Introduction
Das Bakterium Clostridium botulinum produziert Botulinum Neurotoxin, einem der potentesten biologischen Giftstoffen auf den Menschen bekannt 1. Es gibt 7 verschiedene BoNT-Serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induzieren die Lähmung an der neuromuskulären Synapse durch SNARE-Komplex Proteolyse 2,3. SNARE Proteolyse verhindert Neurotransmitter-Vesikel-Membranfusion und damit Blöcke Exozytose von Neurotransmittern 4. Die spezifische SNARE Ziel ist abhängig von der jeweiligen BoNT Serotyp im Rausch Prozess beteiligt. BoNT / A und BoNT / E spalten SNAP-25 in der Erwägung, BoNT / C spaltet sowohl SNAP-25 und Syntaxin 5. Die verbleibenden Serotypen spalten Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt. BoNT / A wurde für die Assay-Entwicklung gewählt, da es einen hohen Anteil von natürlich vorkommenden Botulismus verantwortlich und hat die längste Wirkdauer. 6 die Entwicklung des kleinen Moleküls Therapeutika gegen BoNT / A ist ein wichtiges Ziel fürunsere Wirkstoffforschungsprogramm und hat die traditionelle Zielbasierte Methoden genutzt, um aktive Zentrum proteolytischen Inhibitoren 7 identifizieren, 8-10. Jedoch wird die Schaffung von aktiven Zentrum Inhibitoren mit breiten Wirkungsspektrum gegen mehrere Serotypen und Postexpositions Wirksamkeit wahrscheinlich schwierig sein.
Daher haben wir eine innovative, phänotypische Wirkstoffforschungsansatz, BoNT SNAP-25-Spaltung als funktionelle Endpunkt an kleine Moleküle, die BoNT-vermittelten motorischen Neurons Intoxikation blockieren identifizieren können verwendet implementiert. SNAP-25 ist für die Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich, wie Abbau von SNAP-25 ist prädiktiv für Lähmung und Letalität in vivo. Zum Beispiel könnten zellbasierte Screening zur Entdeckung neuer Modulatoren zellulärer Faktoren für Toxin Inaktivierung oder Hemmung der Toxin-Bahn-Innere Zielzellen verantwortlich führen. Ein wichtiger Faktor bei der phänotypischen Assay-Entwicklung ist die Auswahl der physiologisch relevanten biologischen Modellen. We und andere haben embryonalen Stammzellen (ES) Zellen abgeleiteten Motorneuronen, welche die immunologischen Charakter des primären Motoneuronen zu rekapitulieren, einschließlich der Expression von SNAP-25 11- 13 beschrieben. Wichtig ist, dass diese zellulären Systeme sind sehr empfindlich auf BoNT / A-Intoxikation und zeigen Dosis-abhängige Spaltung von SNAP-25 in Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Toxins 11,12. Das differenzierte Motorneuronen sind ebenfalls in Mengen, die ausreichend für die Hochdurchsatzanalyse basiert Platte sind, und erlaubt die Konstruktion einer Reihe von zellulären Assays hergestellt.
Die phänotypische Assay ist ein Immunfluoreszenzverfahren, das zwei verschiedene Antikörper zur Spaltung der endogen exprimierten voller Länge SNAP-25 während der BoNT / A Rausch der Maus Motor Neuron Kultur quantifizieren. Ein carboxylterminalen BoNT / A-Spaltung empfindlichen (BACS) Antikörper, der nur in voller Länge SNAP-25 erkennt erlaubt die Beurteilung von BoNT / A vermittelten Proteolyse von SNAP-25Expression in der Maus Motoneuronen 10. Ein schematisches Diagramm des HCl-Assay ist in 1 dargestellt.
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Protocol
Platten 20.000 differenziert Maus-ES-Zellen (MES) / Well in einer 96-Well Poly-D Lysin beschichteten Platten und aufrechtzuerhalten in Motoneuronen-terminalen Differenzierung Medien für 5-7 Tage.
