal, inflamación y cáncer de colon. En primer lugar, se demuestra la evaluación endoscópica de la curación de heridas y la inflamación colónica así como la evaluación longitudinal de la actividad de la colitis y el estudio de carcinogénesis en el colon murino. Más allá del uso descriptivo de la endoscopia murino, se proporcionan instrucciones detalladas sobre el uso de instrumentación endoscópica para obtener biopsias, y la aplicación tópica y intramucosa de diferentes componentes de interés (por ejemplo, fármacos candidatos o células tumorales). Por último, demostrar el uso de la endoscopia de fluorescencia murino, que emplea sofisticadas técnicas de imagen molecular, en el entorno de los tumores colorrectales.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) de acuerdo con la Ley de Protección Animal alemán.
1. Materiales y Configuración Experimental
- Cuidado de los animales
- Utilice femenino o ratones machos de cualquier cepa que pesa de 20 a 25 g y alojarlos según la legislación local de cuidado de animales.
- Alimente ratones con Chow especial para roedores y aplicar chow-alfalfa libre de por lo menos tres días antes de la fluorescencia exámenes para minimizar endoluminal autofluorescencia.
- Proporcionar autoclave beber agua ad libitum.
- La inducción de la colitis inducida por DSS aguda
- Preparar un 3% (w / v) de sulfato de dextrano sódico (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) solución disolviendo 3 g de DSS en 100 ml de agua en autoclave. Ofrecer esta solución ya que el agua potable exclusivo de ratones ad libitum y calcular 5 ml de solución de DSS-por ratón / día. RSS contratones rol con agua tratada en autoclave sin DSS ad libitum 9.
- La inducción de cáncer colorrectal
- Disolver azoximetano mutagénico (OMA) (PRECAUCIÓN Puede provocar cáncer y daños genéticos!) En solución salina isotónica estéril para obtener una concentración final de 1 mg / ml. Aplicar una dosis única de 10 mg AOM por kg de peso corporal por vía intraperitoneal usando una jeringa de 1 ml (30 G) 10.
- Ratones reto (con exclusión de los ratones de control) con ciclos repetitivos de 3% (w / v) DSS desde el día 0 a 7, 14 a 21 días, el día 28 a 35 y de 42 a 49 días para inducir inflamatoria con la carcinogénesis colorrectal. Alimente los ratones con agua tratada en autoclave solamente entre estos desafíos (véase la figura 4A para un calendario detallado). Alimente los ratones de control con agua tratada en autoclave durante todo el experimento.
- Preparación de la endoscopia de fluorescencia (FE)
- Uso de fluoresceína-Isothiocyanat (FITC) - dextrano (peso molecular 70.000 Da; FITC: Glucosa = 1: 250) para detección de adenoma de colon por realce visual de la displasia asociada patrón vascular.
- Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa 5 minutos antes de un examen endoscópico de fluorescencia.
- Anestesia
- Proporcionar un suministro continuo para la anestesia de isoflurano (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% en volumen de isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Utilice un equipo especial de anestesia veterinaria con una mascarilla para controlar estrechamente la anestesia.
- Preparación de enema
- Inculcar 2 ml de enema líquido (contenido: hidrogenofosfato disódico 1,5% (w / v) y dihidrogenofosfato de sodio 11% (w / v)) en el colon si se sospecha de carga fecal significativa que puede ocultar la vista.
2. Equipo técnico
- Utilice una estación de trabajo endoscópica veterinaria que se elaboró y aprobó el uso de la endoscopia pequeño animal. Conecte el workstation a una unidad de cámara, una fuente de luz de xenón, una bomba de aire y a un monitor de PC convencional para la luz blanca de la endoscopia. A continuación, conecte la cámara y el telescopio rígido miniatura (1,9 mm de diámetro exterior, 10 cm de longitud; la Figura 5).
- Utilice funda de endoscopio con canal de trabajo (Figura 5D) para la aplicación de fórceps de biopsia o tubo de inyección. Utilice la vaina sin canal de trabajo para colonoscopia diagnóstica.
