Summary
Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии на приобретение высококачественного цифрового видео Drosophila взрослого и личинок мутантных фенотипов с боковой перспективе.
Abstract
Дрозофилы является мощным экспериментальная модель системы для изучения функции нервной системы. Генные мутации, которые вызывают дисфункцию нервной системы часто производят жизнеспособный личинок и взрослых, которые имеют передвижения, дефектные фенотипы, которые трудно адекватно описать с текстом или полностью представляют с одной фотографического изображения. Текущие режимы научных публикаций, однако, поддерживает представление цифрового видео СМИ как дополнительного материала, чтобы сопровождать рукопись. Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии для получения высококачественного цифрового видео как дрозофилы личинок и взрослых фенотипов с боковой перспективе. Видео из личинок и взрослых передвижения от побочного зрения выгодно, потому что это позволяет наблюдать и анализировать тонких различий и вариаций в аберрантных поведения локомотивных. Мы успешно использовали технику для визуализации и количественной aberranт ползет поведения в третий личинок возрастной стадии, в дополнение к взрослым мутантных фенотипов и поведения в том числе ухода.
Introduction
Общая плодовой мушки дрозофилы является мощным экспериментальная модель системы для изучения функции нервной системы 1-3. Эволюционная сохранение структуры и функции нервной системы с человека, а также простота генетических манипуляций и огромный массив генетических инструментов делает Drosophila премьерный организм для моделирования человеческого нейродегенеративных заболеваний 4. Генные мутации, вызывающие дисфункции нервной системы часто приводит к жизнеспособным мутант личинок и взрослых дрозофилы с нарушением двигательной. Фенотипы наблюдаемые в нервной системы дефектных мутантов включают снижение темпов передвижения, аномальным координации и спастических движений у взрослых, а также дефицит в перистальтического сокращения стене мускулатуры и частичный паралич личинок. Эти фенотипы были использованы в разработке высокопроизводительных генетических экранов и опорно-двигательного анализов мутантных личинок 5, 6 и 7-10 взрослых дрозофилы направлена на количественное определение нарушения локомоции и идентификации генов, необходимых для функции нервной системы. В то время как эти подходы являются чрезвычайно полезными для количественного личинок и взрослых локомотивных поведения, они не в состоянии передать качественную информацию о каждом конкретном девиантным поведением. Например, в то время как мутант третьего личинки возрастной стадии могут проявлять измененных параметров передвижения, в поведенческой анализа, это может быть непонятно, является ли это результатом изменений в художественной перистальтических сокращений в течение цикла ползать, общее отсутствие координации, или частичным параличом задней тела стена мускулатура. Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии для получения высококачественного цифрового видео Drosophila взрослого и личинок фенотипов локомотивных от боковой перспективе. Цифровое видео приобрела у боковой перспективе позволяет прямое наблюдение и анализ тонких различий в Локомотиве поведения от более информативное ориентации бокового обзора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Стерео микроскоп Система
Примечание: Хотя этот протокол легко адаптируется практически к любой стерео микроскопа системе, связанной с цифровой камеры с возможностью приобретения видео, информация представлена на системы, используемой в нашей лаборатории (Таблица материалов / оборудования).
- Приобретать цифрового видео с использованием тринокулярный стерео микроскоп, соединенный с коммерческой цифровой камеры.
- Для того, чтобы пара коммерческую цифровую камеру тринокулярной порту стереомикроскопом, удалить ½x C-Mount из фотоэлемента порту стереомикроскопом и заменить его на 1X C-Mount.
- Установите цифровой камеры соединитель (43 мм резьба) к 1X C-Mount.
- Mount две понижающие кольца, 58 мм до 48 мм, и 48 мм до 43 мм, в камеру соединителя сделать мост между цифровыми камерами муфты к переходником объектив для цифровой камеры.
- Установите цифровую камеру к комплекту адаптера объектива.