1. Verbindung Verwaltung und Intoxikation mit BoNT / A
Führen Sie alle der folgenden Arbeit in einem BSL2 Gehäuse, um die Einhaltung CDC / NIH-Richtlinien zu halten.
- Herstellung von 10 mM Stammlösungen der einzelnen Bibliotheksverbindung in 100% DMSO in 96-Well-Polypropylenplatten. Nutzen Sie die 10 mM Stamm um eine Zwischenverdünnungsplatte, die 10-fach größer als die gewünschte Screening Konzentration vorzubereiten. Bereiten 100 uM Zwischenplatte durch den Verzicht 10 mM Stamm in 96-Well-Platte und verdünnen Sie es mit Kulturmedien bis 100 & mgr; M. Verzichtet werden 10 & mgr; l der Verbindungen auf 90 ul Medium auf den Zellen 11. Testen Sie die Verbindungen bei 10 uM Endkonzentration und sorgen für die endgültige Prozentsatz der DMSO 0,5% nicht überschreiten.
- Führen Sie alle Bolzenies, die lebenden Zellen und aktives Toxin unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen zu nutzen. Ersetzen Sie die alten Medien in den 96-Well-Platten mit 80 ml frisches terminalen Differenzierung Medien mit einem 12-Kanal-Handpipette. Führen Sie Aspiration und verzichten Schritte durch Reihen, um die Exposition der Zellen gegenüber der Umgebungsluft zu vermeiden, ohne Medien.
- Vorzubehandeln Zellen mit Verbindungen vor der Applikation von Toxin durch Zugabe von 10 ul 10x-Verbindungen von der Quelle-Platte unter Verwendung einer 12-Kanal Pipette, gefolgt von Mischen durch Absaugen (zweimal). Für jede 96-Well-Platte, behandeln zwei Spalten mit 6 Vertiefungen mit 10x DMSO in den Medien verdünnt, um als High-Signal und niedrige Signalsteuerungen dienen. Die Säule ohne BoNT-Behandlung weist das höchste Niveau der vollen Länge SNAP-25 (High-Signal-Steuerung). Behandeln Sie die anderen Säule mit BoNT allein (ohne Verbindungen) als Low-Signal Kontrolle. Verwenden Sie niedrige Steuer, um die Effizienz von BoNT Spaltung SNAP-25 und dessen Nachweis mit der BACS-Antikörper zu beobachten (Abbildung 2).
- Inkubieren Zellen mit Verbindungen für 30 min bei 37 ° C und 6% CO 2 in den Zellkulturbrutschrank.
- Vorbereitung Botulinum Neurotoxin A aus einer 1 mg / ml kommerziellen Quelle in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Arbeitsstamm 10x durch Verdünnen mit terminalen Differenzierung Medien.
- Initiate Intoxikation durch Zugabe von 10 ul 10x BoNT / A Lager in für die Behandlung und Low-Signal steuert mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung 2) Kavitäten pipettieren. Behandeln Sie die so hoch Steuerung mit Medien allein Kavitäten pipettieren.
- Dekontaminieren alle Kunststoffwaren sowie anderen Einmal die in Kontakt mit BoNT / A während der Studie durch Eintauchen in 0,825% Hypochlorit-Lösung in Wasser für mindestens 20 Minuten kommt. Führen Sie alle in der biologischen Sicherheit Schränke und dekontaminieren Arbeitsbereiche vor und nach Experimenten mit 5% Detergens Desinfektionsreiniger wie MicroChem Lösung.
- Beschriften Sie die Platten eindeutig Toxin Gebrauch und Incub bezeichnenaß Platten mit 1 nM / L BoNT / A für 4 h bei 37 ° C und 6% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank behandelt. Anzeige entsprechende Beschilderung an Kollegen, dass Toxin in den Einsatz im Labor zu informieren.
