Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig en breed toegankelijk microscopie techniek om hoogwaardige digitale video van Drosophila volwassen en larvale mutante fenotype over te nemen van een zijdelingse perspectief.
Abstract
Drosophila melanogaster is een krachtig experimenteel model voor het bestuderen van de functie van het zenuwstelsel. Gen mutaties die disfunctie van het zenuwstelsel vaak tot levensvatbare larven en volwassenen die voortbeweging defecte fenotypes die moeilijk te beschrijven met tekst of geheel vormen met een fotografisch beeld zijn hebben. Huidige vormen van wetenschappelijk publiceren, maar steunen het indienen van digitale video-media als aanvullend materiaal om een manuscript te begeleiden. Hier beschrijven we een eenvoudig en breed toegankelijk microscopie techniek voor het verwerven van een hoge kwaliteit digitale video van zowel Drosophila larven en volwassen fenotypes vanuit een zijdelingse perspectief. Video van larvale en volwassen motoriek van een side-view is voordelig omdat het mogelijk maakt de observatie en analyse van subtiele verschillen en variaties in afwijkende locomotief gedrag. We hebben met succes gebruik gemaakt van het visualiseren en kwantificeren aberrant kruipen gedrag in derde instar larven, in aanvulling op volwassen mutante fenotype en gedragingen waaronder verzorging.
Introduction
De gemeenschappelijke fruitvlieg Drosophila melanogaster is een krachtig experimenteel model voor het bestuderen van de functie van het zenuwstelsel 1-3. Evolutionaire behoud van de structuur en functie van het zenuwstelsel bij de mens, maar ook het gemak van genetische manipulatie en een breed scala aan genetische gereedschap maakt Drosophila de première organisme te modelleren van de menselijke neurodegeneratieve ziekten 4. Gen mutaties die disfunctie van het zenuwstelsel vaak tot levensvatbare mutant larven en volwassen Drosophila met verminderde motoriek. Fenotypes waargenomen in het zenuwstelsel defecte mutanten onder andere een lager tarief van de motoriek, afwijkende coördinatie, en spastische bewegingen bij volwassenen, maar ook tekorten in de peristaltische samentrekking van het lichaam muur spieren, en een gedeeltelijke verlamming van de larven. Deze fenotypes zijn in de ontwikkeling van high-throughput genetische screens en motoriek testen van mutant larven 5 uitgebuit, 6 en volwassen 7-10 Drosophila gericht op het kwantificeren van de motoriek stoornissen en de identificatie van genen die nodig zijn voor het functioneren van het zenuwstelsel. Hoewel deze benaderingen zijn uiterst nuttig voor het kwantificeren van de larven en volwassen locomotief gedrag, verzuimen om kwalitatieve informatie over elke specifieke afwijkend gedrag te brengen. Bijvoorbeeld, terwijl mutant derde instar larven gewijzigde locomotie parameters kunnen vertonen in een gedrags assay, kan het onduidelijk of dit het gevolg is van veranderingen in ritmische peristaltische contracties tijdens het kruipen cyclus, algemeen gebrek aan coördinatie of gedeeltelijke verlamming van de achterste lichaam muur spiermassa. Hier beschrijven we een eenvoudig en breed toegankelijk microscopie techniek voor het verwerven van een hoge kwaliteit digitale video van Drosophila volwassen en larvale locomotief fenotypes vanuit een zijdelingse perspectief. Digitale video verworven van een zijdelingse perspectief laat de directe observatie en analyse van subtiele verschillen in locomotive gedrag van een meer informatieve zijaanzicht oriëntatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 De Stereo Microscope System
Opmerking: Hoewel dit protocol is eenvoudig aan te passen aan vrijwel elke stereo-microscoop-systeem gekoppeld aan een digitale camera met de mogelijkheid van het verwerven van video worden bijzonderheden verstrekt over de gebruikte in ons lab (Table of Materials / Equipment)-systeem.
- Verwerven van digitale video met behulp van een trinoculaire stereomicroscoop gekoppeld aan een commerciële digitale camera.
- Om enkele van de commerciële digitale camera aan op de trinoculaire haven van de stereo-microscoop, verwijder de ½x C-mount van de fototubus haven van de stereo-microscoop en vervang deze door een 1X C-mount.
