Artículo de método

Técnicas Experimentales y de imagen para examinar la estructura coágulo de fibrina en normales y enfermos Unidos

DOI:

10.3791/52019

⸱

1 de abril de 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este manuscrito se presentan técnicas experimentales, incluyendo la preparación de sangre, la microscopía confocal y el análisis de la tasa de lisis, para examinar las diferencias morfológicas entre las estructuras normales y anormales de los coágulos debidas a estados enfermos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrina es una proteína de la matriz extracelular que es responsable de mantener la integridad estructural de los coágulos sanguíneos. En los últimos años se han realizado muchas investigaciones sobre la fibrina, incluida la investigación de la síntesis, la estructura-función y la lisis de los coágulos. Sin embargo, todavía se desconoce mucho sobre las características morfológicas y estructurales de los coágulos que se producen en pacientes con enfermedad. En esta investigación se presentan técnicas experimentales que permiten examinar las diferencias morfológicas de las estructuras anormales de los coágulos debidos a estados patológicos como la diabetes y la anemia falciforme. Nuestro estudio se centra en la preparación y evaluación de coágulos de fibrina con el fin de evaluar las diferencias morfológicas mediante diversos ensayos experimentales y microscopía confocal. Además, también se describe un método que permite el cálculo continuo y en tiempo real de las tasas de lisis en coágulos de fibrina. Las técnicas descritas en este documento son importantes para los investigadores y médicos que buscan dilucidar patologías trombóticas comórbidas como infartos de miocardio, cardiopatía isquémica y accidentes cerebrovasculares en pacientes con diabetes o enfermedad de células falciformes.

Introducción

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La lesión de revestimiento endotelial de un vaso sanguíneo se repara a través de la respuesta hemostática, o la formación de un coágulo de sangre. Cuando la sangre penetra en la matriz extracelular, factores tisulares activar las plaquetas en el torrente sanguíneo que facilitan la iniciación de la cascada de la coagulación. El componente mecánico clave de este proceso de curación es la matriz de fibrina, compuesto de fibras de fibrina que son altamente elástico, y puede sostener grandes fuerzas 1-4. Muchos investigadores han estudiado la estructura de formación, y la función de la fibrina ampliamente en las últimas décadas 5-13.

Los pacientes con enfermedades como la diabetes mellitus y de células falciformes tienen un mayor riesgo de desarrollar complicaciones trombóticas tales como infartos de miocardio, enfermedad isquémica del corazón y accidentes cerebrovasculares 14-19. Más de 2 millones de personas son diagnosticadas con diabetes mellitus cada año en los Estados Unidos. Hay dos tipos de diabetes: Tipo I, donde elcuerpo no puede producir cantidades adecuadas de insulina, y Tipo II, donde el cuerpo se vuelve resistente a la insulina. Entre los pacientes con diabetes, enfermedad cardiovascular (ECV) es la causa del 80% de la morbilidad y la mortalidad asociadas con la enfermedad 20,21.

La enfermedad de células falciformes (ECF) es un trastorno genético de la sangre que afecta a más de 100.000 personas en los Estados Unidos 22. SCD es una enfermedad mutación puntual que hace que las células rojas de la sangre para convertirse en forma de media luna, lo que hace difícil para que las células pasan a través de la vasculatura arterial 23. Ambos de estos estados de enfermedad aumentan las probabilidades de desarrollar condiciones aterotrombóticos en el cuerpo. Una de las razones de esto es un resultado de la estructura de fibrina alterada y función en estados de enfermedad 14,24-26.

En la diabetes y la enfermedad de células falciformes, existe hipercoagulabilidad y la actividad hipofibrinolisis que induce la aterotrombosis y la enfermedad cardiovascular (CVD) en comparación con pacientes sanos 17,27,28. Se sabe que hipofibrinolisis promueve la progresión de la aterosclerosis y engendra eventos isquémicos recurrentes para los pacientes con enfermedad de la arteria coronaria prematura 29. En el manuscrito, se determinó el papel de las propiedades físicas de fibrina en este entorno particular. Estructuras coágulo de fibrina en pacientes no enfermos se componen de fibras finas, poros más grandes, y en general menos densa 14,24. Se ha encontrado que el aumento de la porosidad y coágulos de fibrina menos densas en pacientes sanos para facilitar la fibrinólisis 16. En condiciones hipertrombótico tales como la enfermedad de células falciformes y diabética, hay un aumento en la producción de fibrinógeno, haciendo que la concentración de fibrinógeno para aumentar los niveles normales de 2,5 mg / ml en pacientes sanos 30-33. Los coágulos de fibrina formados en los pacientes diabéticos se han encontrado para ser menos poroso, más rígido, tener más puntos de ramificación, y más denso en comparación con sanos, no-diacientes diabéticos 14,24,33-35. La estructura de fibrina alterada es un resultado de los mecanismos de glicación que se producen en las proteínas implicadas en la formación del coágulo. No enzimática (irreversible) glicación se produce cuando las moléculas de glucosa se ​​unen a residuos de lisina en la molécula de fibrinógeno, que inhibe factor humano XIIIa (FXIIIa) a partir de glutamina y lisina residuos adecuadamente de reticulación 33,36,37.

