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Artículo de método

El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

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DOI:

10.3791/52012

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21 de diciembre de 2014

 , 
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

La recapitulación del microambiente específico del órgano, que estimula la angiogénesis local, es indispensable para la regeneración exitosa de los tejidos dañados. Este informe demuestra un método novedoso para implantar geles de fibrina en la superficie pulmonar de ratones vivos con el fin de explorar cómo el microambiente específico del pulmón modula la angiogénesis y la regeneración alveolar en ratones adultos.

Resumen

Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel - mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.

Introducción

El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares.

Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de larga duración crónicas respiratorias como dificultad para respirar, opresión en el pecho, tos persistente y cansancio, que deterioran significativamente su vida diaria 1-3. A pesar de una gran cantidad de esfuerzo para desarrollar terapias eficaces para estas enfermedades de los pulmones, en la actualidad no existe una cura; Por lo tanto, la calidad de vida de estos pacientes es pobre y económica y los costos humanos son high 4-7. En la actualidad, el trasplante de pulmón es la única manera de salvar a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas en fase terminal. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de trasplante, de alto costo, complicaciones graves, y la baja tasa de supervivencia 8-11, el trasplante no es un enfoque óptimo. Rápidos progresos recientes en las técnicas de ingeniería de tejidos ha permitido a los investigadores bioingeniería pulmón implantable por repoblar descelularizado pulmonar completo con varios tipos de células progenitoras o células madre pluripotentes inducidas (iPS) células 12,13. Sin embargo, estos pulmones bioingeniería son funcionales en animales huéspedes sólo durante varias horas después 12,14,15 implantación. Utilizando biomateriales para regenerar las complejas estructuras y funciones de los pulmones ha sido también bastante éxito. Esto puede deberse a que los procesos biológicos fundamentales que rigen la regeneración pulmonar de adultos no han sido bien explorado. En el pulmón, la formación del sistema vascular es uno de los acontecimientos más tempranos y más importantes duriel desarrollo y la regeneración 16-21 ng. Vasculaturas recién formado en el pulmón no sólo entregar oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares necesarios para la formación de órganos, sino que también proporcionan señales reguladoras instructivos a las células circundantes 22-25. Por lo tanto, la angiogénesis juega un papel clave en alveolarization regenerativa en pulmones adultos 24,26,27. Además, la angiogénesis desregulada contribuye a enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) 28, la displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, y fibrosis pulmonar 29. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la ingeniería de los pulmones o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas, es necesario comprender los mecanismos fundamentales de la angiogénesis pulmonar específica.

Cada órgano muestra las propiedades mecánicas y químicas únicas, que pueden diferir entre las condiciones fisiológicas y patológicas 30-33. Estos microenviron órgano-específicamentos regulan los comportamientos de las células endoteliales y orquestan formación de la red vascular de una manera específica de órgano 24,34-36. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la regeneración de pulmón, el mecanismo subyacente a la angiogénesis pulmonar específica necesita ser entendido. Mientras ensayos de angiogénesis in vivo convencionales tales como la implantación subcutánea de hidrogel se han utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Recientemente, un nuevo método para implantar Matrigel en un molde elástico en el pulmón de ratón ha sido desarrollado y demostrado con éxito para reclutar vasos sanguíneos y células epiteliales del pulmón en los geles 22. Este enfoque único permitirá a los investigadores explorar el mecanismo de la angiogénesis-pulmón específico, así como las interacciones entre los vasos sanguíneos y las células pulmonares no vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas. Desde 1) Matrigel no es adecuado para la aplicación clínica; 2) el correomolde lastic utilizado para lanzar el gel puede afectar a las interacciones entre los hidrogeles y tejido pulmonar anfitrión y 3) el molde elástico en el pulmón potencialmente causa un deterioro de la función pulmonar y el dolor durante la respiración, como un enfoque más clínicamente relevante, una matriz de fibrina 3D que contiene factores angiogénicos (factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) ha sido implantado en el pulmón de ratón sin poner en el molde elástico, y se ha recapitulado éxito anfitrión angiogénesis pulmonar derivados. Gel de fibrina, fibrillas de polímeros generados a partir de fibrinógeno escindido por trombina, es conocido para atrapar una variedad de factores angiogénicos como bFGF y VEGF para acelerar la angiogénesis in vivo 40,41. Debido a su capacidad regenerativa y la naturaleza biodegradable 42, gel de fibrina se utiliza ampliamente en el campo de la ingeniería de tejidos.

