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Artículo de método

La inducción de la proteína a través de Supresión In Utero La electroporación para definir Déficits en Neuronal migración en modelos transgénicos

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DOI:

10.3791/51983

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12 de enero de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

La migración neuronal está regulada por numerosos factores autónomos y no autónomos de células. Este protocolo muestra cómo se puede utilizar la electroporación en el útero para determinar si un fenotipo en un ratón transgénico se debe a la interrupción de un mecanismo intrínseco celular o al deterioro de la interacción entre la neurona y su entorno.

Resumen

Supresión genética utilizando el sistema Cre-Lox en líneas de ratones transgénicos es una herramienta poderosa para estudiar la función de la proteína. Sin embargo, excepto en los modelos muy específicos Cre, la supresión de una proteína a lo largo de un tejido o célula de la población a menudo conduce a fenotipos complejos resultantes de múltiples mecanismos que interactúan. La determinación de si un fenotipo resultados de la interrupción de un mecanismo autónomo celular, que es intrínseca a la célula en cuestión, o desde un mecanismo autónomo no celular, que resultaría de deterioro del medio ambiente de esa célula, pueden ser difíciles de discernir. Para obtener una perspectiva de la función de proteínas en un contexto in vivo, in utero electroporación (IUE) permite la supresión de genes en un pequeño subconjunto de células dentro de la corteza en desarrollo o alguna otra región del cerebro seleccionada. IUE se puede utilizar para apuntar a áreas específicas del cerebro, incluyendo el telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, el hipocampo, o eminencia ganglionar. Esto facilita la observación of las consecuencias de célula autónoma deleción del gen en el contexto de un entorno saludable. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo IUE se puede utilizar para analizar un defecto en la migración radial en una línea de ratones transgénicos floxed, con énfasis en la distinción entre los efectos de células autónomas autónomos y no celulares de eliminación de proteínas. Al comparar el fenotipo resultante de la deleción del gen dentro de toda la corteza en comparación con deleción del gen mediada por IUE en una población celular limitada, una mayor comprensión de la función de proteínas en el desarrollo del cerebro se puede obtener mediante el uso de cualquiera de las técnicas en el aislamiento.

Introducción

Migración radial es un proceso fundamental para el desarrollo cortical temprana. Depende de una variedad de factores autónomos celulares, tales como correcta la salida de mitosis y la diferenciación neuronal, la polaridad celular, regulación de la dinámica y la expresión de receptores transmembrana del citoesqueleto, así como los factores autónomos no celulares, tales como la formación del andamio glial radial y secreción de orientación migratoria moléculas 1-3. Desde la interrupción de cualquiera de estos mecanismos puede perjudicar la migración neuronal en un modelo de ratón transgénico 4-8, la determinación de la causa subyacente de un defecto en la migración puede ser un proceso complejo y difícil. En el útero de electroporación (IUE) se puede utilizar para complementar y simplificar interpretación del fenotipo de un modelo genético knock-out y por lo tanto dilucidar los mecanismos importantes que se requieren para la migración radial 7,9-11.

En electroporación in utero (IUE) es el proceso por el cual un carryi plásmido ng tanto un gen de interés y un reportero se inyecta en el ventrículo en el cerebro de un ratón o rata embrión y luego introduce en las células que recubren el ventrículo a través del uso de una corriente eléctrica 12-14. Esto permite al investigador analizar el efecto de arriba o hacia abajo regulación de un gen de interés en el desarrollo o la función de las neuronas electroporadas. Después de IUE, cerebros pueden ser procesadas para inmunohistoquímica 7,9-11, electrofisiología 15 o cultivo celular 16,17. La principal ventaja de IUE es que se permite la manipulación altamente específica de la expresión génica. Además, IUE se puede utilizar para apuntar a una región específica del cerebro en desarrollo a través de una corriente (Figura 2) se indica. IUE también se puede utilizar para dirigirse a un tipo celular específico a través de la inyección de plásmidos que llevan genes bajo el control de diferentes promotores o sistemas de activación plásmido (inducida por tetraciclina de la expresión génica es un ejemplo) 10,18-21.