- Приобретать видео с увеличением микроскопа и оптического зума цифровой набор камеры для комбинированной увеличении примерно 12X (30 кадров в сек, 640 х 480 пикселей). Примечание: увеличение из стереомикроскопа должны быть компенсированы в соответствии с вновь преобразованного 1X C-Mount от тринокулярной порта.
2 изображений Drosophila третьего возраста личинки
- Лента маркером в черный стадии пластины стереомикроскопом соединен с цифровой камеры так, чтобы сторона маркера крышки занимает примерно ⅓ до ¼ вертикальной поле зрения наблюдается в ЖК-мониторе камеры. С помощью маркера вершины, как на стадии личинок, чтобы выполнить изображений, потому что они приходят в ассортименте цветов, которые могут быть использованы для цветового кода и дифференциации генотипов личинок изображаемого.
- Демаркацию поле зрения наблюдается в цифровом ЖК-мониторе камеры на поверхности маркера сверху с тонкой точкемаркер.
- Выберите третьего возраста личинки к изображению. Критерии для выбора третьего личинок Instar был Длина тела, появление от источника питания во время личиночной фазе жизненного цикла, наличием переднего и заднего дыхальца, и структура нижнечелюстных крючков аппарата рта 11. Убедитесь, личинка чист путем промывания его большим количеством воды.
- Освещать постоянный этап маркер верхнюю сверху света от системы волоконно-оптической освещения. Отрегулируйте угол падающего света, чтобы обеспечить оптимальное освещение.
- Фокус микроскоп на краю постоянного маркера сверху. Начните приобретения цифрового видео.
- Поместите личинку на стороне маркера крышкой примерно 75 ° от вертикальной оси, в непосредственной близости от поля зрения, с передней части личинки, обращенной к полю зрения (Рисунок 1). Примечание: Размещение личинки на стороне маркера крышки позволяет камере записывать движения гоэлектронной личинка с боковой перспективе. Это помогает держать личинку влажной водой, чтобы они не падают на сторону маркера крышкой. Необходимо проявлять осторожность, однако, чтобы не использовать слишком много воды, как чрезмерное количество будет придерживаться личинки, как это ползает по полю.
- Аккуратно нащупывать и личинку с небольшим кисти, чтобы принудить его ползать по полю зрения. Будьте терпеливы, как личинки редко сотрудничают и часто должны быть возвращены в исходную точку много раз, прежде чем они ползают прямо по полю.
- Запись примерно 10-15 мин непрерывной цифровой видеозаписи и культуры и удалить все ненужные кадры после приобретения с цифровым программным обеспечением для редактирования видео.
3 изображений для взрослых Drosophila
- Поместите одного взрослого Drosophila в одноразовом 1,5 мл спектроскопического полистирола кювете.
Примечание: CO 2 обезболивание взрослого дрозофилы непосредственно перед BehavПротокол ioral анализ может поставить под угрозу результаты 12. Рекомендуется взрослых Drosophila быть предоставлен период 24-часовом, чтобы оправиться от CO 2 обезболивания перед выполнением в поведенческой тесте 13. - Вставьте конец кюветы с небольшим ватным тампоном. Убедитесь, ватный тампон упакован достаточно плотно, чтобы занять большую крышку пространство и ограничивает муху с уменьшением объема отсека кюветы.
- Поместите кювету на белом стадии пластины стереомикроскопом и правильно выровнять снижение громкости отсек кюветы с полем зрения наблюдается в цифровом ЖК-мониторе камеры.
- Illuminate кювету сверху света от системы волоконно-оптического освещения. Отрегулируйте угол падающего света, чтобы обеспечить оптимальное освещение.
- Фокус микроскопа и начать получать цифровые видео.
