Et højt indhold Imaging Assay til identifikation af botulinumneurotoksin inhibitorer

Introduction

Bakterien Clostridium botulinum producerer botulinum neurotoksin, et af de mest potente biologiske toksiner, man kender ^1. Der er 7 forskellige BoNT serotyper (BoNT / AG). BoNT / A-Gall fremkalde lammelse ved den neuromuskulære junction grund SNARE kompleks proteolyse ^2,3. SNARE proteolyse forhindrer neurotransmitter vesikel-membran fusion og derfor blokerer neurotransmitter exocytose ^4. Den specifikke SNARE målet afhænger af den særlige BoNT serotype involveret i forgiftning proces. BoNT / A og BoNT / E spalter SNAP-25 hvorimod BoNT / C spalter både SNAP-25 og syntaxin ^5. Den resterende serotyper spalter synaptobrevin (også kaldet vesikelassocieret membranprotein (VAMP). BoNT / A blev valgt til assay udvikling, da den er ansvarlig for en stor del af naturligt forekommende botulisme, og har den længste virkningstid ^6. Udvikling af lille molekyle lægemidler mod BoNT / A er et vigtigt mål forvores drug discovery program og har benyttet traditionelle målrettede metoder til at identificere aktive websted proteolytiske inhibitorer ^{7, 8-10.} Imidlertid vil etablering af aktivt sted inhibitorer med bredspektret aktivitet mod flere serotyper og post-eksponering effekt sandsynligvis være udfordrende.

Vi har derfor gennemført en innovativ, fænotypisk drug discovery tilgang, der bruger BoNT SNAP-25 spaltning som en funktionel endepunkt for at identificere små molekyler, der kan blokere BoNT-medieret motor neuron beruselse. SNAP-25 er nødvendig for neurotransmitterfrigivelse, som nedbrydning af SNAP-25 er prædiktive for lammelse og letalitet in vivo. For eksempel kan celle-baserede screening føre til opdagelsen af ​​nye modulatorer af cellulære faktorer, der er ansvarlige for toksin inaktivering eller inhibering af toksin veje inde i målcellerne. En vigtig faktor i fænotypisk assay udvikling er det udvalg af fysiologisk relevante biologiske modeller. We og andre har beskrevet mus embryonale stamceller (ES) celleafledte motoriske neuroner, der rekapitulere immunologisk karakter af primære motoriske neuroner, herunder afgivelse af SNAP-25 ^{11- 13.} Vigtigere, disse cellulære systemer er meget følsomme over BoNT / A forgiftning og viser dosis-afhængig spaltning af SNAP-25 som reaktion på stigende koncentrationer af toksin ^11,12. De differentierede motoriske neuroner er også produceret i mængder, der er tilstrækkelige til high throughput plade baseret analyse og tilladt udformningen af ​​en vifte af cellulære assays.

Den fænotypiske analyse er en immunfluorescens fremgangsmåde, der anvender to forskellige antistoffer til at kvantificere spaltning af endogent udtrykt fuldlængde SNAP-25 i BoNT / A forgiftning af muse motor neuron kultur. En carboxylterminale BoNT / A-sensitive spaltning (BACS) antistof, der genkender kun fuld længde SNAP-25 tillader vurdering af BoNT / A-medieret proteolyse af SNAP-25ekspression i muse motorneuroner ^10. Et skematisk diagram af HCI assay er vist i figur 1.

Protocol

Plade 20.000 differentieret muse ES-celler (MES) / brønd i en 96-brønds Poly-D-lysin overtrukne plader og opretholde motor neuron terminal differentiering medier i 5-7 dage.

1. Forbindelse Administration og Forgiftning med BoNT / A

Udfør alle følgende arbejde i et BSL2 kabinet for at opretholde overensstemmelse med CDC / NIH retningslinjer.