Este artículo presenta un enfoque novedoso y único para implante de gel de fibrina en la superficie pulmonar de adult vivirt ratón y demuestra que anfitrión angiogénesis pulmonar derivado se recapitula el interior de los geles en vivo. Este método, que permite a los investigadores estudiar la angiogénesis pulmonar específica, es probable que conduzca al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares y avanzar significativamente los esfuerzos para regenerar con éxito pulmón adulto.

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Protocolo

NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles.

1. Preparación del gel de fibrina

  1. Preparar gel de fibrina que contiene VEGF y bFGF.
    1. Descongelar las soluciones madre de fibrinógeno y trombina que se almacenan a -80 ° C hasta la temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Añadir la trombina (concentración final: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentración final: 45 mM), VEGF (concentración final: 0-100 ng / ml) y bFGF (concentración final: 0-100 ng / ml) a la fibrinógeno solución (concentración final: 12,5 mg / ml en 0,9% sodium solución de cloruro 43-45) en un tubo de 1,5 ml.
    3. Mezclar suavemente con la pipeta.
    4. Pipetear suavemente 200 l de la mezcla en un plato de plástico estéril de una forma gota a gota utilizando puntas de pipeta p200.
    5. Incubar las gotas a 37 ° C durante 30-60 minutos hasta que se solidifican.
      NOTA: El gel solidificado se puede mantener en el plato de plástico sellada a temperatura ambiente (25 ° C) durante varias horas antes de la implantación (Figura 1a).
  2. Recorte el gel de fibrina en aproximadamente 3 x 3 x 3 cubos mm utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas antes de la implantación.

2. Preparación del ratón

  1. Anestesie ratón adulto (8-12 semanas) mediante inyección intraperitoneal (IP) de inyección de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y confirmar que el ratón se anestesia adecuadamente por pellizcos del dedo del pie del ratón.
    1. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad durante el experimento.
  2. Fu Shaver sobre el lado izquierdo de la caja torácica del ratón.
  3. Realizar intubación endotraqueal del ratón.
  4. Coloque el ratón en la intubación de pie en ángulo de 70 ° y mantenga pulsado el ratón en lugar enganchando sus incisivos superiores sobre una banda pequeña de goma situado en la parte superior del soporte.
  5. Retraer la lengua suavemente a un lado el uso de fórceps romos.
  6. Visualizar la laringe con la ayuda de un microscopio de cuello de cisne iluminador de fibra óptica.
  7. Insertar catéter endotraqueal elástico (21 G) en la tráquea.
  8. Confirme que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial).
  9. Coloca el ratón en posición prona con el microscopio de disección.
  10. Mecánicamente ventilar el ratón usando un ventilador de roedores (150 respiraciones / min y 7 ml / kg de volumen corriente).
  11. Cuente costillas para localizar el espacio intercostal entre el 4 y 5 de la costilla.
  12. Crear un campo estéril sobre el área by limpiar a fondo con alcohol y povidona-yodo. Cubra el campo quirúrgico adecuadamente con un paño quirúrgico estéril.

3. Ratón Cirugía

  1. Después de la inyección local de bupivacaína al 0,25% (200 l) en la piel, hacer una incisión en la piel transversal (aproximadamente 1 cm de longitud) sobre el espacio intercostal usando tijeras de disección.
  2. Después de la inyección de bupivacaína al 0,25% (200 l) en el músculo intercostal, hacer una incisión músculo entre el 4 ° y 5 ° costilla utilizando finas tijeras pequeñas.
  3. Insertar un retractor de disección entre las costillas para visualizar completamente el pulmón izquierdo.
    1. Raspe un área pequeña (1 x 1 mm cuadrado) de la pleura visceral del centro del pulmón izquierdo utilizando unas pinzas finas.
    2. Aplique una leve presión sobre el área con un hisopo de algodón estéril hasta que el sangrado y fugas de aire están completamente controlados.
    3. Ponga una pequeña cantidad de mezcla fresca de fibrinógeno / trombina (cola de fibrina) (paso 1.1.2. 20 & #181; l) sobre la zona usando punta de la pipeta p200.
  4. Con cuidado, coloque un gel de fibrina (paso 1.2) usando unas pequeñas pinzas sobre el área (Figura 1b).
    1. Confirmar que el gel está bien fijada en la zona durante los movimientos respiratorios del pulmón.
  5. Asegúrese de que no hay ni fugas de aire masiva ni hemorragia del pulmón.
  6. Cerrar incisiones (capas musculares y de la piel) con sutura absorbible, que no tienen que ser eliminados.
  7. Aspirar la cavidad torácica usando 27 G aguja y jeringa de 1 ml para prevenir el neumotórax.
  8. Terminar la ventilación mecánica.