jove_content "> IUE puede ser utilizado en conjunción con el sistema de escisión de genes mediada por Cre-Lox 7-9,11,22. Un plásmido que contiene un gen que codifica el mensaje para la proteína Cre puede someterse a electroporación en un embrión homocigotos para el alelo floxed ( en el que las regiones de genes o ADN específica están flanqueadas por dos sitios loxP para Cre recombinación de ADN mediada). Cre entonces inducir la recombinación del gen de interés específicamente en los precursores neuronales electroporadas, generando un knock-out de la floxed allele.The efecto de proteína desmontables sobre la migración y el desarrollo dentro de las neuronas individuales neural puede entonces ser estudiada. La electroporación de Cre induce la recombinación en una pequeña población de células afectadas, dejando el entorno de apoyo intacto. En cambio, la expresión específica de tejido de Cre bajo el control de un tipo celular específico promotor, se produce a lo largo de todo el tejido de modo que ambos neuroblastos migran y el ambiente circundante podrían verse afectados. Por lo tanto, juxtaposition de estos dos enfoques puede determinar si un defecto migración dada es debido a los teléfonos mecanismos no autónomos autónomos o celulares. La migración defectuosa en ambos sistemas experimentales sugiere que los resultados fenotipo observado desde un mecanismo autónomo de la célula; la migración normal después de la electroporación de Cre con la migración defectuosa en un modelo de Cre específica de tejido indica que el gen de interés está actuando a través de un mecanismo autónomo no celular.

IUE también se puede utilizar para llevar a cabo experimentos de rescate por electroporación genes que interactúan potenciales en animales knock out 7,9,10. Por ejemplo, un investigador podría intentar rescatar a un fenotipo de la migración en un modelo transgénico por electroporación un blanco de abajo y determinar si el defecto se corrige en la migración de las neuronas a electroporación. Esto tiene la ventaja adicional de que un rescate exitoso indica que la migración normal puede ser restaurado mediante la manipulación de la expresión de proteínas en un speneurona especí-, a pesar de que el ambiente circundante todavía es deficiente para el gen diana. Una vez más, este enfoque es más tiempo y rentable que cruzar o la generación de líneas transgénicas, con el beneficio añadido de determinar si el mecanismo defectuoso es la célula autónoma.

IUE se puede utilizar para realizar un seguimiento de la migración de las neuronas a través de electroporación de un plásmido reportero en knock out embriones (Figura 4C). Como sólo las neuronas que recubren el ventrículo en el momento de la cirugía se electroporan 17, IUE se puede utilizar para seguir las neuronas nacidos en un momento determinado con la ventaja de visualización de su morfología in vivo.

Finalmente, es posible utilizar IUE para apuntar regiones del cerebro tales como el telencéfalo o medial dorsal, hipocampo o eminencia ganglionar (Figura 2). Esto le da a los investigadores la facultad de investigar la función de genes en un área específica independiente de complicaciones de Resultadosción de la proteína desmontables en las estructuras vecinas.

Proteína retinoblastoma (pRb), p107 y p130 comprenden la familia de proteínas bolsillo y se los reguladores de salida del ciclo celular bien establecido. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que estas proteínas también regulan el ciclo celular aspectos independientes del desarrollo neural. Como hemos demostrado anteriormente, pRb y p107 desempeñan un papel crucial tanto tangencial 4,23 y la migración radial 6. Aquí, nos demuestran el papel de la proteína bolsillo familiares pRb y p107 en la migración neuronal 6 de ejemplificar el uso de electroporación en el útero de la CRE en un modelo transgénico. En resumen, IUE proporciona una poderosa manera de analizar los efectos de células autónomas de supresión de genes (o sobreexpresión). Cuando se combina con específica noquear modelos tejidos, IUE puede proporcionar información adicional con respecto a los mecanismos que controlan la migración neuronal.

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Protocolo

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Cuidado de Animales de Ottawa, la adhesión a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.