1. Forbered 10 mM stamopløsninger af hvert bibliotek forbindelse i 100% DMSO i polypropylen 96-brøndsplader. Brug 10 mM stamopløsning at fremstille en mellemliggende fortynding plade, der er 10 gange større end den ønskede screening koncentration. Forbered 100 uM mellemliggende plade ved at dispensere 10 mM stamopløsning i 96-brønds plade, og fortynd til 100 uM hjælp dyrkningsmediet. Dispensér 10 pi af forbindelserne på til 90 pi medier på cellerne ^11. Test af forbindelser ved 10 uM slutkoncentration og sikre den endelige procentdel af DMSO ikke overstiger 0,5%.
2. Udfør alt studerne, der udnytter levende celler og aktivt toksin under biosikkerhed niveau 2. Erstatte de gamle medier i 96-brønds plader med 80 pi af frisk terminal differentiering medier ved anvendelse af en 12 kanals manuel pipette. Foretag aspiration og dispensere trin ved at rækker for at undgå eksponering af celler uden medier til den omgivende luft.
3. Forbehandle celler med forbindelser før anvendelse af toksin ved tilsætning af 10 pi 10x forbindelser fra kilden plade ved hjælp af en 12 kanals pipette, efterfulgt af blanding af aspiration (to gange). For hver 96-brønds plade, behandle to kolonner med 6 brønde med 10x DMSO fortyndes i medierne til at tjene som højt signal og lave signalniveauer kontrol. Søjlen uden BoNT behandling udviser det højeste niveau af den fulde længde SNAP-25 (høj signal kontrol). Behandle den anden kolonne med BoNT alene (uden nogen forbindelser) som lavt signal kontrol. Brug lav kontrol til at iagttage effektiviteten af BoNT spaltning af SNAP-25 og dens opdagelse med BACS- antistof (figur 2).
4. Cellerne inkuberes med forbindelser i 30 minutter ved 37 ° C og 6% CO ₂ i cellekultur inkubator.
5. Forbered botulinum neurotoksin A fra en 1 mg / ml kommerciel kilde i phosphatbufret saltvand (PBS) til en endelig 10x arbejdslager ved fortynding med terminal differentiering medier.
6. Indled forgiftning ved tilsætning af 10 pi 10x BoNT / A bestand i brønde, der er udpeget til behandling og lavt signal kontrol ved hjælp af en multikanal pipette (Figur 2). Behandl brøndene udpeget som høj kontrol med medierne alene.
7. Dekontaminér alle plast ware og andre engangsartikler, der kommer i kontakt med BoNT / A i løbet af undersøgelsen ved nedsænkning i 0,825% hypochloritopløsning i vand i mindst 20 min. Udfør alle procedurer i biosikkerhed kabinetter og rense arbejdsområder både før og efter forsøg med 5% rengøringsmiddel desinfektionsmiddel renere såsom MicroChem løsning.
8. Mærk pladerne klart at betegne toksin brug og incubspiste plader behandlet med 1 nM / L BoNT / A i 4 timer ved 37 ° C og 6% CO ₂ i en cellekultur inkubator. Display skiltning til at informere kollegerne, at toksin er i brug i laboratoriet.
9. Stop BONT / A proteolytisk spaltning af methanol fiksering. Fjern mediet, der indeholder toksin og forbindelser fra hver brønd med en multikanal pipette og kassér i 10% blegemiddel. Tilføj iskold methanol (100 pi) direkte til hver brønd.
10. Pladerne inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) for at tillade fiksering at forekomme.
11. Efter fiksering sikkert håndtere de kasserede reagenser (betragtes som neutraliserede) med biosikkerhed niveau 1 protokoller og kassér i overensstemmelse hermed.
12. Kassér methanol og anvende 100 pi PBS at vaske cellerne og rehydrere dem før immunfarvning. Udføre to yderligere gange vask med PBS.
13. Efter den sidste vask, forlade PBS i brønde, forsegling med mikroplade selvklæbende folie og opbevares ved 4 ° C indtil analyse. Store plader ved 4 ° C for flere dage.

2. Immunfarvning

Immunofarvningen procedure er en arbejdskrævende, multistep operation, der omfatter gentagne reagens tapning / aspiratprøver cykler og omfattende plade vask, der kan føre til den potentielle indførelse af betydelig intraplate og interplate variabilitet. En semi-automatiske metode anvendes for at spare tid laboratorie personale, øge assay gennemløb, og minimere immunfarvning variabilitet.

