Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar la inmunología del rechazo. El modelo quirúrgico presentado reporta un tiempo quirúrgico corto y una técnica concisa. Dependiendo de la combinación de cepa donante-receptor, el riñón trasplantado puede desarrollar rechazo celular agudo o daño crónico del injerto, definido por fibrosis intersticial y atrofia tubular.

Resumen

El rechazo del riñón trasplantado en humanos sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. El modelo murino de trasplante renal reproduce fielmente los procesos técnicos y patológicos que ocurren en el trasplante renal humano. Aunque existen modelos murinos de rechazo alogénico en órganos distintos del riñón, y son técnicamente más factibles, hay pruebas de que diferentes órganos provocan modos y dinámicas de rechazo dispares, por ejemplo, el curso temporal del rechazo en el aloinjerto cardíaco y renal difiere significativamente en ciertas combinaciones de cepas. Este modelo es una herramienta atractiva por muchas razones, a pesar de sus desafíos técnicos. Dado que los haplotipos de cepas endogámicas de ratón están bien caracterizados, es posible elegir combinaciones de donante y receptor para modelar el rechazo agudo del injerto mediante el trasplante a través de loci MHC de clase I y II. Por el contrario, al trasplantar entre cepas con haplotipos similares, se puede provocar un proceso crónico en el que el riñón del aloinjerto desarrolla fibrosis intersticial y atrofia tubular. Hemos modificado la técnica quirúrgica para reducir el tiempo quirúrgico y mejorar la facilidad de la cirugía, sin embargo, aún queda por superar una curva de aprendizaje para poder replicar fielmente el modelo. Este estudio proporcionará puntos clave en el procedimiento quirúrgico y ayudará en el proceso de establecimiento de esta técnica.

Introducción

El trasplante renal con éxito para el tratamiento de la insuficiencia renal fue descrita por primera vez en 1955 entre los gemelos monocigóticos ^1, desde entonces se ha convertido en un revolucionario tratamiento para los pacientes con insuficiencia renal terminal en todo el mundo, ofreciendo mejoras en duración y calidad de vida ^2. Sin embargo la supervivencia del injerto a largo plazo se ha visto obstaculizada por una multitud de procesos patológicos que resultan en daños crónica del injerto ^3.

El rechazo del riñón trasplantado en el ser humano sigue siendo una causa importante de morbilidad, a pesar de las mejoras significativas en los regímenes immunosupporessive. El objetivo de desarrollar un modelo murino de trasplante renal es replicar de cerca el proceso y la patología que se encuentra en el trasplante renal humano ^4. Skoskiewicz et al. Describe primero el modelo murino de trasplante renal en 1973 ^5. Aunque se requieren habilidades de microcirugía avanzados, es una valiosa tool por varias razones: el genoma del ratón ha sido bien caracterizada y hay una gran variedad de métodos y técnicas disponibles para los estudios del ratón experimentales.

Muchos grupos utilizando el modelo de ratón de trasplante renal han utilizado el riñón trasplantado como un órgano que sustenta la vida, sin embargo, en otros estudios y en nuestra metodología descrita uno de los riñones naturales del ratón receptor se deja in situ durante la duración del experimento ^4. El beneficio es que el ratón se somete a una única operación de la anestesia y reduciendo así la morbilidad para el ratón y el riesgo de muerte a partir de un segundo procedimiento. Además, el ratón no sufren de los efectos adversos de la insuficiencia renal progresiva.

Aunque existen modelos de rechazo alogénico en otros órganos tales como el corazón y la piel, estos no siempre son directamente relevantes para el trasplante renal. Hay evidencia de que estos modelos provocan diferentes modos y dymica de rechazo, por ejemplo, el curso de tiempo de rechazo de aloinjerto cardíaco y en aloinjerto renal difiere significativamente en ciertas combinaciones de deformación ^6. Hemos descrito patrones de rechazo de aloinjerto renal aguda en donantes BALB / c en ratones FVB / NJ no transgénicos, este modelo mostró la lesión mediada celular con acumulación de células T y macrófagos ^7. Alternativamente también hemos descrito un modelo de daño crónico del aloinjerto que exhibe la fibrosis intersticial y atrofia tubular, esto resulta de trasplante de un riñón de ratones C57BL / 6 ^BM12 donantes C57BL / 6 en los destinatarios, ya que estos ratones se caracterizan por una sola MIS loci MHC de clase II -match ^8.

Múltiples aspectos del trasplante han sido estudiados utilizando el modelo murino de trasplante renal, incluyendo rechazo agudo, rechazo celular y humoral, lesión de reperfusión de isquemia, y probando nuevos agentes terapéuticos. Hemos modificado el t quirúrgicaechnique para reducir el tiempo de operación y mejorar la facilidad de la cirugía. Particularmente hemos descrito donante simultánea y preparación de receptor y una técnica de anastomosis vascular simplificada mediante la utilización de una anastomosis aórtica parche continuo. Este video y manuscrito proporcionarán puntos clave para ayudar en el establecimiento de esta técnica.

Protocolo

Ética institucionales nacionales y locales apropiados deben estar en su lugar antes de realizar los experimentos con animales. Específicamente en el Reino Unido se llevaron a cabo los siguientes experimentos bajo los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 Cuando dos microcirujanos están disponibles para funcionar a la vez que el cirujano donante debe realizar los pasos 1.1 a 1.16 luego 3.1 a 3.5, mientras que el cirujano realiza receptor 2.1 a 2.8 . Para un solo operador los pasos pueden ser seguidos secuencialmente.