Preparación 1. Pre-quirúrgico y de los Materiales

  1. Preparación de plásmido:
    1. Preparar plásmidos utilizando el Qiagen Megaprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. Inocular al menos 400 ml de caldo LB con bacterias transformadas para asegurar un alto rendimiento de ADN y se incuba durante la noche.
    2. Plásmido Resuspender en 100-200 l TE a una concentración final de al menos 5 g / l. ADN Alícuota y almacenar a -20 ° C. Si la concentración es demasiado baja, no precipitan y resuspender ya que esto puede añadir impurezas. Empezar de nuevo con una nueva preparación.
    3. Antes de la cirugía, diluir un único plásmido (Cre-GFP por ejemplo) a 2 g / l en agua estéril con 1 l de 0,1% (w / v) de colorante Fast Green por 10 o 20 l de solución de plásmido diluido. Si las buenas prácticas agrariasy el gen de interés están a ser co-electroporación en plásmidos separados, inyectar el plásmido GFP y el plásmido que lleva el gen de interés en una proporción de 1: 4 para maximizar la probabilidad de que todas las casillas marcadas con GFP se electroporación-Co con tanto plásmidos.
  2. Tire tubos microcapilares vidrio (1 mm de diámetro exterior - en adelante como agujas) en un extractor de aguja estándar, utilizando un solo tirón paso a los 62 ° C.
  3. Autoclave un paquete quirúrgico que contiene los siguientes: porta-agujas, retractor de heridas, pinzas, tijeras para cirugía, tijeras para agujas, grapadora, grapas, gasas, cubiertas de heridas, paños quirúrgicos (Figura 1A, B, Tabla de Materiales).
  4. Recoge otras herramientas necesarias: electroporador, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 o 7 mm), solución salina, sutura, 5 ml jeringa (Tabla de Materiales).

2. Prepare ratón de Cirugía

  1. Para el manejo del dolor, inyectar un p-cronometradoratón reinante con buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) una hora antes de la cirugía. Aplicar este protocolo para ratones cronometrados en cualquier lugar de embriones día 12,5 (E12.5) a E17.5.
  2. Utilice Microloader puntas de pipeta para respaldar carga sacó agujas con la solución de plásmido. No llene hasta el final en la punta de la aguja todavía porque esto hará que la aguja se obstruya.
  3. Anestesiar ratón utilizando gas isoflurano 2-5% con 1 L / min O 2. Una vez inmóvil, coloque en la máscara de la cara y aplique el ungüento en los ojos para evitar que se seque. Inyectar con 1 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) por vía subcutánea en la espalda.
    NOTA: Cuando se trabaja con gas isoflurano, use un eliminador de gas para recuperar el exceso de gas y evitar que se escapen a la habitación.
  4. Afeitado abdomen. Lave abdomen con Chlorohexadine matorrales, enjuague con agua y aplicar una solución final de preparación de chlorohexadine y etanol al 70%. Ratón cubierta con paño o una gasa estéril para cubrir la piel, pero dejan abdomen descubierto (Figura 1 C, D).