- Monteer een digitale camera koppeling (43 mm schroefdraad) aan de 1X C-mount.
- Mount twee step-down ringen 58 mm tot 48 mm en 48 mm tot 43 mm, de camera koppelaar de verbinding van de digitale camera koppelaar een lens adapter kit voor de digitale camera overbruggen.
- Monteer de digitale camera aan op de lens adapter kit.
- Verwerven van video met de microscoop vergroting en optische zoom van de camera set voor een gecombineerde vergroting van ongeveer 12x (30 frames per seconde, 640 x 480 pixels). Opmerking: De vergroting van de stereo-microscoop moet worden gecompenseerd in overeenstemming met de onlangs omgevormd 1X C-mount van de trinoculaire poort.
2 Imaging Drosophila Derde Instar Larven
- Tape een permanent marker op de zwarte fase plaat van een stereo-microscoop gekoppeld aan een digitale camera, zodat de kant van de marker dop neemt ongeveer ⅓ tot ¼ van de verticale gezichtsveld waargenomen in de LCD-monitor. Gebruik marker toppen als het podium om larvale beeldvorming uit te voeren, omdat ze komen in een assortiment van kleuren die kunnen worden gebruikt om de kleur code en differentiëren van de genotypen van larven in beeld wordt gebracht.
- Bakenen het gezichtsveld waargenomen in de digitale camera lcd-scherm op het oppervlak van de marker top met een fijne puntmarker.
- Selecteer een derde instar larve op de foto. De criteria voor het selecteren van derde instar larven was lichaamslengte, de opkomst van de voedselbron tijdens de larvale fase van de levenscyclus, de aanwezigheid van de voorste en achterste siphonen, en de structuur van de mandibulaire haken van de mond apparaat 11. Zorg ervoor dat de larve is schoon door het te wassen grondig in water.
- Verlichten de permanent marker top podium van boven met licht uit een glasvezel verlichting systeem. Pas de hoek van het invallende licht om een optimale verlichting te bieden.
- Nadruk de microscoop op de rand van de permanente marker top. Begin het verwerven van digitale video.
- Plaats de larve op de zijkant van de marker cap ongeveer 75 ° vanaf de verticale as, net buiten het gezichtsveld, het voorste van de larve gericht naar het veld (figuur 1). Opmerking: Plaatsing van de larve op de zijkant van de marker dop kan de camera opnemen beweging van the larve van een zijdelingse perspectief. Het helpt om de larve vochtig met water te houden zodat ze niet vallen buiten de kant van de marker dop. Wees voorzichtig, echter, om niet te veel water als grote hoeveelheden zal zich houden aan de larve als het kruipt over het veld.
- Voorzichtig porren en porren de larve met een klein penseel om het te dwingen te kruipen over het gezichtsveld. Wees geduldig als de larven zelden samen en hebben vaak vele malen te worden teruggebracht naar het startpunt voordat ze kruipen dwars over het veld.
- Neem ongeveer 10-15 minuten van ononderbroken digitale videobeelden en gewas en verwijder alle overbodige beelden na de overname met digitale video-editing software.
3 Imaging Adult Drosophila
- Plaats een enkel volwassen Drosophila in een wegwerp 1,5 ml spectroscopische polystyreen cuvet.
Opmerking: CO 2 voor pijn van volwassen Drosophila direct voor een gedragsioral analyse protocol kan resultaten 12 compromitteren. Het wordt aanbevolen om volwassen Drosophila worden gegeven een periode van 24 uur om te herstellen van CO 2 voor pijn voordat u in een gedragstest 13. - Steek het uiteinde van de cuvet met een klein katoenen bal. Zorg ervoor dat de katoenen bal is strak genoeg om de large cap ruimte innemen verpakt en beperkt de vlieg aan het verminderde volume compartiment van de cuvet.
- Plaats de cuvette op de witte plaat stadium van een stereomicroscoop en de verminderde hoeveelheid ruimte van de cuvet met het gezichtsveld waargenomen in de digitale camera LCD monitor goed uitlijnen.
- Verlichten de cuvette van boven met licht uit een glasvezel verlichting systeem. Pas de hoek van het invallende licht om een optimale verlichting te bieden.