- Stopp BoNT / A proteolytischen Spaltung durch Methanol-Fixierung. Entfernen Sie das Medium Toxin und Verbindungen, die aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und entsorgen in 10% Bleichlösung. Hinzufügen eiskaltem Methanol (100 ul), die direkt in jede Vertiefung.
- Platten für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, damit Fixierung auftritt.
- Nach der Fixierung sicher zu handhaben, die verworfen Reagenzien (legte neutralisiert) mit Sicherheitsstufe 1 Protokolle und entsorgen entsprechend.
- Entsorgen Methanol und verwenden 100 ul PBS, um die Zellen zu waschen und vor deinen Durst sie Immunfärbung. Führen Sie zwei zusätzliche PBS Wäschen.
- Nach dem letzten Waschen, lassen PBS in den Vertiefungen, Dichtungsplatten mit Mikroklebefolie und lagern bei 4 ° C bis zur Analyse. Store-Platten bei 4 ° C for mehrere Tage.
2. Immunfärbung
Die Immunfärbung Prozedur ist eine arbeitsintensive, mehrstufigen Vorgang, der sich wiederholenden Reagenz Abgabe / absaugen Zyklen und umfangreiche Plattenwäsche, die der mögliche Einführung von signifikanten Intra und Interplate Variabilität führen kann, schließt. Eine halbautomatische Ansatz angewendet, um die Zeit des Laborpersonals speichern Assay Durchsatz zu erhöhen und die Immunfärbung Variabilität zu minimieren.
- Verwenden Sie eine automatisierte Arbeitsstation mit einem 96-Loch-Kopf ermöglicht das Übermengen von bis zu 250 & mgr; l und integriert mit einem Roboter-Greifarm, um Laborgeräte in verschiedenen Orten auf dem modularen Deck (siehe Material und Ausrüstung) für dieses Protokoll zu bewegen ausgestattet.
- Die modulare Plattform wird entworfen, um verschiedene Arten von Laborgeräte hosten und kann bis zu 11 Artikel zu einem beliebigen Zeitpunkt zu unterstützen. Das automatisierte Mikro Handler ist mit einem Dual-Magazin Mikroplatten-Stacker, um zu halten ausgestattet undmanipulieren bis zu 50 Platten pro Zyklus.
- Die automatisierte Arbeitsstation innerhalb einer Klasse II Biosicherheitswerkbank für die Laborautomatisierung Ausrüstung, die der Sterilisation und Sicherheit bieten entfernt. Für Immunfärbeautomaten wird das Deck angeordnet ist, wie in 3 gezeigt, um den Zugang Reagenz nach Bedarf und ohne menschlichen Eingriff zu ermöglichen.
- Pre-load-Platten, die fixierten Zellen in das Plattenmagazin und Transfer zum Deck wie für Liquid Handling benötigt. Nutzen Sie die 96 Pipettenkopf mit 250 ul Tipps versehen, um PBS aus den Vertiefungen auf 10 ul absaugen. Durchdringbar Zellmembranen zu Antikörper-Bindung an intrazelluläre Ziele mit Permeabilisierung Puffer (0,1% Triton-X 100) zu erleichtern. Verzichtet Permeabilisierung Puffer (100 ul) in jede Vertiefung der Platten vor der Rückkehr zu dem zweiten Speichermagazin der Mikrostapel für eine 15 min Inkubation bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Permeabilisierung Puffer und perform Waschen der Platte mit PBS (zweimal), wie zuvor in Schritt 1.13.
- Nach dem letzten Waschschritt entfernt das PBS-Puffer zubereitet, und 100 & mgr; l Blockierungspuffer, enthaltend 1% Pferdeserum und 0,1% Tween 20 in PBS in alle Mikrotiterplatten, bevor er sie an den Plattenmagazin 1 h Inkubation bei RT.
- Verwenden Sie zwei primäre Antikörper für Immunfärbung: einen polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper BACS, für den Nachweis von Volllängen-SNAP-25 und einem monoklonalen Maus-Anti-III Tubulin-Antikörper zum Nachweis von Neuronen (siehe Material und Ausrüstung). Nach 60 min Inkubation entfernen Blocking-Puffer und 50 ul verzichtet 4UG / ml des Antikörpers GA und 0,5 ug / ml III-Tubulin in Blockierungspuffer in alle Platten.