- Configurar los ajustes de la fuente de luz para la endoscopia de fluorescencia para excitar trazadores utilizados (por ejemplo, 490 nm para el dextrano conjugado con FITC). Además, integrar un filtro de paso de banda adecuado entre el telescopio y la cámara (por ejemplo, 525 nm para el dextrano conjugado con FITC).
- Inserte las pinzas de biopsia flexibles (3 Charr., 28 cm) a través del canal de trabajo del endoscopio para obtener biopsias.
- Introducir el tubo flexible de inyección (0,96 mm) a través del canal de trabajo para la administración tópica, intramucoso o endoluminal undministración de agentes de diagnóstico o terapéuticos.
- Utilice una mesa de examen que se puede calentar con una temperatura de 42 ° C. Esto evita que los ratones hipotermia durante el examen.
3. Anestesia de Animales
- Coloque el ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar isoflurano (100% (v / v), 5% en volumen, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento.
- Transferir el ratón sobre la mesa de examen para la endoscopia. Continuar la inhalación de isoflurano a través de la máscara de cara con una dosis de 100% v / v, 1,5% en volumen, 1,5 L / min. Siempre aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad ocular, mientras que bajo anestesia.
- Evaluar la eficacia de la anestesia mediante la comprobación de los reflejos. Compruebe la 'vuelta alrededor reflex': si anestesiado suficientemente, un ratón que se en la espalda no debe dar la vuelta. Compruebe los dedos de los pies 'reflejo': cuando la anestesia es adecuada, suave pellizco entre los dedos de los animales no debe llevar a la retirada de la pata (etapa detolerancia quirúrgica).
4. Colonoscopia
- Coloque ratón anestesiado propensa / en la espalda a la mesa de examen.
- Administrar 2 ml de enema mediante una cánula abotonado en el colon si se sospecha de la carga fecal significativa que puede dificultar la visión. Espere a que los ratones que defecan después de administrar el enema. Inserte el endoscopio con mucho cuidado para evitar la perforación.
- Abra las dos válvulas de la funda con uno de ellos está conectado a la bomba de aire. Selle la otra válvula con su dedo índice para prescindir de aire. Inflar colon con aire, lenta y cuidadosamente, sobre todo en el caso de la biopsia o la inyección.
- Avanzar endoscopio sólo hasta la flexura del colon derecho a evitar la perforación (4-5 cm del ano).
- Colonoscopia diagnóstica
- Examinar la mucosa de las alteraciones inflamatorias o malignas, mientras que tirando hacia atrás el endoscopio. Tire hacia atrás lentamente para evaluar toda la circunferencia del intestino. Evaluar pa intraluminalthologies utilizando los sistemas de puntuación establecidos apropiadas según sea necesario.
- Para justificar la posición endoscópica idéntico para la adquisición de imágenes durante visualizaciones repetitivos de las áreas de la herida, tenga en cuenta la distancia entre el ano murino y la lesión de la mucosa. Además, el uso de la punta de las pinzas de biopsia como un espaciador para lograr distancia idéntica entre el endoscopio y el área de la herida durante la adquisición de imagen. El tamaño de la herida está relacionada con el tamaño de la funda de endoscopio, que comprende 3 mm.
NOTA: Coloque endoscopio en posición idéntica en comparación óptica con documentación fotográfica de los exámenes anteriores. Medida lesiones en el mismo ángulo y la distancia de cada seguimiento examen endoscópico.
- Procedimiento de biopsia
- Tomar biopsias con la ayuda de dos investigadores. Introducir las pinzas de biopsia con cuidado a través del canal de trabajo hasta que la punta de la pinza es visible en el monitor a la segunda investigador. Pinzas de apertura y cierre con cuidado a unvoid perforación.
- Mueva fórceps para el sitio de la patología.
- Procedimiento de inyección
- Realizar el procedimiento de inyección con la ayuda de dos investigadores. Tubo flexible de inyección pre-llenado (0,96 mm) completamente con el agente a administrar. Empuje el tubo a través del canal de trabajo hasta que la cánula (30 G) es visible en el monitor para el segundo investigador. Preparar la multa jeringa y administrar suavemente la cantidad solicitada de agente de diagnóstico o terapéutico. Los volúmenes de inyección debe ser de 50 l como máximo.