3. En electroporación in utero

  1. Hacer una incisión en la piel sobre el abdomen, entre los pezones inferiores. Tire de la piel de la capa muscular subyacente por desgarro del tejido conectivo, luego se corta a través del peritoneo a la cavidad abdominal a lo largo de la línea alba. Insertar el retractor de la herida para tirar de los bordes de la herida aparte.
  2. Extirpar el útero de la cavidad abdominal y ponerlo hacia fuera como se muestra (Figura 1E).
    1. Si son diferentes crías para ser inyectado con diferentes plásmidos (tales como GFP vs. GFP con el gen de interés), contar los cachorros en cada lado y decidir cuáles y cuántos para inyectar con cada plásmido. Reemplazar un lado del útero en el abdomen para mantener los embriones cálido y lubricado. Inmediatamente humedecer el útero expuesta con solución salina (preferiblemente calentado a la temperatura corporal).
    2. Si la inyección de todos los cachorros con el mismo plásmido (por ejemplo, cuando la inyección de Cre-GFP en embriones transgénicos) ONLy eliminar un cuerno del útero a la vez.
  3. Ponga una aguja colocada en la cabeza de agarre de la varita de inyección y corte cuidadosamente la punta con un par de pequeñas tijeras quirúrgicas o unas pinzas finas. Cortar la punta de modo que la aguja se mantiene tanto tiempo como sea posible mientras que todavía permite que el fluido pase a través (Figura 1Ji-iv).
    1. Ajuste la longitud de la inyección (en segundos) y la presión de inyección en el microinyector modo que una pequeña gotita pero fácilmente visible de 0,1-0,2 l aparece en la punta de la aguja cuando se presiona la paleta pie. Mantenga el volumen de esta gotita tan consistente como sea posible entre las diferentes agujas.
      NOTA: este paso es crucial para la supervivencia de los embriones (véase el debate).
    2. Utilice los siguientes parámetros de inyección para la FemtoJet: la inyección de presión (pi) = 250-300 hPa; tiempo de inyección (ti) = 0,8-1,2 seg; presión compensación = 10 a 50 hPa. Si es necesario, ajustar estos parámetros para adaptarse a la variación entre las agujas.
  4. Selegir un embrión y suavemente colóquelo en su espalda, la cabeza inclinada hacia arriba (Figura 1F).
    NOTA: Esto puede requerir girar o cambiar el embrión; tenga cuidado de no aplicar demasiada presión y evitar la ruptura del saco amniótico durante la manipulación del embrión.
  5. Una vez que el embrión está en su lugar, localizar el ventrículo, que se presenta como una forma de media luna sombra paralela al seno sagital. Toque la punta de la aguja en el útero por encima del ventrículo en un ligero ángulo y guiar la aguja a través de la pared uterina. La cantidad de presión requerida depende de la nitidez de la aguja. Introducir la aguja a través de la corteza hacia el ventrículo.
    NOTA: A pesar de que no suele haber resistencia detectable adicional, la cabeza del embrión se empuja a menudo lejos un poco y luego retrocede cuando la aguja pasa a través de la corteza hacia el ventrículo.
  6. Bombear el paddle pie para inyectar la solución de plásmido. Continuar bombeando hasta que un área verde es visible y se ajusta a laforma de arco del ventrículo (Figura 1G). En los embriones jóvenes (E12.5 a E14.5) el colorante a menudo se difundirá en el ventrículo contralateral.
    NOTA: El número de bombas depende del diámetro de la punta de la aguja, la edad del embrión (y tamaño resultante del ventrículo) y el volumen de inyección deseado. Mantenga el volumen inyectado tan consistente como sea posible entre los embriones.
  7. Inyectar tres o cuatro embriones. Mantenga todos los embriones expuestos húmedas con solución salina durante todo el procedimiento.
  8. Volver a los primeros embriones inyectados y colocar las paletas tal que el electrodo positivo atraerá el plásmido en la región deseada del cerebro (Figura 1H). Ángulo el electrodo negativo de modo que el camino más corto entre los electrodos pasa directamente a través de la estructura específica para la electroporación (Figura 2).
  9. Una vez que las palas estén en su lugar, aplique el choque. Dependiendo de la edad y el tamaño de los embriones, utilizar 5 pulsos de 35-50 V (ver T1 poder). Utilice los siguientes parámetros de electroporación: longitud de pulso de 5 ms, con un intervalo de pulso de 950 ms. Repita el procedimiento con todos los embriones inyectados.
  10. Cortar la punta de aguja nueva pre-cargado como en el paso 3.3, según la última aguja probable seca y se obstruyen durante el paso 3.9. Inyectar el siguiente conjunto de tres o cuatro embriones, ya sea con el mismo plásmido o un plásmido diferente y luego aplicar el choque como en el paso 3.9. Cuando se inyectan todos los cachorros en un lado del útero, retire el segundo lado del útero del abdomen de la hembra y luego vuelva a colocar el lado completado para mantenerlo caliente.
  11. Volver ambos lados del útero a la hembra teniendo cuidado de mantener la superficie húmeda con solución salina y no aplicar demasiada presión para evitar traumatismos en las bolsas amnióticas. Suturar la capa muscular cerrado usando un simple puntada continua. Grapa la piel cerrada. Si las grapas no están disponibles, suturar la piel con una puntada simple interrumpida. (Figura 1I)
  12. Mientras suturing, gire progresivamente el isoflurano para permitir la anestesia de la mujer embarazada para aclarar.
    NOTA: Esto acelerará el despertar de la presa después de la cirugía es completa; manteniendo la hembra anestesiados durante un tiempo tan corto como sea posible mejorará la supervivencia del embrión. Tiempo quirúrgico total, a partir de cuando la hembra está anestesiado primero, debe ser de aproximadamente 30 min.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Coloque la hembra suturado en una incubadora o en una almohadilla de calefacción para recuperarse de la anestesia. Su cama en ropa de cama limpia y colocar un gel de recuperación estándar en la jaula a mantener la hidratación. Para el manejo del dolor después de la cirugía, darle las mujeres tres dosis de buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) en intervalos de 8 h después de la cirugía, luego cuatro dosis adicionales a intervalos de 12 h.