1. Brug en automatiseret arbejdsstation er udstyret med en 96-brønds hoved stand til at overføre mængder op til 250 pi og integreret med en robot griber arm til at flytte laboratorieudstyr i forskellige steder på den modulære dæk (se materialer og udstyr) til denne protokol.
   1. Den modulære dæk er designet til at huse forskellige typer laboratorieudstyr og kan understøtte op til 11 elementer på én gang. Automatiseret mikroplade handleren er udstyret med en dobbelt magasin mikroplade stabler for at holde ogmanipulere op til 50 plader pr cyklus.
   2. Automatiseret arbejdsstation er placeret inde i et klasse II biosikkerhed kabinet konstrueret til laboratoriebrug automation udstyr til at yde sterilitet og sikkerhed. For automatiseret immunfarvning er dækket arrangeret som vist i figur 3 for at give adgang reagens efter behov og uden menneskelig indgriben.
2. Pre-load plader indeholdende fikserede celler i pladen magasin og transfer til dæk som er nødvendig for flydende håndteringsoperationer. Brug 96 pipette hoved monteret med 250 pi tips at aspirere PBS fra brøndene ned til 10 pi. Permeabilisere cellemembraner for at lette antistofbinding til intracellulære mål med permeabilization buffer (0,1% Triton-X 100). Dispensere permeabilisering buffer (100 pi) i hver brønd før vender pladerne til det andet magasin af mikropladen fører til en 15 minutters inkubation ved stuetemperatur (RT).
3. Fjern permeabilisering buffer og perform plade vask med PBS (to gange) som tidligere beskrevet i trin 1.13.
4. Efter det sidste vasketrin, fjernes PBS-buffer og dispensere 100 pi blokeringspuffer indeholdende 1% hesteserum og 0,1% Tween 20 i PBS i alle mikroplader før returnere dem til pladen magasin for 1 hr inkubation ved stuetemperatur.
5. Brug to primære antistoffer for immunfarvning: en kanin polyklonalt anti-muse BACS antistof til påvisning af fuld længde SNAP-25 og et monoklonalt muse-anti-III tubulin-antistof til påvisning af neuroner (se Materialer og udstyr). Efter 60 min inkubation fjerne blokerende buffer, og dispensere 50 pi 4UG / ml BACS antistof og 0,5 ug / ml III-tubulin i blokerende buffer i alle plader.
6. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur fjernes de primære antistoffer og vaskes 3 gange med 100 pi PBS indeholdende 0,05% Tween (PBST).
7. Brug et anti-muse-IgG mærket med Alexa Fluor 647 at visualisere -III tubulin og anti-kanin IgG mærket med Alexa Fluor 568 at visualisere BACS antistof. Forberede både antistoffer som en 2 ug / ml fortynding i blokeringspuffer og dispensere 50 pi af blandingen i hver brønd.
   BEMÆRK: De sekundære antistoffer udvalgt til immunfarvning er mærket med forskellige fluoroforer at muliggøre detektion af deres udsendte fluorescerende lys ved forskellige bølgelængder ved hjælp af forskellige kanaler inden detektoren af ​​det høje indhold Imager.
8. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Indsuges sekundære antistoffer og vaskes 3 gange med 100 pi PBST.
9. Efter den sidste vask tilsættes 100 pi PBS indeholdende Hoechst farvestof (32 uM) for at farve DNA'et for kerner detektion.
10. Pladerne forsegles med en lys uigennemtrængelige film for at beskytte fluoroforer fra fotoblegning. Plader kan lagres ved 4   ° C i ugevis uden betydeligt tab af signal.

3. Imaging

BEMÆRK: Udfør billede opkøbet med højt indhold Imaging System (Se materialer og udstyr).

1. Specifikation af højt indhold Imager Definitioner:
   1. Vælg Plate type layout, antallet af marker, mål: Greiner u klar, 96 godt format, 16, 20X vand hhv.
   2. Vælg kanaler: kerne excitation EX: 405 nm som kanal 4; cytoplasma EX: 644 nm som kanal 2; antigen-specifikt antistof kanal EX: 561 nm som kanal 3 og Opsætning excitation magt hver laser, Opsætning eksperiment som 2 eksponeringer Eksponering 1 med en excitation ved 644 nm, Eksponering 2 med to excitationer ved 405 nm og 561 nm. Vælg binning som Bin2.
   3. Brug høje kontrolbrønde for eksponering optimering med maksimal intensitet som SNAP-25 kanal og lave brønde til minimal intensitet kontrol.
   4. Justere eksponeringen, så at intensiteten af ​​hver kanal er omkring halvdelen af ​​mætningsniveauet (2.000-2.500 relative enheder).
   5. Identificer den optimale Z flyet på celle maskekanalen hjælp delta korrektion script. Se Figur 5 for resultater efter immunfarvning og billeddannelse. Eksport af data til serveren, hvor billedet analyse software er bosat.