- Inserte la aguja en el submocosa en un ángulo de 15-30 grados. Enfrentar el bisel en la dirección de la mucosa. La mucosa muestra un signo de elevación característica después de la inyección con éxito.
- Endoscopia de fluorescencia (FE)
- Administrar 60 mg de dextrano-FITC conjugado diluido en 100 l de PBS por vía intravenosa antes de la fluorescencia examen endoscópico.
- Compruebe el punto de tiempo óptimo entre la inyección desu fluorescente trazador marcado y el procedimiento de formación de imágenes que depende de la farmacología trazador. Configurar los ajustes de sistema de filtro de paso de banda de acuerdo a la longitud de onda de excitación y emisión del trazador utilizado. Realizar la endoscopia de fluorescencia para trazadores no específicos de volumen de sangre (por ejemplo, FITC) inmediatamente después de la inyección intravenosa del colorante fluorescente para evaluar el patrón vascular de la superficie mucosa.
- Considere la posibilidad de obtener imágenes de varias horas después de la aplicación del marcador en caso de trazadores específicos o "sondas inteligentes" para ofrecer un mejor objetivo de fondo-ratio.
- Realizar fotos y de video-documentación de los resultados.
5. Post-colonoscopia
- Separar el ratón en una jaula vacía y colóquela sobre una toalla de papel para proteger el ratón de la aspiración de la camada. Calentar el ratón con una lámpara redlight para prevenir la hipotermia. Observe el ratón y no lo deje sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficienteconciencia para mantener decúbito esternal. Una vez completamente consciente, colocar el ratón de nuevo a su respectiva jaula.
- Al final del experimento, el lugar del ratón en una caja pequeña, pero a prueba de fugas y administrar CO 2 (100% (v / v), 100% vol, 3 L / min). Espere hasta que el ratón pierde el conocimiento completo y deja de respirar. Despacho del ratón por fractura de cuello. Lleve a cabo una laparotomía abdominal y explantar el colon. Abra el colon longitudinalmente y lavarlo para su posterior evaluación histológica o molecular.
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Representative Results
En la vigilancia in vivo de cicatrización de la herida intestinal
Durante la endoscopia de rutina, heridas de la mucosa fueron inducidas mecánicamente por fórceps de biopsia en miniatura con un diámetro de 3 Francés (igual a 1 mm; Figura 1A). Posteriormente, la cicatrización de heridas se monitorizó mediante exámenes endoscópicos diarias y cuantificado por medición de la zona de la herida residual utilizando software de edición de imagen, por ejemplo, ImageJ (Figura 1B). El cierre de la herida individuo con el tiempo se expresa por el cociente de área real de la herida / área inicial de la herida. Por ejemplo, en el día 3 después de la generación de la herida, se recuperó 41% ± 4,1% de la zona de la herida, mientras que en el día 7 la herida generalmente se curó completamente (Figura 1C). Además, en el final del experimento, las heridas pueden ser resecados para la evaluación histológica ex vivo. Se representan imágenes representativas de hematoxilina y eosina (H & E) teñidas camas heridas en day 0 días y 5 (Figura 1D).
Terapia de inyección intramucosa guiada por endoscopia
Para la aplicación intramucosa de agentes farmacológicos, un tubo flexible (diámetro de 0,96 mm) con una cánula fijada al extremo (30 g) se introdujo en el canal de trabajo del endoscopio (Figura 2A). Después de la colocación de la aguja intramucosa, un máximo de 50 l se inyecta cuidadosamente. Indicativa de aplicación intramucosa éxito, levantamiento de la mucosa del colon se puede observar fácilmente macroscópicamente (Figura 2B, C).