5. Los cerebros de cosecha

NOTA: Los cerebros se pueden cosechar en cualquier edad hasta la edad adulta. Se aplica lo siguientepara la recogida de cerebros antes del nacimiento. Tenga en cuenta que una vez que nacen las crías, el orden dentro del útero se pierde, así que o cada cachorro de la camada debe ser inyectado con el mismo plásmido, u otro método para diferenciar entre el control y los animales de experimentación se debe desarrollar.

  1. Preparar frío (4 ° C), se filtró 4% de paraformaldehído (PFA) antes de la eutanasia hembra.
  2. La eutanasia a la hembra mediante una inyección intraperitoneal de una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal) y cortar abdomen abierto. Tire de ambos lados del útero y diseñar como cuando las crías se inyectaron inicialmente.
    1. En el caso en el que todos los cachorros recibieron el mismo plásmido, por ejemplo, cuando la inyección de Cre en una camada transgénicos, orden embrión no es importante, por lo tanto, cortar el útero de la hembra y el lugar en PBS.
    2. Si se inyectaron cachorros con diferentes plásmidos, asegúrese de ubicar cada cachorro, observando cualquier crías muertas, y determinar cuáles fueron inyectados con el control y experimenplásmidos am- antes de la extirpación del útero de la hembra. Tenga cuidado de no perder de vista que las crías pertenece a qué grupo después de que el útero está en PBS.
  3. Retire cada cachorro individualmente, decapitar con tijeras afiladas o una hoja de afeitar y colocar la cabeza en PBS. En el caso de los ratones transgénicos, recolectar muestras de tejido para el genotipado y mantener cada cabeza separada, tal como en una placa de 12 pocillos.
  4. Bajo un microscopio de disección, retire el cerebro del cráneo, teniendo cuidado de no cortar la corteza o rasgar la línea media. El uso de un microscopio de fluorescencia, comprobar para ver si el cerebro tienen una GFP + parche, lo que indica que se sometieron a electroporación con éxito.
  5. Fijar cerebros por inmersión en PFA a 4 ° C durante la noche.
    NOTA: Compruebe los cerebros para la expresión de GFP antes de la fijación desde PFA menudo apaga la señal.
  6. Cerebros Cryoprotect través de la inmersión en el 20% de sacarosa durante al menos tres días antes de la congelación. Utilice un gradiente de sacarosa de 10%, 15% y 20% (24 h en cada solución) to prevenir el daño tisular debido a la presión osmótica. Almacenar cerebros congelados a -80 ° C y cortar en un criostato a 10-14 micras de espesor secciones.

6. Co-tinción con anti-GFP

NOTA: Si la recuperación de antígenos es necesario para co-mancha con anti-GFP, es importante utilizar un protocolo de recuperación de antígeno suave que no comprometa la señal de GFP. Algunos protocolos de recuperación de antígeno son demasiado duras para utilizar en conjunción con la tinción de GFP (incluso con un anticuerpo contra GFP). Un ácido cítrico básica pre-tratamiento antes de la aplicación del anticuerpo primario tiene éxito para la mayoría de los epítopos 24.