- Запись примерно 30-45 мин непрерывной цифровой видеозаписи и культуры и удалить все лишнеекадры после приобретения с цифровым программным обеспечением для редактирования видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно использовали эту технику, чтобы приобретать и количественной оценки личинок поведенческий фенотип, связанный с потерей функции гена stathmin (рисунок 2) 14. Ген stathmin кодирует микротрубочек регуляторный белок, которая разделяет димеров тубулина из пулов растворимого тубулина, и связывает микротрубочки и способствует их разборки 15,16. Функция Stathmin требуется для поддержания целостности микротрубочек в аксонов периферических нервов 14. Срыв stathmin деятельности в дрозофилы личинок третьей возрастной стадии приводит к фенотипу, в котором сегменты задних тела перевернуть вверх после каждого волны перистальтики мышечного сокращения во время цикла сканирования. Это задняя паралич или фенотип 'хвост-флип "является отличительной чертой дефектного аксонов транспорта. Мы количественно пенетрантность и тяжесть задней паралич фенотипа в третьей возрастной стадии личинок из семи различных <EM> stathmin мутантных генотипов путем измерения угла выше горизонтальной хвост был поднят во время цикла ползания (Таблица 1). Личинки были полны решимости проявлять надежную хвост-флип, если хвост был поднят больше, чем 40 ° над горизонталью, когда не ползком, мягкий хвост-флип, если хвост был поднят менее 40 ° над горизонтальной, и не хвост-флип, если личинки выставлены нормальное поведение ползком.
Рис.1 Положение третьей взрослой личинки на постоянной стадии маркер крышки для приобретения цифрового видео от боковой перспективе помощью Стерео микроскоп. Вид сбоку базовой системы Стерео микроскоп с цифровой камеры, установленной на тринокулярной порта. Увеличение вставке показана ориентацию перманентным маркером приклеенный к столике микроскопа и положение третьего возраста личинка на маркера колпачок для приобретения цифрового видео девиантным поведением от бокового зрения. В изображении определены три-измерения пространства; X-ось проходит длину маркером и параллельна столике микроскопа, ось у перпендикулярна оси х и параллельно столик микроскопа, и Z-ось расположена вертикально от маркера крышки к Линза объектива и перпендикулярно к столике микроскопа. Третьей возрастной стадии личинки помещают на стороне маркера крышкой примерно 75 ° от вертикальной оси в направлении оси у, в непосредственной близости от поля зрения цифровой камеры, с передней личинки, обращенной к области зрения. Размещение личинки на стороне колпачка маркера позволяет цифровой камере в соответствии с стереомикроскопа, чтобы записать движение личинки по полю от боковой перспективе.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Рис.2 Изображения представительных результатов. Типичные изображения от цифрового видео дрозофилы личинки (A, B) и взрослого (C, D) фенотипы и поведения приобрела у боковой перспективе. Каждое изображение представляет собой видео стоп-кадра извлекается из приобретенных цифровых видео файлов. () Дикого типа третьего возраста личинка экспонат плоским осанка при обходе вдоль подложки. (B) третьего возраста личинка гомозиготных по мутации в гене stathmin выставки аберрантная ползания хвост-флип поведение, свидетельствует о параличе задней мускулатуры. (C) Крылья дикого типа взрослого дрозофилы проводятся вплотную к телу, как муха ходит. (D) для взрослых Drosophila, гомозиготных по неизвестной мутации, проводят свои крылья на углы около 45 ° выше нормы. Оба аберрантная личинок и взрослых фенотипс Описанные лучше всего наблюдать и общался с цифровым видео, приобретенного с боковой перспективе бокового обзора. В панели А и B в шкалы = 1 мм. Эта цифра была изменена с Дункан и соавт., 2013.