- De focus van de microscoop en begint het verwerven van digitale video.
- Neem ongeveer 30-45 minuten van ononderbroken digitale videobeelden en gewas en verwijder alle onnodigebeelden na overname met digitale video-editing software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben met succes deze techniek te verwerven en kwantificeren larvale gedragsfenotype geassocieerd met functieverlies van de stathmin gen (figuur 2) 14. De stathmin gen codeert voor een microtubuli regulatie-eiwit dat tubulinedimeren partities van pools van oplosbare tubuline en bindt microtubuli en bevordert hun afbraak 15,16. Stathmin gewenst is om de integriteit van microtubuli in de axonen van perifere zenuwen 14 handhaven. Verstoring van stathmin activiteit in Drosophila larven derde instar resulteert in een fenotype waarbij het achterste lichaam segmenten flip omhoog na elke peristaltische golf van spiercontractie tijdens het kruipen cyclus. Dit posterior verlamming of 'staart-flip' fenotype is een kenmerk van defecte axonale transport. We gekwantificeerd penetrantie en ernst van de posterior verlamming fenotype in derde instar larven van zeven verschillende <em> stathmin mutant genotypen door het meten van de hoek boven de horizontale stand van de staart is opgegroeid tijdens de kruipende cyclus (tabel 1). Larven waren vastbesloten om een robuuste staart-flip vertonen als de staart werd opgevoed hoger dan 40 ° boven horizontaal bij het crawlen, een milde staart-flip als de staart werd verhoogd van minder dan 40 ° boven de horizontale, en geen staart-flip als de larven tentoongesteld een normaal kruipen gedrag.
Figuur 1 Positie van de larve derde instar op een permanent marker dop podium voor aanschaf van digitale video van een zijdelingse perspectief met behulp van een stereo-microscoop. Zijaanzicht van een eenvoudige stereo-microscoop met digitale camera gemonteerd op de trinoculaire poort. De inzet vergroting toont de oriëntatie van een permanente marker plakband aan de microscoop podium en de positie van de derde instar larve op de marker dop voor aanschaf van digitale video van afwijkend gedrag van een zijdelingse perspectief. In het beeld van de drie dimensies van de ruimte worden gedefinieerd; de x-as loopt de lengte van de permanente marker en evenwijdig is aan de microscoop podium, de y-as loodrecht op de x-as en parallel aan de microscoop podium, en de z-as verticaal uit de marker dop op het objectieflens en loodrecht op de microscoop podium. Een derde instar larve is geplaatst op de kant van de markeerder cap ongeveer 75 ° vanaf de verticale z-as naar de y-as, net buiten het gezichtsveld van de digitale camera, de voorste van de larve gericht naar het veld gezichtspunt. Plaatsing van de larve op de zijkant van de marker kap kan de digitale camera van de stereomicroscoop om beweging van de larven in het veld opnemen van een laterale perspectief.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Figuur 2 Afbeeldingen van representatieve resultaten. Vertegenwoordiger beelden van digitale video van Drosophila larve (A, B) en volwassen (C, D) fenotypes en gedragingen verworven van een zijdelingse perspectief. Elk beeld is een video stilstaand beeld onttrokken verworven digitale videobestanden. (A) Wildtype larve derde instar vertonen een vlakke lichaamshouding bij het kruipen langs een substraat. (B) Derde instar larve homozygoot voor een mutatie in het stathmin gen vertonen een afwijkende kruipen staart-flip gedrag, indicatief voor een verlamming van de achterste spieren. (C) De vleugels van wildtype volwassen Drosophila zijn plat gehouden tegen het lichaam als de vlieg loopt. (D) Adult Drosophila, homozygoot voor een onbekende mutatie, houden hun vleugels op hoeken ongeveer 45 ° boven normaal. Zowel afwijkende larven en volwassen fenotypes beschreven zijn best waargenomen en gecommuniceerd met digitale video overgenomen van een zijkant-perspectief bekijken. In paneel A en B de schaalbalk = 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van Duncan et al., 2013.