4. Image Analysis (figur 6)

BEMÆRK: De følgende trin beskriver anvendelsen af ​​Columbus softwarealgoritmer.

1. Vælg en passende algoritme til at segmentere de primære objekter (kerner). Hvis det er nødvendigt, justeres baggrund tærskel og kontrast parametre. Columbus software giver 4 kerner detektionsmetoder. Vælg den metode, segmentets kerner nøjagtigt ved visuelt at inspicere segmenterede kerner (i F igur 6a metode M er valgt).
2. Vælg neurite algoritme (CSIRO neurit Analysis 2) at segmentere neuritter Om nødvendigt reguleres baggrund tærskel og kontrast parametre til at fjerne baggrunden. Se figur 6b for parametre, der anvendes til at påvise neuriter.
3. Identificer neurit regioner (neurit segmenter) based på sekundære objekter (neuritter) med en -3 pixel udvidelse af β-III-tubulin kanal (Alexa Flour 640) som masken (figur 6c).
4. Beregne intensiteten af signalkanaler (SNAP-25, (Alexa Flour 568) for neuritter region og β-tubulin III kanal (figur 6d og 6e).
5. Vælg de ønskede parametre for eksport, såsom neurit længde, gennemsnitlige intensiteter af SNAP-25, β-III tubulin, kerner nummer, neurit segment nummer mv (Figur 6f).
6. Overfør plader fra plade stablere hjælp af robot og belastning i det høje indhold Imager til billedbehandling erhvervelse.

5. Dataanalyse:

At vurdere robustheden af ​​designet assay beregne følgende parametre fra pladen baseret eksperiment.

1. Signal (S) til baggrund (B): S / B = middel-intensitet på højt signal kontrol) / middel-intensitet på lavt signal kontrol
<li> variationskoefficient (CV) af signal og baggrund (til måling ensartetheden af ​​det specifikke signal): CV = (standardafvigelse (SD) / gennemsnit af prøve) * 100 (%) for at bestemme variabiliteten i væskehåndtering, reagenser, etc.
2. Signal til Støj: S = (gennemsnitlig intensitet signal - betyde intensiteten af ​​lavt signal kontrol) / SD af lav kontrol
   1. Beregn Z 'faktor med forgiftning af den ene halvdel af en 96-brønds plade og en mock forgiftning af den anden halvdel. Z '= 1 - 3 ud * (SD høj signal kontrol + SD af lavt signal kontrol) / (gennemsnit af høj signal kontrol - gennemsnit af lav signal kontrol). Til yderligere analyse af screening data, normalisere nogle af de primære råparametre på en tallerken grundlag for at muliggøre sammenligning mellem pladerne og mellem forskellige dage i eksperimenter.
3. Procent af spaltning, som følge af reduceret signal forbundet med fuld længde SNAP-25 påvist ved specifik antistof (BACS):% Spaltning = 100% * (mean intensiteten af ​​høj signal kontrol - intensiteten af ​​prøven) / middel-intensitet på et højt signal kontrol.
4. Procent af inhibering af spaltning:% inhibering = 100% * (intensitet af prøve - middel-intensitet på lavt signal kontrol) / (middel-intensitet på højt signal kontrol - middel-intensitet på lavt signal kontrol).

