La recapitulación del microambiente específico del órgano, que estimula la angiogénesis local, es indispensable para la regeneración exitosa de los tejidos dañados. Este informe demuestra un método novedoso para implantar geles de fibrina en la superficie pulmonar de ratones vivos con el fin de explorar cómo el microambiente específico del pulmón modula la angiogénesis y la regeneración alveolar en ratones adultos.
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Artículo de método
El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico
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Resumen
Resumen
Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel - mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.
Introducción
El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares.
Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de lar....
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Protocolo
NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles.
1. Preparación del gel de fibrina
- Preparar gel de fibrina que contiene VEGF y bFGF.
- Descongelar las soluciones madre....
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Resultados
Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a.
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Discusión
Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de 50-53 y re.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de la American Heart Association (AM), el Departamento de Defensa de Estados Unidos (BC074986) y del Hospital Infantil de Boston Facultad beca Desarrollo Profesional (TM, AM). Los autores agradecen a Amanda Jiang y Jiang Elisabeth para la asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fibrinógeno de placenta humana | Sigma | F4883 | Para la fabricación de gel de fibrina |
| Trombina a partir de plasma bovino | Sigma | T9549 | Para la fabricación de gel de fibrina |
| Ratón recombinante VEGF 164 | R& D | 493-MV | Para la suplementación con gel de fibrina |
| Ratón recombinante bFGF | R& D | 3139-FB | Para la suplementación con gel de fibrina |
| Soporte de intubación para roedores | Braintree Scientific INC | RIS 100 | Para intubación |
| Fuente de luz de fibra óptica | Fisher Scientific | 12-565-35 | Para intubación |
| Catéter elástico de 21 G | B.Braun | 4251652-02 | Para intubación |
| Ventilador MiniVent | Harvard Apparatus | CGS-8009 | Para ventilación |
| Stemi DV4 Esteromróscopio | Fisher Scientific | 12-070-515 | Para cirugía |
| Sutura absorbible | Ethicon | PDP304 | Sutura quirúrgica |
| Anticuerpo contra CD31 | BD Biosciences | 553370 | Inmunohistoquímica |
| Anticuerpo contra AQP5 | Abcam | AB78486 | Inmunohistoquímica |
| Anticuerpo contra SP-B | Abcam | AB40876 | Inmunohistoquímica |
Referencias
- Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
- Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E.
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Reimpresiones y permisos