| Ernst van de posterior verlamming fenotype | ||||
| Genotype | n | No Tail-Flip | Milde Tail-Flip (<40 °) | Robuuste Tail-Flip (> 40 °) |
| wildtype | 150 | 100,0% (N = 150) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0.0% (N =) | 0.0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0.0% (N = 0) | 0.0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabel 1 Penetrantie en ernst van deposterior verlamming fenotype waargenomen in stathmin (roe) mutant Drosophila larven derde instar. de penetrantie en ernst van de achterste verlamming fenotype van stathmin larven mutant Drosophila derde instar werd gescoord en gekwantificeerd door het verwerven van digitale video van het gedrag van een zijdelings perspectief en meten van de hoek dat de staart boven de horizontale kruipende vliegtuig was die tijdens het kruipen cyclus. Larven werden gescoord als hebbende een robuuste staart-flip als de staart verhoogd van meer dan 40 ° boven het horizontale vlak en een milde staart-flip als de staart van minder dan 40 ° boven het horizontale vlak is gerezen. Larven vertonen een normale kruipende gedrag werden gescoord als het hebben van geen staart-flip. De kruipende gedrag van ten minste honderd larven werd geanalyseerd voor elk genotype getest. Deze tabel is gewijzigd van Duncan et al., 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterkte Drosophila melanogaster 's als een modelsysteem voor het bestuderen van functioneren van het zenuwstelsel vloeit grotendeels voort uit de convergentie van de krachtige genetische hulpmiddelen beschikbaar en het brede scala aan robuuste gedrags assays ontwikkeld. Hier presenteren we een eenvoudige en breed toegankelijk microscopie techniek voor het verwerven van een hoge kwaliteit digitale video van Drosophila volwassen en larvale locomotief fenotypes vanuit een zijdelingse perspectief. We hebben met succes gebruikt deze benadering te karakteriseren en kwantificeren van de ernst van posterior verlamming "tail-flip 'fenotypes bij neurologische derde instar larven mutanten waargenomen door direct meten van de maximale hoek die de staart tijdens het kruipen cyclus 14 wordt verhoogd van de horizontale as. Het voordeel van de hier gepresenteerde benadering is dat video wordt verkregen van een laterale oogpunt, waardoor de directe waarneming en analyse van afwijkende locomotief gedrag vaak waargenomen bij neurologische larvale enDult mutanten, vanuit een meer informatieve 'side-view' oriëntatie. Bijgevolg zijn visualisatie van peristaltische spiersamentrekkingen in larvale Drosophila, en afwijkende manier van lopen fenotypes bij volwassen Drosophila gemakkelijker geobserveerd en geanalyseerd. Een beperking van deze techniek is dat het niet een high-throughput benadering. Daarnaast kunnen specifieke Drosophila larven en volwassen gedrag alleen geanalyseerd kort is vanwege de restrictieve volgen gebied geboden door het gezichtsveld van de stereomicroscoop. Dit kan problemen opleveren bij de aanschaf video volwassen Drosophila gedrag, als het volume van de cuvette kamer aanzienlijk groter is dan het gezichtsveld van de stereomicroscoop. We hebben dit probleem aangepakt door het gebruik van katoen en karton inzetstukken aan de cuvet kamer volume te minimaliseren en het beperken van de beweging van de volwassen vliegen naar een ruimte die binnen het gezichtsveld. Terwijl de meerderheid van onze imveroudering is gericht op neurologische larvale mutanten hebben ook gebruik gemaakt van het volwassen mutante fenotypen en gedrag, waaronder verzorgen zien, wat suggereert dat de techniek gemakkelijk kan worden uitgebreid naar analyse van andere Drosophila gedrag zoals vrijage, copulatie en agressie omvatten. Het is mogelijk dat deze techniek nuttig voor de beeldvorming Drosophilidae andere familieleden, evenals andere insecten van vergelijkbare grootte zijn. Bovendien zouden kleine wijziging van de techniek imaging grotere insectensoorten mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
De auteurs willen Alexandra Opie erkennen voor technische bijstand en ondersteuning, James Barton voor het leveren van video-vertelling, en Ramona Flatz en Joellen Sweeney voor het verschijnen in de begeleidende video. Dit werk werd ondersteund door de MJ Murdock Charitable Trust (Grant nummer 2012205 te JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