Representative Results

Data fra høje og lave kontroller oprettet to forskellige populationer med forskellen på to medianer end 3 standardafvigelser (figur 7A). Målet med screeningsprocessen er at finde de forbindelser inden for stikprøve med værdier tættere på positiv kontrol population, under forudsætning af en normal fordeling i prøven population (figur 7B, (i)). Datapunkter, der er 3 standardafvigelser ud over den gennemsnitlige betragtes statistisk forskellig fra støj og klassificeret som en aktiv "hit" (figur 7B (ii), røde kasser). De forbindelser, der er klassificeret som "hits" vil blive udsat for yderligere test bekræftelse i fremtidige studier. Figur 7B (ii) viser påvisningen af positive hits i populationen af prøverne fra en repræsentativ delmængde af screening plader. Alle 4 punkter, der havde værdier lavere end de (median prøver - 3 * SD af prøverne) tilhørteden samme inhibitor, der blev spottet på forskellige steder inden for 4 forskellige screening plader. Denne inhibitor vist robust SNAP-25 beskyttelse mod BoNT / A, som vist i figur 5.

Figur 1: Workflow for forbindelse screening i BoNT / A HCI assay.

Figur 2:. Den 96-brønds plade kort for HCI assay High kontrolbrønde (rosa) blev behandlet med 0,5% DMSO som kun styring og lave kontrolbrønde (blå) blev behandlet med 1 nM BoNT / A og 0,5% DMSO. Prøvebrønde (grøn) blev behandlet med 1 nM toksin og 10 uM af forbindelser i 0,5% DMSO. De ydre kolonner og rækker (grå) blev ikke brugt på grund af inkompatibilitet med den optimerede plade format og manglende evne til 20X vand-immersionsobjektiv billedet kant brønde.

Figur 3:. Udformningen af automatiseret arbejdsstation dæk til immunfarvning assay Blokeringsbuffer, primære antistof, sekundære antistof og cellulære pletter blev dispenseret i 96-brønds polypropylenplader at reducere døde volumen tab af reagens. PBS blev dispenseret i en bakke kan rumme 300 ml. Manifolden anvendes til flydende affald aspiration vises på det indsatte billede.

Figur 4: Skærmbillede af det høje indhold Imager eksperimentelle oprettet.

ng> Figur 5:. Højt indhold billeddannelse af SNAP-25-spaltning i muse-ES-afledte motorneuroner Cellerne blev behandlet med 1 nM BoNT / A med og uden tilsætning af 1 uM inhibitor (Toosendanin) ¹⁴ eller ubehandlet uden toksin. SNAP-25 blev påvist med BACS antistof. I en anden kanal blev neuroner detekteres ved hjælp af en β-III-tubulin-antistof til at skabe maske af neuritter for SNAP-25 billedanalyse. Dette er et enkelt repræsentativt billede fra en af ​​de 16 billeder taget fra en given brønd. Blå angiver kerner farvet med Hoechst 33342, rød er BACS signalet og grøn er den β-III-tubulin signal. Billeder blev opnået med opera som beskrevet. Størrelse bar: 10 pm

Figur 6: Skærmbilleder, der viser forskellige trin i billedanalyse pipeline.

s ">
Figur 7: Statistisk visualisering af data, der opstår fra skærmen HCI. (A). (I) Box plot analyse af% Spaltning beregnet ud fra kontrolbrønde; vist som medianværdier med deres respektive SD (n = 16). Pink repræsenterer høje signal kontrol (HSC); blå repræsenterer lavt signal kontrol (LSC). Z '= 0,97 (ii) Histogram fordeling af de samme værdier som i (i) at vise afstanden mellem to kontrol populationer. Median og 3 SD blev beregnet ud fra de statistiske værdier forbundet med den tilsvarende box-plot. (B). Fordeling af 192 forbindelsen behandlede prøver fra samme eksperiment. (I) Box-plot demonstrerer de statistiske værdier for% spaltning for prøver i sammenligning med kontroller samt statistisk signifikante outliers. (Ii) og (iii), histogram fordeling af de samme værdier i populationen af ​​alle data fra skærmen (grønfarve). Hits (fremhævet med rød firkant), blev udvalgt fra de outliers, der har% spaltning værdier mindre end 3SD fra medianen af ​​prøven population (<25,89% spaltning). De fire hits fremhævet under udvælgelse (iii) på histogrammet af alle datapunkter har lignende værdier til høje signal kontrol og repræsenterede den samme forbindelse, tilsat til pladen i testene, en kendt BoNT / A-hæmmer (Toosendanin), der blokerede SNAP -25 spaltning.