- Inkubieren für 1 h bei RT Entfernen der primären Antikörper und wasche 3mal mit 100 ul PBS, enthaltend 0,05% Tween (PBST).
- Verwenden eines Anti-Maus-IgG mit Alexa Fluor 647 markiert die -III-Tubulin und Anti-Kaninchen-IgG mit Alexa F markiert visualisierenluor 568 die BACS-Antikörper sichtbar zu machen. Vorbereitung sowohl Antikörper als 2 & mgr; g / ml-Verdünnung in Blockierungspuffer und abzug 50 ul der Mischung in jeder Vertiefung.
HINWEIS: Die sekundären Antikörper für die Immunfärbung ausgewählt werden mit verschiedenen Fluorophoren markiert, um den Nachweis der emittierten Fluoreszenzlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen mit unterschiedlichen Kanälen innerhalb des Detektors der hohen Gehalt Imager ermöglichen. - Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie die Sekundärantikörper und 3x waschen mit 100 ul PBST.
- Nach dem letzten Waschen werden 100 & mgr; l PBS, das Hoechst-Farbstoff (32 uM), um die DNA für die Kerne Erfassungs färben.
- Dichten Sie die Platten mit einer lichtundurchlässigen Folie, um die Fluorophore von Photobleaching zu schützen. Platten können bei 4 gelagert werden ° C wochenlang ohne signifikanten Verlust des Signals.
3. Imaging
HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit High Content Imaging System (siehe Materialien und Ausrüstung).
- Spezifikation der High Content Imager Definitionen:
- Wählen Plattentyp, Layout, Anzahl der Felder, Ziel: Greiner u klar, 96-Well-Format, 16, 20X Wasser auf.
- Kanäle auswählen: Kern Anregungs EX: 405 nm als Kanal 4; Zytoplasma EX: 644 nm als Kanal 2; Antigen-spezifische Antikörper Kanal EX: 561 nm, wie Kanal 3 und Set up Erregerleistung jedes Lasers, Setup-Experiment als 2 Expositionen, Belichtung 1 mit einer Anregung bei 644 nm, Belichtung 2 mit zwei Anregungen bei 405 nm und 561 nm. Wählen Binning als BIN2.
- Verwenden Sie qualitativ Kontrollvertiefungen für Belichtungsoptimierung mit maximaler Intensität wie SNAP-25-Kanal und geringe Kontrollvertiefungen für minimale Intensität.
- Einstellung der Belichtung, so daß die Intensität von jedem Kanal beträgt etwa die Hälfte der Sättigungspegel (2000-2500 relativen Einheiten).
- Identifizieren Sie die optimale Z-Ebene auf die Zellmaskenkanal mittels Delta-Korrektur-Skript. Siehe FiAbbildung 5 für Ergebnisse nach Immunfärbung und Imaging. Exportieren von Daten an den Server, wo die Bildanalyse-Software ist wohnhaft.
4. Bildanalyse (Abbildung 6)
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Columbus Software-Algorithmen.
- Wählen Sie einen geeigneten Algorithmus zur Segmentierung des Primärobjekte (Kerne). Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter. Das Columbus-Software bietet 4 Kerne Nachweismethoden. Wählen Sie die Methode, dass die Segmentkerne genau durch Sichtprüfung segmentiert Kerne (in B ild 6a Verfahren M ausgewählt ist).
- Wählen Sie das Neuriten-Algorithmus (CSIRO Neuriten Analyse 2) zum Segment der Neuriten Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter in den Hintergrund zu entfernen. Siehe Abbildung 6b für Parameter verwendet, um Neuriten erkennen.
- Identifizieren Sie die Neuriten Regionen (Neuriten Segmente) based auf Sekundärobjekte (Neuriten) unter Verwendung eines Pixel -3 Expansion des β-III-Tubulin-Kanal (Alexa Flour 640) als Maske (6c).