  1. Prepare una solución de ácido cítrico 0,01 M en ddH 2 O. pH a 6 utilizando un medidor de pH calibrado.
  2. Ácido cítrico de calor en la cámara de tinción en el microondas o al baño maría hasta que los ácidos cítrico alcanza 75-80 ° C. Ponga las diapositivas en la cámara de tinción durante 10-15 min. Mantenga la temperatura lo más estable posible.
  3. Lávese las diapositivas en PBS3x durante 3 min a temperatura ambiente. Aplicar el anticuerpo primario y proceder con la inmunotinción de acuerdo con un protocolo estándar.
  4. Validar Cre escisión mediada por la co-etiquetado para GFP y el gen de interés para confirmar derribar (Figura 3A).

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Resultados

Se pueden dirigir la electroporación a diferentes regiones del cerebro variando la orientación de los electrodos de paleta sobre la cabeza del embrión (Figura 2). Para todas las partes del prosencéfalo, se inyecta el plásmido en el ventrículo lateral (el rombencéfalo puede ser dirigido inyectando en el cuarto ventrículo). En general, coloque los electrodos de manera que la línea recta entre ellos atraviese la región de interés, con el ADN siendo atraído hacia el electrodo positivo. Para dirigirse a la co...

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Discusión

Dos de los principales desafíos en la realización en electroporaciones útero son 1) la prevención de letalidad embrionaria y 2) la disminución de la variabilidad entre electroporaciones. Uno de los factores más importantes en la prevención de la letalidad es la calidad de la aguja, como agujas romas infligen más daño al embrión. Al cortar la aguja, mantener la punta el mayor tiempo posible mientras que todavía permite una gotita visible de 0,1-0,2 l de fluido a aparecer después de una bomba de la palet...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Estamos en deuda con Pierre Mattar y Freda Miller por su ayuda con la electroporación in utero y con Noel Ghanem y Bensun Fong por crear diagramas. Agradecemos a Linda Jui y Jason G. MacLaurin por su excelente asistencia técnica. El equipo contó con el apoyo del Centro para la Recuperación del Ictus.

Este trabajo fue apoyado por una beca de HSFO y OGS para D.S.S. y una beca CIHR para R.S.S.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ECM 830 Electroporador de onda cuadradaBTX Aparato Harvard45-0052Solo electroporador – compre cables por separado (45-0204)
1250FS Interruptor de pedal para aparato ECM 830BTX Harvard45-0211La paleta de pie es necesaria para la electroporación con manos libres
TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-0489 (5 mm) y nbsp;               45-0488 (7mm)Electrodos estilo pinza de platino
FemtojetEppendorf920010504Microinyector
Griphead 0Eppendorf920007414Sujeta la aguja tirada
Soporte capilar universalEppendorf920007392Conecta el cabezal de agarre al tubo
Tubo de inyecciónEppendorf920007431Conecta el soporte capilar a Femtojet
Pedal de controlEppendorf920005098Paleta de pie para inyección manos libres
Puntas de microcargadorEppendorf930001007Puntas para cargar los tubos capilares estirados
Plásmido Mega KitQiagen121815 QIAGEN-tip 2500, Reactivos, Tampones
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5GTinte no tóxico
Tijeras Bonn extrafinasHerramientas de ciencia fina14084-08Para recortar las agujas
Tijeras de estrabismoBonn Herramientas de ciencia fina14084-09
Pinzas GraefeHerramientas de ciencia fina11050-10
Retractores colibríHerramientas de ciencia fina17000-03
GrapadoraHerramientas de ciencia fina12031-07Para clips
de 7 mmCastroviejo PortaagujasHerramientas MédicasSNH-6737Recto, con bloqueo
Tirador de AgujasNarishigePC-10Para la tracción de microcappilares
MicrocapilaresDrummond1-000-8000,4 mm de diámetro interior tubos capilares de vidrio
rectos

Referencias

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