4. Recuperación Ratón

  1. Asegúrese de que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial).
  2. IP inyectar 1 ml de pre-calentado 0,9% de NaCl para evitar la deshidratación.
  3. Deje que el ratón para recuperar en la plataforma de agua caliente que circula.
  4. Retire la endotracheal tubo después de confirmar que el ratón tiene respiración estable.
  5. Inyectar Meloxicam (5 mg / kg, inyección subcutánea (SC), durante 3 días como analgésico postoperatorio.
  6. Vigilar los movimientos del ratón cuidadosamente en un mínimo de intervalos de 15 min hasta que es esternal (capaz de rodar sobre su estómago y permanecen en posición vertical) y consciente.
  7. Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula aislada de ratones sin necesidad de cirugía.
  8. Supervisar el sitio quirúrgico para detectar signos de infección (enrojecimiento, inflamación, secreción), funciones biológicas básicas de animales (alimentos y la ingesta de agua, micción, defecación, aumento de peso corporal), así como los signos clínicos de dificultad (piloerección, locomoción reducida) al día siguiente a la procedimiento quirúrgico.

5. La recolección del pulmón

  1. 7 a 30 días después de la implantación, la eutanasia el ratón usando CO 2 a través de fuente de gas comprimido.
  2. Hacer una incisión entre la punta del apéndice xifoides y el esternónmuesca (esternotomía mediana) y toda la cosecha de pulmón con el gel implantado para el análisis histológico y bioquímico mediante la reducción de la tráquea y la disección de todas las conexiones al corazón, los pulmones y la tráquea.
  3. Fijar gel implantado con pulmón con una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ºC, incrustar en compuesto OCT, y tomar las secciones de paso de serie de 30 micras de espesor.
  4. Realizar histológico (hematoxilina y eosina) y los análisis inmunohistoquímicos (marcador endotelial: CD31, marcador epitelial: proteínas acuaporina (AQP) 5 y surfactante (SP) -B) usando el microscopio confocal 22,37,40.
  5. Compilar pilas de secciones ópticas (30 m de espesor) para formar imágenes tridimensionales de endotelial de pulmón y las células epiteliales de la imagen 3D utilizando el software de análisis 37.
  6. Cuantificar áreas proyectadas de los vasos sanguíneos de nueva formación con software de análisis 46.

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Resultados

Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a.

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Discusión

Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de 50-53 y re...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos de la American Heart Association (AM), el Departamento de Defensa de Estados Unidos (BC074986) y del Hospital Infantil de Boston Facultad beca Desarrollo Profesional (TM, AM). Los autores agradecen a Amanda Jiang y Jiang Elisabeth para la asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fibrinógeno de placenta humanaSigmaF4883Para la fabricación de gel de fibrina
Trombina a partir de plasma bovinoSigmaT9549Para la fabricación de gel de fibrina
Ratón recombinante VEGF 164R& D493-MVPara la suplementación con gel de fibrina
Ratón recombinante bFGFR& D3139-FBPara la suplementación con gel de fibrina
Soporte de intubación para roedoresBraintree Scientific INCRIS 100Para intubación
Fuente de luz de fibra ópticaFisher Scientific12-565-35Para intubación
Catéter elástico de 21 GB.Braun4251652-02Para intubación
Ventilador MiniVentHarvard ApparatusCGS-8009Para ventilación
Stemi DV4 EsteromróscopioFisher Scientific12-070-515Para cirugía
Sutura absorbibleEthiconPDP304Sutura quirúrgica
Anticuerpo contra CD31BD Biosciences553370Inmunohistoquímica
Anticuerpo contra AQP5AbcamAB78486Inmunohistoquímica
Anticuerpo contra SP-BAbcamAB40876Inmunohistoquímica

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