- Berechnen Intensität der Signalkanäle (SNAP-25 (Alexa Flour 568) für das Neuriten-Region und β-III-Tubulin-Kanal (6d & 6e).
- Wählen Sie die gewünschten Parameter für den Export, wie Neuritenlänge, mittleren Intensitäten des SNAP-25, β-III-Tubulin, Kernzahl, Neuriten Segmentnummer usw. (6f).
- Übertragungsplatten aus Plattenstapler mit dem Roboter und Last in die High Content Imager für die Bilderfassung.
5. Datenanalyse:
Um die Robustheit des Assays entwickelt beurteilen, Berechnen der folgenden Parameter von der Plattenbasis Experiments.
- Signal (S) in den Hintergrund (B): S / B = mittlere Intensität hohe Signalsteuerung) / mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung <li> Variationskoeffizient (CV) von Signal und Hintergrund (um die Einheitlichkeit des spezifischen Signals messen): CV = (Standardabweichung (SD) / Mittelwert der Stichprobe) * 100 (%), um die Variabilität in Liquid Handling bestimmen, Reagenzien usw.
- Signal to Noise: S = (mittlere Intensität des Signals - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / SD niedriger Steuer
- Der Z-Faktor "Berechnen mit Intoxikation von einer Hälfte einer 96-Well-Platte und einem Mock Rausch der anderen Hälfte. Z '= 1-3 * (SD hoher Signalsteuerung + SD der niedrigen Signalsteuerung) / (Mittelwert der hohen Signalkontrolle - Mittel der niedrigen Signalsteuerung). Für die weitere Analyse der Screening-Daten, zu normalisieren einige der Primärrohstoffe Parameter auf einem Teller Grundlage zum Vergleich zwischen den Platten und zwischen den verschiedenen Tagen der Experimente zu ermöglichen.
- Prozent der Spaltung, was die Reduzierung des Signals mit voller Länge SNAP-25 durch spezifische Antikörper nachgewiesen (BACS) zugeordnet:% Dekolleté = 100% * (mean Intensität von Hochsignalsteuerung - Intensität der Probe) / mittlere Intensität hohe Signalsteuerung.
- Prozent der Inhibition der Spaltung:% Hemmung = 100% * (Intensität der Probe - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / (mittlere Intensität hohe Signalsteuerung - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung).
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Representative Results
Daten aus hohen und niedrigen Kontrollen erstellt zwei verschiedene Populationen mit der Differenz zweier Mittelwerte von mehr als 3 Standardabweichungen (7A). Das Ziel des Screenings ist, um die Verbindungen in der Probenpopulation mit Werten näher positive Kontrollpopulation zu finden, unter der Annahme einer Normalverteilung innerhalb der Probenpopulation (7B, (i)). Datenpunkte, die drei Standardabweichungen über dem Mittelwert liegen werden als statistisch von dem Lärm und als aktiver "Hit" klassifiziert (7B (ii), rote Kästen). Die Verbindungen, die als "Treffer" klassifiziert werden, um eine weitere Bestätigung Tests in zukünftigen Studien unterzogen werden. 7B (ii) zeigt den Nachweis von positiven Treffer in der Population von Proben aus einer repräsentativen Teilmenge der Schirmplatten. Alle 4 Punkte die Werte niedriger waren als die (Median Proben - 3 * SD der Proben) gehörteder gleiche Inhibitor, der an verschiedenen Orten innerhalb von 4 verschiedenen Screening-Platten gesichtet wurde. Dieser Inhibitor nachgewiesen robust SNAP-25 Schutz gegen BoNT / A, wie in Figur 5 gezeigt.
Abbildung 1: Workflow für Verbindungs-Screening in der BoNT / A HCI-Assay.