El análisis estructural de las redes de fibrina ha sido ampliamente estudiado recientemente. En particular, los investigadores han utilizado la microscopía electrónica y la reconstrucción 3D de las redes de fibrina 38, investigados cómo ambas células intravasculares (endoteliales) y extravasculares (fibroblastos y músculo liso) células afectan a la estructura de fibrina 39, viscoelástico utilizado y el análisis espectral para analizar estructuras de fibrina 40, y correlaciones desarrolladas entre la estructura de fibrina y las propiedades mecánicas utilizando experimental y computacional enfoques 41 . El objetivo del presente estudio fue formular estructuras coágulo en condiciones trombosis celular diabética hoz y simulados y utilizar la microscopía confocal para el examen de la estructura y función de los coágulos en estados de enfermedad. Los coágulos de fibrina se forman a partir de fibrinógeno humano, trombina humana, y FXIIIa. Los coágulos se lisaron usando plasmina. Para simular las condiciones diabéticas, aumento de la concentración de fibrinógeno se incubó en solución de glucosa para inducir in vitro la glicación fibrinógeno. Para simular las condiciones de coagulación anemia de células falciformes, el aumento de las concentraciones de fibrinógeno se mezclaron con hematocrito células falciformes recogido de pacientes como se ha hecho anteriormente por nuestro grupo 42. Estos métodos se utilizaron para examinar la estructura y las funciones que participan en la formación del coágulo de fibrina y la fibrinolisis bajo condiciones de enfermedad, así como los mecanismos que inducen CVD. En base a la información actual sobre estas enfermedades, las estructuras coágulo de fibrina glicosilada eran más densas con menos de unnd poros más pequeños. Los coágulos de fibrina con las células rojas de la sangre de pacientes con anemia drepanocítica (GR) eran también más denso y se muestran agregación de los glóbulos rojos y las agrupaciones de fibrina aglomerados. Este es un fenómeno bien establecido que se ha determinado previamente 43. También se planteó la hipótesis de que la tasa de fibrinólisis sería significativamente menor en los coágulos de fibrina glucosilada con y sin reducción de plasmina en comparación con saludable, fibrina normal. Los resultados mostraron que para los coágulos de fibrina glucosilada, resultados significativamente diferentes tipos de lisis se observaron sólo bajo condiciones de reducida concentración de plasmina. Esta técnica experimental de la utilización de la microscopía confocal ofrece ventajas significativas sobre otros métodos de imagen, porque las células y las proteínas permanecen en su estado nativo, lo que permite la captura de vídeo en tiempo real de la actividad de coagulación. Este método de coagulación sintéticamente inductor es también más barato y más eficiente en el tiempo que la obtención de muestras de pacientes y filtrar individuoproteínas y enzimas. Además, mediante el uso de proteínas y enzimas separadas para sintetizar coágulos, los coágulos se estandarizaron de modo que no era la variabilidad entre las muestras como resultado de otras proteínas en el plasma.

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Protocolo

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NOTA: El siguiente protocolo se adhiere a las directrices establecidas por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Georgia Tech.

1. Extracción de sangre y la Sangre Procedimiento de aislamiento celular de color rojo

  1. Recoger 40-120 ml de sangre de donantes en 10 ml tubos vacutainer heparinizados. Iniciar PBMC (células mononucleadas de sangre periférica) de aislamiento dentro de las 4 horas de la recolección. Durante este tiempo, mantener la sangre a temperatura ambiente.
    NOTA: O / N de almacenamiento de la sangre en RT o en 4 ° C no se recomienda ya que esto resultará en un menor rendimiento de PBMC.
  2. Diluir la sangre completa 1: 1 en PBS estéril enfriado con hielo (4 ° C).
  3. Pipetear 10 ml de helado polisacárido hidrofílico en un tubo vacío, estéril cónico de 50 ml. Transferir suavemente la sangre entera diluida en la parte superior del polisacárido hidrófilo.
  4. Usar una pipeta de 25 ml en el ajuste lento y la sangre de la pipeta a lo largo del lado del tubo muy lentamente. Asegúrese de que la sangre no se mezcla con el sacárido antes de la centrifugation porque el polisacárido hidrófilo es tóxico para las células y de otra manera, el rendimiento PBMC será menor.
  5. Centrifugar las muestras de sangre durante 30 minutos a 400 xg a 4 ° C. Si está disponible, reducir la velocidad de freno de la centrífuga a la mitad de la máxima para una mejor separación después de la centrifugación.
  6. Aspirar la fracción de plasma / plaquetas de la muestra de sangre centrifugada. Aspirar con cuidado la capa de polisacárido hidrófilo directamente encima de la capa de glóbulos rojos envasados.
  7. Recoger 8-10 ml de glóbulos rojos empaquetados y diluir 1: 1 con no estéril 0,9% NaCl solución salina.