En la evaluación in vivo de colitis experimental
Después de la inducción de la colitis, los ratones mostraron pérdida de peso de 3 días con la pérdida máxima de peso corporal de 19% se producen en el día 7 (Figura 3A). Además de la medición diaria de peso corporal, actividad de la enfermedad se controló por endoscopias repetitivas y macroscópica la cuantificación de la inflamación por el índice endoscópica murino de gravedad de la colitis (MEICS). De acuerdo con la pérdida de peso corporal, la puntuación MEICS se incrementó a 7 días después del inicio DSS que indica un daño inflamatorio masiva de la mucosa del colon, que se ha mejorado en el día 13 (Figura 3B). Para ex vivo correlación de daño histológico, alteraciones inflamatorias de las secciones de H & E-manchado del colon se cuantificaron según el Dieleman Score 11. En el día 7 después del inicio DSS, daño histológico fue significativamente mayor en los ratones tratados con DSS comparación con los controles, como se refleja por la denudación epitelial, ulceraciones de la mucosa, así como aumento de la infiltración de neutrófilos y se mejoró significativamente en el día 13 (Figura 3C, E). Además, la evaluación histológica de biopsias de la mucosa, obtenidas de forma rutinaria durante los exámenes endoscópicos, corroboró la etapa avanzada de la colitis en el día 7 (Figura 3F-H).
Aproximadamente 80 días después de la inducción tumoral por AOM y tres ciclos de DSS (Figura 4A), múltiples tumores de colon (Figura 4C), así como signos macroscópicos de inflamación crónica, tales como la mucosa granulado (Figura 4B) 10 se observaron endoscópicamente. La evaluación histológica de los tumores colorrectales por tinción H & E reveló adenomas con y sin alto grado de neoplasia intraepitelial. Por lo tanto, el modelo de DSS-AOM se asemeja a un modelo perfecto para estudiar los procesos moleculares de la carcinogénesis 12, así como para evaluar los nuevos dispositivos de diagnóstico 13. Imágenes de fluorescencia moléculas diana específicas permite en imagen molecular in vivo con "métodos fotográficos '14,15. Para demostrar la viabilidad de FE, se utilizó FITC, un fluorocromo ampliamente utilizado. Para la detección de FITC específico, un sistema de filtro de paso de banda combina con la Light fuente proporcionado longitud de onda de excitación específica necesaria (490 nm; Figura 4D). Para la detección precisa de la longitud de onda de emisión de FITC-específico (525 nm), un segundo filtro de paso de banda se interpone entre el cabezal de la cámara y el endoscopio (Figura 4E). FE sin aplicación trazador no detectó ninguna señal específica y ninguna interacción con el tejido del colon o autofluorescencia fecal (Figura 4F, G). En cambio, inmediatamente después de la aplicación intravenosa de FITC-dextrano, el fluorocromo se puede observar en la mucosa del colon y se puede utilizar para la evaluación del aumento de la vascularización en las regiones de inflamación crónica (Figura 4H), así como la mucosa maligno (Figura 4I). En consecuencia, la cuantificación de la intensidad de fluorescencia por un software de edición de imágenes mostró un aumento significativamente la absorción del fluorocromo dentro del tejido maligno en comparación con mucosa colónica no afectado (Figura 4K).
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Figura 1. vigilancia endoscópica de la curación epitelial in vivo así como la evaluación cuantitativa y histológico de curación de la herida herida. Después de la generación de las heridas de colon, en la frontera de la herida y cierre de la herida puede ser detectado fácilmente. El área de la herida (flechas blancas) se evalúa durante el seguimiento endoscopias diarias seguir cuantitativamente la curación de heridas epiteliales (A - C) ex vivo, las heridas fueron resecados y H & E-manchado para el análisis histológico de la cicatrización de heridas (D).. Las escalas se definen por la barra de escala representa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2.-Endoscopia guiado intramucosa terapia de inyección. Bajo control visual, la punta de la aguja (A) se coloca suavemente en la mucosa del colon y 50 l de sustancias disueltas se inyecta (B). Posteriormente, el levantamiento de la mucosa marcada puede ser reconocido (asterisco), sin signos de sangrado agudo (C). Las escalas se definen por la barra de escala representa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. evaluación endoscópica del curso de la colitis experimental DSS. El curso de la colitis era evaluard por los cambios en el peso corporal, exámenes endoscópicos, así como el análisis histológico de las secciones del colon inflamado y biopsias endoscópicas. En línea con pérdida masiva de peso corporal y daño histológico avanzado en el día 7 (A, C, E; un aumento de 10X), los exámenes endoscópicos y la evaluación histológica de las biopsias obtenidas representados signos de