Abbildung 2:. Die 96-Well-Platte Karte für die HCI-Assay Hohe Kontrollvertiefungen (pink) wurden mit 0,5% DMSO als nur die Kontrolle und geringe Kontrollvertiefungen (blau) wurden mit 1 nM BoNT / A und 0,5% DMSO behandelt wurden. Probenvertiefungen (grün) wurden mit 1 nM Toxin behandelt und 10 & mgr; M-Verbindungen in 0,5% DMSO. Die äußeren Spalten und Zeilen (grau) wurden wegen Unvereinbarkeit mit dem optimierten Platte verwendetMatte und die Unfähigkeit des 20X Wasserimmersionsobjektiv, um Bildrand Brunnen.
Abbildung 3:. Das Design des automatisierten Arbeitsstation Deck für die Immunfärbung Assay Blockierungspuffer, primärer Antikörper, sekundäre Antikörper und zelluläre Flecken wurden in 96-Well-Polypropylenplatten verteilt, um Totvolumen Reagenzienverlust zu reduzieren. PBS wurde in eine Schale der Lage ist, 300 ml abgefüllt. Die für flüssige Abfälle Aspiration verwendet Verteiler ist auf dem Einschub Bild gezeigt.
Abbildung 4: Screenshot der High Content Imager Versuchsaufbau.
Abbildung 6: Screenshots mit verschiedenen Schritte im Bildanalysepipeline.
Abbildung 7: Statistische Visualisierung der Daten, die aus der HCI-Bildschirm. (A). (I) Box-Plot-Analyse der% Abspaltung vom Kontrollvertiefungen berechnet; mit ihren jeweiligen SD (n = 16) gezeigt als Mittelwerte. Rosa steht für die hohe Signalsteuerung (HSC); Blau steht für das Low-Signal-Steuerung (LSC). Z '= 0,97 (ii) Histogrammverteilung der gleichen Werte wie in (i), um den Abstand zwischen zwei Populationen zu demonstrieren. Median und 3 SD wurden aus den statistischen Werten mit der entsprechenden Box-Plot assoziiert berechnet. (B). Verteilung der 192-Verbindung behandelten Proben aus dem gleichen Experiment. (I) Box-Plot zeigt die statistischen Werte für den% Spaltung für Proben im Vergleich zu Kontrollen sowie statistisch signifikante Ausreißer. (Ii) und (iii), Histogramm-Verteilung von den gleichen Werten in der Belegung aller Daten vom Bildschirm (grünFarbe). Treffer (in roten Quadrat markiert) wurden von den Ausreißern, die% Spaltung Werte von weniger als 3SD vom Median der Probenpopulation (<25,89% Spaltung) haben gewählt. Die vier Treffern bei der Auswahl hervorgehoben (iii) auf dem Histogramm aller Datenpunkte haben ähnliche Werte der hohen Signalsteuerung und vertrat die gleiche Verbindung, Spike in die Platte für die Tests, eine bekannte BoNT / A-Inhibitor (Toosendanin), die SNAP blockiert -25 Spaltung.
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Discussion
Die hohe Wirksamkeit von Botulinum Neurotoxine und der relativen Leichtigkeit ihrer Bewaffnung hat in ihrer Einstufung als Kategorie A (höchste Priorität) biothreat Agenten von den US Centers for Disease Control and Prevention geführt. Leider gibt es keine von der FDA zugelassenen Therapeutika zur BoNT-Intoxikation zu begegnen, nachdem das Toxin von den Motoneuronen verinnerlicht worden. Alle druggable Mechanismus, der neuronalen Wiederaufnahme von BoNT-Intoxikationen fördert könnte in Richtung der Entwicklung einer potenziellen Therapie, sowohl die Streitkräfte und Bevölkerung gegen diese biologische Bedrohung zu schützen führen. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte HCI Assayprotokoll für das Screening von Inhibitoren der letalen Toxine wie BoNT / A. Ein ungewöhnlicher Aspekt dieser Test ist gewissenhaft Gabe von Toxinen und Umsetzung der strengen Biosicherheit Protokolle Laborsicherheit zu gewährleisten. Es muss besonders darauf ausgeübt werden, während aktives Toxin in Gebrauch ist. BoNT / A-Inaktivierung mittels Methanol Fixierung und Mikrodesinfektionauf mit 10% Bleichmittel und 5% Flächen Tücher sind wichtige Schritte, die Mikrotiterplatten von Biosicherheitsschränke für nachgeschaltete Auswertung in Biosicherheitsstufe 2 Laborumgebungen entfernt werden können.