2. Microscopía Confocal Evaluación de glucosilada Estructuras Clot (simulados diabéticos coágulos)

  1. Descongele fibrinógeno humano y la etiqueta fluorescente conjugado fibrinógeno humano a 37 ° C.
  2. Pipetear lo siguiente en un 0,5 ml tubo de microcentrífuga se graduaron.
    1. Para los coágulos de fibrinógeno, normales sanos, mezclar fibrinógeno humano con 10% de fibrinógeno humano marcado con fluorescenciaconjugado en un tampón de Tris 50 mM / NaCl 100 mM a una concentración de 5 mg / ml.
    2. Para fibrinógeno glucosilada artificialmente (para simular la formación de coágulos diabéticos), incubar fibrinógeno humano y 10% de fibrinógeno marcado con fluorescencia conjugado en una solución 5 mM de glucosa disuelta en 50 mM Tris / NaCl 100 mM para una concentración resultante de 6,8 mg / ml.
  3. Cubra los tubos de microcentrífuga utilizando un material opaco para evitar la exposición a la luz. Incubar los tubos en un 37 ° C baño de agua durante 48 hr.
  4. Haga una cámara en un portaobjetos de microscopio de vidrio mediante la colocación de un adhesivo delgada en los 2 lados de la diapositiva.
  5. Después del período de incubación de 48 horas, preparar reactivos para la formación de fibrina por la descongelación FXIIIa y trombina alfa humano a RT.
  6. Diluir FXIIIa a 80 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
  7. Diluir la trombina a 4 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
    1. Para coágulos normales, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y trombina son 2,5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
    2. Para los coágulos glucosilada, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 3,4 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
  8. Inmediatamente pipetear 30 l de la solución de fibrina en la cámara formada por el adhesivo.
  9. Coloque un 22 mm x 22 mm cubreobjetos de vidrio con un espesor de 0,15 mm en la parte superior de las 2 capas de adhesivo. Selle los lados abiertos con adhesivo transparente para evitar que el coágulo de fibrina se sequen. Asegúrese de que el adhesivo no interactúa con el coágulo de fibrina.
  10. Permita que los coágulos de fibrina que polimerizan a 21-23 ° C durante 2 horas antes de la imagen confocal.
  11. Tomar imágenes de microscopía confocal de los coágulos utilizando un microscopio confocal con una lente de 40X / 1.30 Aceite de M27 con un láser de argón de 488 nm.

3. Microscopía Confocal Evaluación de fibrina coágulos que contengan hematíes falciformes pacientes de celulares

  1. Descongele fibrinógeno humano y la etiqueta fluorescente conjugado fibrinógeno humano a 37 ° C.
  2. Pipetear lo siguiente en un 0,5 ml tubo de microcentrífuga se graduaron.
    1. Para el, coágulo de fibrina normal y saludable, la mezcla de fibrinógeno humano con 10% de conjugado marcado con fluorescencia fibrinógeno humano en un tampón de Tris 50 mM / NaCl 100 mM a una concentración de 5 mg / ml.
    2. Para los coágulos que contienen SCD glóbulos rojos, mezclar fibrinógeno humano y 10% de conjugado marcado con fluorescencia fibrinógeno humano en un Tris 50 mM / NaCl 100 mM tal que la concentración resultante del fibrinógeno es 10 mg / ml.
  3. Etiquetar los glóbulos rojos aislados (tanto normales como los de pacientes con anemia drepanocítica obtenidos del protocolo de aislamiento RBC) utilizando una solución de marcaje celular.
    1. Suspender las células a una densidad de 1 x 10 6 por ml en cualquier medio de cultivo libre de suero elegido.
    2. Añadir 5 l / ml de la suspensión celular a la solución de etiquetado celular. Mezclar bien con la pipeta suave suavemente.
    4. Centrifugar los tubos de suspensión etiquetados a 1.500 rpm durante 5 min a 37 ° C.
    5. Eliminar el sobrenadante y suavemente volver a suspender las células en 37 ° C medio.
    6. Repita el procedimiento de lavado (3.3.4 y 3.3.5) dos veces más.
  4. Diluir FXIIIa a 80 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
  5. Diluir la trombina a 4 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
    1. Para la formación de coágulos normales, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 2,5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
    2. Para los coágulos que contienen SCD glóbulos rojos, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
  6. Añadir 10 l de los glóbulos rojos marcados en la solución de fibrina. Pipeta 30 l de la fibrina con eritrocitos en el cristal de microscopio (consulte deslice preparación para glcoágulos ycated).
  7. Deje que la fibrina polimerizar a 21-23 ° C durante 2 horas antes de la imagen confocal.
  8. Tome imágenes confocal de los coágulos utilizando el microscopio confocal, y utilizar láseres de excitación con longitudes de onda de 488 nm y 633 nm para excitar la fibrina marcada con fluorescencia y glóbulos rojos.

4. Microscopía Confocal Evaluación de fibrinólisis Tarifas en Estructuras Clot glicada

  1. Repita el protocolo de microscopía confocal de coágulos glucosilada (Protocolo Paso 2) para la evaluación del índice fibrinólisis en coágulos glucosilada.
  2. No selle los extremos de la cámara con adhesivo transparente. Permita que los coágulos de fibrina que se polimerizan durante 1,5 horas a 21-23 ° C en un recinto cerrado que contenga 250 ml de agua para prevenir la deshidratación.
  3. Después de la polimerización, obtener imágenes de los coágulos utilizando el microscopio confocal.
  4. Pipetear plasmina en el extremo abierto de la cámara y dispersar la plasmina a través del coágulo a través de la acción capilar.
    1. Paralos experimentos fibrinolisis normales y glucosilada con concentraciones normales, pipeta 25 l a 200 g / ml de plasmina en la apertura de la cámara.
    2. Para los coágulos glucosilada con concentraciones reducidas, pipeta 25 l de 50 mg / ml en la apertura de la cámara.
  5. Utilice la función de series de tiempo (véase la Figura 1) en el software de microscopio confocal para capturar en tiempo real imágenes de vídeo de la plasmina lisar el coágulo.
    1. Haga clic en el modo de adquisición y luego seleccione "Time Series". Seleccione el número de ciclos y el intervalo de tiempo de grabación.

5. Calcular Fibrinólisis Precios

  1. Determinar la tasa de lisis mediante el establecimiento de un área (2500 m 2) y calcular el tiempo transcurrido requerido para disolver un área fija del coágulo. Calcular la tasa de lisis utilizando la siguiente ecuación (Figura 2):
    figure-protocol-1

6. Análisis estadístico de la fibrinólisis Precios

  1. Analizar los datos de lisis utilizando software de análisis estadístico. Realizar un ANOVA de una vía y una prueba post hoc de Tukey-Kramer 44,45.

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Resultados

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Microscopía Confocal Análisis de Estructuras Clot glucosilada fibrina

Las imágenes de microscopía confocal de coágulos normales y glucosilada se presentan en la Figura 3. Análisis de microscopía confocal de los coágulos normales y glucosilada revela que los coágulos glucosilada son más densos con poros más pequeños que los coágulos normales con y sin la adición de FXIIIa durante la polimerización coágulo. En la Figura 3A y 3B, hay una concen...

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Discusión

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Para obtener datos significativos sobre la estructura de los mecanismos de coagulación en estados de enfermedad, es importante aislar los factores implicados en la coagulación para determinar los efectos de las proteínas y células en estas condiciones. Este protocolo fue desarrollado para los fines de la investigación de la estructura del coágulo de fibrina en los estados diabéticos y SCD in vitro.

Es necesario entender los mecanismos implicados en la formación de fibrina y la fibri...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Laboratorio Lam de Georgia Tech por muchas discusiones útiles en el desarrollo de los ensayos experimentales. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número K01HL115486 y por la Subvención Nuevo Innovador 1DP2OD007433-01 de la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (polisacárido hidrofílico)GE Healthcare45-001-749
Tubos vacutainer heparinizados de 10 mlBD Biosciences366643
Investigación de Enzimasde Fibrinógeno HumanoN/A
Alexa Fluor 488 conjugado con fibrinógeno humanoSondas molecularesF13191
Tubo de microcentrífuga graduado de 0,5 mlFisher Scientific05-408-120
Glucosa en polvoLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
Microscopio confocal VISZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Solución de etiquetado celular Vybrant DiDLife TechnologiesL7781
investigación de enzimasplasminaN/A
Cloruro de sodio (NaCl 5 M)Life TechnologiesAM9759
Software de modelado estadísticoIBMSPSS Statistics 22
Laboratorios deLaboratorios de de

Referencias

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