inflamación grave (B, D, G, H; aumento de 5X y 10 veces más), mientras que en el día 13 después de DSS iniciar alteraciones inflamatorias se mejoraron significativamente. Las escalas se definen por la barra de escala representa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 FE de los tumores colorrectales. Después de la inducción de la carcinogénesis colorrectal por OMA y administración DSS cíclica durante 11 semanas (A), la luz blanca de la mucosa endoscópica detectado granulada indicativos de colitis crónica (B) y numerosas lesiones endoluminales (C), que fueron diagnosticados como adenomas con alto grado de neoplasia intraepitelial mediante tinción H & E ex vivo (G). Mientras que la visualización de la inflamación crónica (H) y los tumores (I) era fácilmente posible utilizando FITC dirigido FE, FE sin aplicación trazador no permitió la detección de tumores definitiva (F, G). En consecuencia, la cuantificación de la intensidad de fluorescencia fue significativamente mayor en el tejido maligno en comparación con mucosa colónica no afectado, que se muestra por los perfiles de la escala de grises (E, F). Para cambiar al modo de fluorescencia durante colonoscop luz blancay, un filtro de paso de banda específico está conectado, además, en la fuente de luz fría para proporcionar la longitud de onda de excitación específica (por ejemplo, 490 nm para FITC; D). Este filtro facilita conmutación (flecha blanca) entre la luz y de fluorescencia modos de blancos (D). Para capturar la longitud de onda de emisión específico (por ejemplo, 525 nm para FITC), un segundo filtro de paso de banda se interpone entre el endoscopio y la cabeza de la cámara mediante una junta de bayoneta (E). Las escalas se definen por la barra de escala representa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Experimental set-up de la estación de trabajo endoscópico. La estación de trabajo endoscópica (
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Discussion
Cicatrización de la herida epitelial es un proceso continuo. Exfoliación fisiológica continua de células de la superficie dentro de la mucosa gastrointestinal se produce requiere la regeneración frecuente de las células epiteliales 16. En consecuencia, con problemas de curación de heridas tiene un inmenso impacto en varias enfermedades incluyendo las úlceras gastrointestinales y fuga anastomótica 17 18. Evaluación del fondo molecular, así como potenciales candidatos a fármacos para estimular la cicatrización epitelial sólo pueden ser realizados de manera incompleta en sistemas de cultivo celular in vitro 19,20. Por lo tanto, se necesitan montajes experimentales más sofisticados, como la colonoscopia murino con la generación de las heridas de la mucosa definidos por unas pinzas de biopsia para permitir una evaluación fiable in vivo de la cicatrización de heridas gastrointestinal y para evaluar las posibles interacciones entre la inflamación intestinal y los procesos de cicatrización de heridas.
Además, una aguja de inyección puede ser utilizado para lvecinal administración intramucosa de tintes diagnósticos o posibles candidatos a fármacos. Esto se puede lograr utilizando un tubo flexible (diámetro de 0,96 mm) con una aguja fijada al extremo puede ser introducido a través del canal de trabajo. Dado que un agente de ensayo, así como el control de placebo pueden ser entregados en las lesiones inflamatorias o neoplásicas separadas dentro del mismo animal, este enfoque proporciona una ventaja en comparación con fiabilidad parámetros experimentales tradicionales. Otra aplicación de inyecciones locales es la implantación de células tumorales humanas o murinas para generar tumores ortotópico en el colon murino 21.
Se necesitan modelos murinos de colitis para dilucidar la fisiopatología, así como para evaluar agentes terapéuticos potenciales preclínica. Por lo tanto, un seguimiento preciso de la evolución de la enfermedad es de suma importancia. Convencionalmente, la gravedad de la enfermedad por lo general se evaluó mediante parámetros indirectos, tales como el peso corporal, pruebas haemoccult así como el análisisde la sangre y las heces. En contraste, la determinación directa de la gravedad de la colitis se limita a menudo a post mortem análisis histológico, que requiere la muerte del animal. Sin embargo, la colonoscopia murino ofrece una visualización directa de la mucosa del colon de ratones vivos. Además, la monitorización directa y repetitivo para las características de la colitis es posible, lo que es un requisito en modelos experimentales con aparición de la enfermedad no homogénea, por ejemplo, IL-10 ratones deficientes o en el modelo de transfercolitis en ratones RAG-deficientes. En consecuencia, un índice endoscópica murino de colitis se ha establecido 6 que permite la cuantificación objetiva de la inflamación de la mucosa y los exámenes de seguimiento en serie del mismo animal.