Aufgrund der stetig wachsenden Größe von Substanzbibliotheken verbunden mit langsamen Motor Neuron Expansion (Zellzahl), HCI Assays für Neurotoxin-Antagonisten sind in der Regel über mehrere Wochen laufen. Dies erfordert, daß die Variabilität zwischen den Platten und über die Zeit beseitigt oder minimiert werden. In diesem Protokoll bieten wir Automatisierungsmethoden für Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse, um die Assay-Varianz zu reduzieren. Weitere Zuverlässigkeit und Konsistenz können durch die Automatisierung der Routinearbeiten mit diesem Protokoll einschließlich Zell Plattierung, Waschen und Fixierung zugeordnet erreicht werden. Unsere Gruppe untersucht derzeit die Auswirkungen dieser Verbesserungen mit der Absicht, die Einbindung in unser Protokoll in der nahen Zukunft.
In diesem Bericht beschreiben wir eine SNAP-25Spaltungsassay mit hohem Gehalt Bildgebung zur relativen Fluoreszenz von intakten SNAP-25 in Motoneuronen messen. Dieser Test verwendet die BACS und β-III-Tubulin-Antikörpern in voller Länge SNAP-25 und β-III-Tubulin jeweils 11 zu erkennen. β-III-Tubulin als Marker verwendet werden, um spezifisch Neuronen (Abbildung 4). Während BoNT / A spaltet SNAP-25 und reduziert die SNAP-25-Signal, kleine Moleküle, die einen Teil dieses Prozesses zu hemmen verbessern SNAP-25-Signal in der Bildtest. Da dieser Test ist abhängig von der von der SNAP-25 in vielen winzigen Neuriten verteilt erzeugte Fluoreszenzsignal, sind qualitativ hochwertige Bilder absolut notwendig. Daher werden automatisierte Mikroskope, hochauflösende konfokale Bilder produzieren empfohlen (Abbildung 4). Wir routinemäßig erfassen 6-16 Felder / Well in einer 96-Well-Format bei der Verwendung des 20X Wasserimmersionsobjektiv. Die Anzahl der Feld abgebildeten abhängig von der Gesamtzahl der Neuriten erforderlich sind GeneratE statistisch signifikante Ergebnisse.
Wurden modulare Bildanalysealgorithmen verwendet werden, um Multidaten (Figur 6) zu extrahieren. Die Columbus modulare Bildanalysealgorithmen sind relativ einfach, für einfachere Analyseszenarien zu generieren. Für kompliziertere Analyse oder Entwicklung von spezifischen Parametern für komplexe Positionsanzeigen können Acapella basierte Skripte innerhalb des Opera-Umgebung als auch innen im Rahmen des Kolumbus verwendet werden. Zusätzlich zu den Fluoreszenzintensitäten von den SNAP-25 und β-III-Tubulin-Kanäle erhalten wir routinemäßig erfassen andere Parameter wie Gesamtzellzahl (indirektes Maß für die Zytotoxizität) Neuritenlänge, Neuriten-Verzweigung und anderen Endpunkten neuronale Gesundheit während quantifizieren Der Assay. Die rohen Endpunktdaten, statistische Analysesoftware für die weitere Datenanalyse und traf Auswahl (Abbildung 7) exportiert. Die hier vorgestellten Daten zeigen die Fähigkeit der HCI Assay effici zu seinständig für phänotypische Screening auf der Suche nach BoNT / A-Inhibitoren mit einem physiologisch relevanten Motorneuronenmodell genutzt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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