La inducción de la proteína a través de Supresión In Utero La electroporación para definir Déficits en Neuronal migración en modelos transgénicos

Resumen

La migración neuronal está regulada por numerosos factores autónomos y no autónomos de células. Este protocolo muestra cómo se puede utilizar la electroporación en el útero para determinar si un fenotipo en un ratón transgénico se debe a la interrupción de un mecanismo intrínseco celular o al deterioro de la interacción entre la neurona y su entorno.

Resumen

Supresión genética utilizando el sistema Cre-Lox en líneas de ratones transgénicos es una herramienta poderosa para estudiar la función de la proteína. Sin embargo, excepto en los modelos muy específicos Cre, la supresión de una proteína a lo largo de un tejido o célula de la población a menudo conduce a fenotipos complejos resultantes de múltiples mecanismos que interactúan. La determinación de si un fenotipo resultados de la interrupción de un mecanismo autónomo celular, que es intrínseca a la célula en cuestión, o desde un mecanismo autónomo no celular, que resultaría de deterioro del medio ambiente de esa célula, pueden ser difíciles de discernir. Para obtener una perspectiva de la función de proteínas en un contexto in vivo, in utero electroporación (IUE) permite la supresión de genes en un pequeño subconjunto de células dentro de la corteza en desarrollo o alguna otra región del cerebro seleccionada. IUE se puede utilizar para apuntar a áreas específicas del cerebro, incluyendo el telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, el hipocampo, o eminencia ganglionar. Esto facilita la observación of las consecuencias de célula autónoma deleción del gen en el contexto de un entorno saludable. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo IUE se puede utilizar para analizar un defecto en la migración radial en una línea de ratones transgénicos floxed, con énfasis en la distinción entre los efectos de células autónomas autónomos y no celulares de eliminación de proteínas. Al comparar el fenotipo resultante de la deleción del gen dentro de toda la corteza en comparación con deleción del gen mediada por IUE en una población celular limitada, una mayor comprensión de la función de proteínas en el desarrollo del cerebro se puede obtener mediante el uso de cualquiera de las técnicas en el aislamiento.

Introducción

Migración radial es un proceso fundamental para el desarrollo cortical temprana. Depende de una variedad de factores autónomos celulares, tales como correcta la salida de mitosis y la diferenciación neuronal, la polaridad celular, regulación de la dinámica y la expresión de receptores transmembrana del citoesqueleto, así como los factores autónomos no celulares, tales como la formación del andamio glial radial y secreción de orientación migratoria moléculas ^1-3. Desde la interrupción de cualquiera de estos mecanismos puede perjudicar la migración neuronal en un modelo de ratón transgénico ^4-8, la determinación de la causa subyacente de un defect....

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Cuidado de Animales de Ottawa, la adhesión a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.

Preparación 1. Pre-quirúrgico y de los Materiales

1. Preparación de plásmido:
   1. Preparar plásmidos utilizando el Qiagen Megaprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. Inocular al menos 400 ml de caldo LB con bacterias transformadas para asegurar un alto rendimiento de ADN y se incuba durante la noche.
   2. Plásmido Resuspender en 100-200 l TE a una concentración final de al menos 5 g / l. ADN Alícuota y almacenar a -20 ° C. S....

Resultados

Se pueden dirigir la electroporación a diferentes regiones del cerebro variando la orientación de los electrodos de paleta sobre la cabeza del embrión (Figura 2). Para todas las partes del prosencéfalo, se inyecta el plásmido en el ventrículo lateral (el rombencéfalo puede ser dirigido inyectando en el cuarto ventrículo). En general, coloque los electrodos de manera que la línea recta entre ellos atraviese la región de interés, con el ADN siendo atraído hacia el electrodo positivo. Para dirigirse a la co.......

Discusión

Dos de los principales desafíos en la realización en electroporaciones útero son 1) la prevención de letalidad embrionaria y 2) la disminución de la variabilidad entre electroporaciones. Uno de los factores más importantes en la prevención de la letalidad es la calidad de la aguja, como agujas romas infligen más daño al embrión. Al cortar la aguja, mantener la punta el mayor tiempo posible mientras que todavía permite una gotita visible de 0,1-0,2 l de fluido a aparecer después de una bomba de la palet.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ECM 830 Electroporador de onda cuadrada	BTX Aparato Harvard	45-0052	Solo electroporador – compre cables por separado (45-0204)
1250FS Interruptor de pedal para aparato ECM 830	BTX Harvard	45-0211	La paleta de pie es necesaria para la electroporación con manos libres
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5 mm) y nbsp;               45-0488 (7mm)	Electrodos estilo pinza de platino
Femtojet	Eppendorf	920010504	Microinyector
Griphead 0	Eppendorf	920007414	Sujeta la aguja tirada
Soporte capilar universal	Eppendorf	920007392	Conecta el cabezal de agarre al tubo
Tubo de inyección	Eppendorf	920007431	Conecta el soporte capilar a Femtojet
Pedal de control	Eppendorf	920005098	Paleta de pie para inyección manos libres
Puntas de microcargador	Eppendorf	930001007	Puntas para cargar los tubos capilares estirados
Plásmido Mega Kit	Qiagen	12181	5 QIAGEN-tip 2500, Reactivos, Tampones
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Tinte no tóxico
Tijeras Bonn extrafinas	Herramientas de ciencia fina	14084-08	Para recortar las agujas
Tijeras de estrabismo	Bonn Herramientas de ciencia fina	14084-09
Pinzas Graefe	Herramientas de ciencia fina	11050-10
Retractores colibrí	Herramientas de ciencia fina	17000-03
Grapadora	Herramientas de ciencia fina	12031-07	Para clips
de 7 mmCastroviejo Portaagujas	Herramientas Médicas	SNH-6737	Recto, con bloqueo
Tirador de Agujas	Narishige	PC-10	Para la tracción de microcappilares
Microcapilares	Drummond	1-000-800	0,4 mm de diámetro interior tubos capilares de vidrio

rectos