| Тяжесть задней Паралич фенотипа | ||||
| Генотип | н | Нет Хвост-Flip | Мягкий хвост-флип (<40 °) | Прочная Хвост-Flip (> 40 °) |
| дикого типа | 150 | 100.0% (N = 150) | 0.0% (П = 0) | 0.0% (П = 0) |
| нерж B200 / + | 130 | 100.0% (N = 130) | 0.0% (П = 0) | 0.0% (П = 0) |
| нерж rdtp / + | 140 | 100.0% (N = 140) | 0.0% (N =) | 0.0% (П = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100.0% (N = 120) | 0.0% (П = 0) | 0.0% (П = 0) |
| нерж B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| нерж B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | 10.9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| нерж rdtp | 125 | 16,0% (П = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| нерж rdtp / Df (2L) Exel6015 | 140 | 7.7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Таблица 1 Пенетрантность и тяжестьзадняя паралич фенотип наблюдается в stathmin (нерж) мутант дрозофилы третьего возраста личинок. The пенетрантность и тяжесть задней паралич фенотипа stathmin мутантный Drosophila третьего возраста личинок был забит и количественно путем приобретения цифрового видео о поведении с боковой перспективе и измерения угла что хвост был поднят над горизонтальной ползания плоскости во время цикла сканирования. Личинки были забиты как имеющие надежную хвост-флип если хвост был поставлен больше, чем 40 ° над горизонтальной плоскостью, и мягким хвостовой флип если хвост был поставлен менее 40 ° над горизонтальной плоскостью. Личинки демонстрируя обычное поведение переделах были забиты, как не имеющие хвост-флип. Ползающих поведение, по крайней мере сто личинок были проанализированы для каждого генотипа испытания. Эта таблица была изменена с Дункан и соавт., 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сила Дрозофилы 'ы в качестве модельной системы для изучения функции нервной системы значительной мере обусловлено сходимости мощных генетических инструментов доступных и широкого круга надежных поведенческих анализов развитой. Здесь мы представляем простой и широко доступного технику микроскопии для получения высококачественного цифрового видео Drosophila взрослого и личинок фенотипов локомотивных от боковой перспективе. Мы успешно использовали этот подход для описания и оценки тяжести задней паралича 'хвост-флип "фенотипы, наблюдаемые в неврологической третьей возрастной стадии личинок мутантов путем непосредственного измерения максимальный угол, что хвост был поднят от горизонтальной оси во время ползания цикла 14. Преимущество подхода, представленного здесь в том, что видео приобретается с боковой точки зрения, что позволяет прямое наблюдение и анализ аберрантных локомотивных поведения, часто наблюдается в неврологических личинок иDult мутанты, с более информативным "бокового обзора" ориентации. Следовательно, визуализация перистальтических сокращений мышц в личиночной дрозофилы, и аберрантных походки фенотипов во взрослой дрозофилы более легко замечены и разобраны. Одно ограничение этого метода является то, что он не является высокой пропускной подход. Кроме того, конкретные Drosophila личинки и взрослые формы поведения могут быть проанализированы только в течение коротких периодов времени в связи с ограничительной зоны слежения, обеспечиваемой поле зрения стерео микроскопом. Это может быть особенно проблематичным при приобретении видео для взрослых поведения Drosophila, а объем камеры кюветы значительно больше, чем поле зрения стереомикроскопа. Мы решили эту проблему с помощью хлопка и картонных вкладышей, чтобы свести к минимуму объем камеры кюветы и ограничивают движение взрослого лететь в пространстве, содержащейся в поле зрения. В то время как большинство наших имстарение была сосредоточена на неврологических личинок мутантов, мы также использовали технику наблюдать взрослых мутантных фенотипов и поведения, в том числе ухода, предполагая, что техника может быть легко расширена за счет включения анализ других поведения дрозофилы, таких как ухаживания, спаривания и агрессии. Вполне возможно, что эта методика может быть полезна для визуализации других членов семьи Drosophilidae, а также других насекомых такого же размера. Кроме того, незначительные модификации в технике позволили бы визуализацию крупных видов насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, что не существует конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Александру Опи для технической помощи и поддержки, Джеймс Бартон за предоставление видео повествование, и Рамона Flatz и Joellen Суини за появление в сопроводительном видео. Эта работа была поддержана MJ Мердок Благотворительный фонд (грант № 2012205 на JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