Discussion

Den høje styrke af botulinumneurotoksiner og den relative lethed af deres bevæbning har resulteret i deres klassificering som kategori A (højeste prioritet) biothreat midler ved det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse. Desværre er der ingen FDA godkendt terapi til bekæmpelse af BoNT forgiftning efter toksinet er blevet internaliseret af de motoriske neuroner. Enhver druggable mekanisme, der fremmer neuronal nyttiggørelse fra BoNT forgiftning kan føre mod udviklingen af ​​en potentiel terapi for at beskytte både de væbnede styrker og befolkningen mod denne biologiske trussel. I denne artikel præsenterer vi en detaljeret HCI assayprotokol til screening inhibitorer af dødelige giftstoffer såsom BoNT / A. Et usædvanligt aspekt af dette assay er omhyggelig aflevering af toksiner og gennemførelse af strenge biosikkerhed protokoller til at sikre laboratorium sikkerhed. Ekstrem omhu skal udvises, mens aktivt toksin er i brug. BoNT / A inaktivering via methanol fiksering og mikroplade decontaminatipå med 10% blegemiddel og 5% overflade vådservietter er vigtige skridt, der tillader mikroplader skal fjernes fra biosikkerhed kabinetter for downstream evaluering i biosikkerhed niveau 2 laboratorie miljøer.

På grund af den stadigt voksende størrelse på de sammensatte biblioteker kombineret med langsom motor neuron ekspansion (celle nummer), HCI analyser for neurotoksinpræparater antagonister tendens til at køre over flere uger. Dette kræver, at variabiliteten mellem pladerne og på tværs af tid skal fjernes eller minimeres. I denne protokol giver vi automatisering metoder til immunfarvning, image indsamling og analyse for at reducere variabilitet assay. Yderligere pålidelighed og konsistens kan opnås ved automatisering af rutinemæssige opgaver i forbindelse med denne protokol, herunder celleudpladning, vask, og fiksering. Vores gruppe er i øjeblikket evaluere virkningen af ​​disse forbedringer med den hensigt at inkorporere dem i vores protokol i den nærmeste fremtid.

I denne rapport beskriver vi en SNAP-25spaltningsbestemmelse hjælp højt indhold billeddannelse til at måle relative fluorescens af intakt SNAP-25 i motoriske neuroner. Dette assay anvender BACS og β-tubulin III antistoffer til påvisning af fuld længde SNAP-25 og β-tubulin III henholdsvis ^11. β-tubulin III anvendes som en markør til specifikt at identificere neuroner (figur 4). Mens BoNT / A spalter SNAP-25 og reducerer SNAP-25 signal, små molekyler, som inhiberer en del af denne proces forbedre SNAP-25 signal i imaging assay. Da dette assay afhænger af fluorescens signal genereret fra SNAP-25 fordelt på mange små neuritter, er absolut nødvendige billeder af høj kvalitet. Derfor er automatiserede mikroskoper, der producerer høj opløsning konfokale billeder anbefalet (figur 4). Vi rutinemæssigt fange 6-16 felter / brønd i en 96-brønds format under anvendelse af 20X vand-immersionsobjektiv. Antallet af feltets afbildede er afhængig af det samlede antal neuritter skal generate statistisk signifikante resultater.

Modulære billede algoritmer blev anvendt til at udtrække multiparameter data (figur 6). Columbus modulære billede analyse algoritmer er relativt nemme at generere for enklere analyse scenarier. For mere kompliceret analyse eller design af specifikke parametre for komplekse udlæsninger kan Acapella baserede scripts anvendes inden for Opera miljø samt inde for rammerne af Columbus. Ud over fluorescensintensiteterne opnået fra SNAP-25 og β-tubulin III kanaler, vi indsamler rutinemæssigt andre parametre såsom samlet celleantal (indirekte mål for cytotoksicitet), neurit længde, neurit forgrening og andre endpoints at kvantificere neuronal sundhed under assayet. De rå endpoint data eksporteres til statistisk analyse software for yderligere dataanalyse og ramte selektion (figur 7). Dataene præsenteres her viser evnen af ​​HCI assay at være efficiladende anvendes til fænotypisk screening i søgning efter BoNT / A-inhibitorer ved anvendelse af en fysiologisk relevant motor neuron model.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack