Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.
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Artículo de método
Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón
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Resumen
Resumen
Los osteoclastos son células altamente especializadas que se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea. Su capacidad única para reabsorber tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso significa que juegan un papel clave en la regulación de la remodelación esquelética. Juntos, los osteoblastos y los osteoclastos son responsables para el proceso de acoplamiento dinámico que implica tanto la resorción ósea y la formación ósea actuando juntos para mantener el esqueleto normal durante la salud y la enfermedad.
Como la célula de resorción ósea principal en el cuerpo, los cambios en la diferenciación o la función de los osteoclastos pueden resultar en efectos profundos en el cuerpo. Enfermedades asociadas con la función de los osteoclastos alterada pueden variar en severidad de la enfermedad neonatal letal debido a un fallo para formar un espacio para la hematopoyesis de la médula, a patologías tales como la osteoporosis, en la que la resorción ósea osteoclástica excesiva predispone a la fractura de la formación observado más comúnmente. ent "> Una capacidad de aislar los osteoclastos en grandes cantidades in vitro ha permitido avances significativos en la comprensión del ciclo de remodelación ósea y ha allanado el camino para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas que combaten estas enfermedades.
A continuación, describimos un protocolo para aislar y cultivar los osteoclastos de médula ósea de ratón que producirá un gran número de osteoclastos.
Introducción
El remodelado óseo es dinámico e implica el acoplamiento de la formación de hueso con la resorción ósea 1. Este proceso estrechamente regulado es responsable de mantener el esqueleto durante la homeostasis normal, y en respuesta a la lesión y la enfermedad.
Los osteoclastos son células multinucleadas únicos, que son capaces de resorción tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso. Los osteoclastos se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea 2-5. Las anormalidades en la función o la formación de osteoclastos puede resultar en una variedad de patologías clínicas, incluyendo las condiciones....
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Protocolo
NOTA: Declaración de Ética: Toda la investigación con animales vertebrados se realizó en los protocolos de Accordance aprobados por el grupo administrativo de expertos de Stanford en Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC).
1. Preparación
- Permitir 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (que contiene polysucrose y diatrizoato de sodio, ajustadas a una densidad de 1,077 g / ml) para llegar a RT en un tubo cónico de 50 ml.
- Preparar citometría de flujo (FACS) de tampón de fosfato 1x con solución salina tamponada (PBS) y suero de ternera fetal al 2% (FCS). Tomar una parte alícuota de 50 ml....
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Resultados
El objetivo de este método fue aislar fácilmente un gran número de osteoclastos in vitro, normalmente en una semana. Éxito en el aislamiento de un gran número de osteoclastos se confirmó mediante la tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (Figura 1A). Las grandes osteoclastos se visualizan como células grandes de color púrpura con múltiples núcleos (normalmente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, es común para aislar los osteoclastos con hasta 30 núcleos por los osteoclastos .......
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Discusión
Una capacidad de aislar fácilmente y cultivar un gran número de osteoclastos in vitro ha sido responsable de ayudar a avanzar en la comprensión de la biología del hueso y los osteoclastos mediada por enfermedades. Era la identificación de RANKL que conducen a esto, cuando se identificó recientemente como el principal regulador de la formación de osteoclastos, la diferenciación y la supervivencia 16-18.
Ha sido nuestra experiencia que el cultivo in vitro de los os.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene divulgación o conflicto de intereses que declarar.
Agradecimientos
Queremos agradecer el apoyo de subvenciones del NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, la Fundación Oak y el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MEM, sin glutamina, sin rojo fenol | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, ratón recombinante | Gibco | PMC2044 | |
| Ratón recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expresado) | R& D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandina E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Kit de fosfatasa ácida, lecocitos (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Placas de reabsorción ósea de osteoensayo, placas de 24 pocillos | Corning Life Sciences | 3987 |
Referencias
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....
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Reimpresiones y permisos