En el contexto de la carcinogénesis colorrectal, colonoscopia ofrece diversas oportunidades beneficiosas. Por ejemplo, en contraste con los métodos no invasivos, la endoscopia es el primer enfoque para permitir la determinación en vivo de tamaño del tumory los números tumorales. Además, el uso de fotosondas fluorescentes dirigidas a moléculas específicas permite la visualización y cuantificación de los procesos moleculares. En un estudio realizado por traslación Foersch et al. focalización específica de la expresión del VEGF dentro de la mucosa colónica maligna ha demostrado ser factible y puede ser usada para caracterización de la lesión y la predicción de la respuesta al tratamiento en pacientes humanos con cáncer colorrectal 22. Además, la información resultante de este enfoque de imagen molecular puede ser capaz de ser traducido para su uso en pacientes humanos. Esto permitiría la caracterización en vivo de lesiones sospechosas durante la endoscopia. Finalmente, llamado aumento de especificidad 'sondas inteligentes "de estos trazadores por la activación de los fluoróforos por procesos enzimáticos en el lado de la lesión específica 23.
Cuando se realiza la endoscopia murino, ciertos pasos del protocolo dado son particularmente críticos. Por ejemplo, diferentes mocepas de uso difieren en su susceptibilidad a la anestesia y concentraciones DSS. Por lo tanto, este protocolo puede ser necesaria para adaptarse a las condiciones locales. Además, se requiere experiencia en la realización de exámenes endoscópicos y el conocimiento exacto de la anatomía murino para realizar endoscopia murino óptima que es segura y orientada a los objetivos. Con respecto a las posibles limitaciones de esta técnica, se destaca que el sistema de endoscopio utilizado es rígido, por lo tanto limitar el procedimiento para el colon hasta la flexión derecha. Además, se están evaluando la mayoría de fluorocromos aplicables para FE actualmente con respecto a sus perfiles de seguridad y, por lo tanto, mientras está disponible para los estudios murinos, aún no están aprobados para su uso en pacientes humanos.
Los siguientes son pasos críticos en relación con los aspectos prácticos del procedimiento: (1) ya que la susceptibilidad a la colitis inducida por DSS puede variar entre las diferentes cepas, la inducción de la colitis aguda DSS puede arriesgarse a la muerte de los animales si hay advseveridad anzada de colitis. Por lo tanto, considerar la evaluación de varias concentraciones DSS para identificar el más adecuado para una cepa individual y el lote DSS específico usado. El examen endoscópico puede ser difícil en presencia de grandes masas de materia fecal intracolónicas. Inducir el movimiento intestinal antes del procedimiento utilizando la aplicación rectal de 2 ml de líquido de enema vía cánula abotonado mejorará la visibilidad si se sospecha de la carga fecal significativa que puede dificultar la visión. Si se producen altas tasas de perforación durante la biopsia, disminuir el suministro de aire en el colon antes de obtener biopsias de la mucosa y disminuir la presión de las pinzas de biopsia en la superficie de la mucosa antes de cerrar las sucursales.
Tomados en conjunto, en contraste con los métodos convencionales para evaluar la actividad de la enfermedad de la colitis experimental o Cancerogénesis por parámetros indirectos, tales como el peso corporal, la aparición de sangre fecal, el análisis de sangre periférica o análisis histológico post mortem, finLas técnicas basadas en OSCOPIA permiten monitoreo en vivo de curso de la enfermedad con la posibilidad de realizar biopsias bajo control visual. Además, la cicatrización de heridas y el impacto terapéutico de los fármacos candidatos de aplicación tópica puede ser evaluada in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Sonja Dufentester y Elke Weber para la asistencia técnica de expertos. Agradecemos Faekah Gohar para la corrección del manuscrito y Stefan Brückner apoyo informática médica. Este trabajo fue apoyado por una beca interdisciplinaria del Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner fue apoyado por una posición de giro "Gerok" de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para la ilustración de la historieta del ratón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
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