1. Donantes Preparación

Nota: El procedimiento que aquí se presenta es un donante C57BL / 6 ^BM12 y el receptor C57BL / 6 ratones machos de edades comprendidas entre 8 y 16 semanas de edad con un peso corporal superior a 20 g. Sin embargo, este procedimiento se puede realizar de forma reproducible en una variedad de cepas de ratón. Los datos presentados en la sección de resultados representativos se obtuvieron de ratones C57BL / 6, C57BL / 6 y ^{BM12, los cuales} ratones BALB / c.

1. Realizar procedimientos using instrumentos quirúrgicos estériles y consumibles (autoclave), con los esfuerzos para mantener la zona de trabajo lo más estéril posible. Realizar la preparación de donantes simultáneamente con la preparación destinatario si dos cirujanos están disponibles.
2. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal (aguja 31G) de medetomidina (0,5 mg / kg) y clorhidrato de ketamina (200 mg / kg). Esto resulta en un plano anestésico que se mantiene durante 4 horas dando tiempo suficiente para que todo el procedimiento a realizar. Anestesia suplementaria no es necesario.
3. Confirme que el ratón está anestesiado (sin respuesta a la pizca dedo del pie).
4. Afeitarse el abdomen del ratón y eliminar los pelos sueltos con cinta adhesiva.
5. Coloca el ratón sobre su espalda sobre una estera climatizada cubierta estéril y sin apretar inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva estéril.
6. Monitorear el ratón durante todo el procedimiento para las quemaduras térmicas. Si es posible utilizar una fuente de calor no eléctrico.
7. Aplique un lubricante ocular y sanitize la pared abdominal con una solución de yodo diluido.
8. Hacer una incisión en el abdomen para entrar en la cavidad peritoneal e inserte un 3 cm Calibri retractor abdominal.
9. Aplicar solución salina calentada para mantener los intestinos y el área quirúrgica húmedo y evitar el secado innecesaria de las vísceras.
10. Cubra el ratón con paños estériles y mover los intestinos a la izquierda del operador (el derecho del ratón) para exponer la aorta, la vena cava y el riñón izquierdo.
11. Aplicar una pinza de trinquete hasta el estómago y tire superiormente para exponer los principales vasos y riñón izquierdo totalmente. Empaque amortiguar hisopos estériles (2 mm x 2 mm) en el abdomen para retraer los tejidos fuera de la zona de la cirugía, tales como los lóbulos hepáticos, vesículas seminales y de intestino.
12. Aislar el riñón izquierdo de adventicia que rodea, la grasa y la glándula suprarrenal izquierda en la cavidad peritoneal por rodeos disección del tejido conectivo usando pinzas de punta fina. Coloque las puntas cerradas de la pinza entre las áreas que NEed a separar y lentamente permita que las puntas de fórceps para abrir disecar el espacio.
13. Aislar la vena renal izquierda ligando y luego dividiendo la vena adrenal y la vena gonadal izquierda izquierda con 9 / O de nylon. Coloque la sutura cerca de la vena renal.
14. Ligar y dividir el uréter con 7 / O sutura de seda cerca de la vejiga dejando la sutura termina de largo. Estos extremos largo de sutura se utilizarán cuando el riñón se cosecha y que sean necesarias para la anastomosis ureteral.
15. Movilizar y diseccionar plenamente la aorta y la vena cava superior y inferior a la arteria y vena renal utilizar fórceps de punta fina para diseccionar sin rodeos vasos linfáticos y grasa de la parte frontal y los lados de los vasos.
16. Encuentre el plano del tejido entre la aorta y la vena cava y propagarse lentamente las pinzas. Abra lentamente las puntas de la pinza de punta fina para extender el tejido con un mínimo trauma.
17. Ate un flojo 7 / O de seda alrededor de la aorta superior e inferior de la arteria renal pasando un buen ángulopinzas de punta alrededor de la parte posterior de los vasos y dibujo una sutura a través. Estas suturas se harán más estrictas antes de la recuperación del riñón para permitir la perfusión retrógrada de la Universidad de Wisconsin solución.

2. destinatario Preparación

De acuerdo con el seguimiento de preparación de donantes pasos 1.2 a 1.8.

1. Mover los intestinos a la derecha del operador (izquierda del ratón) para exponer la aorta, la vena cava. Cubra los intestinos con un bastoncillo empapado de solución salina estéril.
2. Realizar una nefrectomía derecha por ligación de la arteria renal derecha y la vena junto con 7/0 sutura de seda y luego dividir.
3. Ligar el uréter derecho con 7 / O sutura de seda y se dividen.
4. Movilizar y diseccionar plenamente la aorta y la vena cava inferior a la arteria y la vena renal como se describe en el paso 1.14 y 1.15. Asegurar la disección completa entre la aorta y la vena cava. Tenga cuidado para preservar la arteria espermática interna que se extiende por delante de la vena cava y aortA junto con el paquete linfático.
5. Identificar los vasos lumbares que se ejecutan en el retroperitoneo de la vena cava y la vena a la columna vertebral, se liga con 9 / O de seda en la continuidad, no hay necesidad de dividir los vasos.
6. Identificar suficiente espacio para colocar pinzas microvasculares con espacio para entre anastomosis vasculares.
7. Administrar heparina intravenosa (5 unidades) a través de la vena dorsal del pene.

Recuperación de riñón 3. Donantes

Apriete los lazos de seda 7 / S que se han colocado alrededor de la aorta inferior y superior para aislar el riñón de la circulación arterial.

1. Infundir retrógradas frío desde 0,2 hasta 0,5 ml de solución de la Universidad de Wisconsin con una aguja (31G) en la aorta.
2. Divida la aorta dentro de las suturas y dividir la vena renal en su unión con la vena cava para extraer el riñón y la arteria renal con una longitud de aorta. Divida vasos lumbares derivados de la aorta, si están presentes, wligadura ithout.
3. Coloque el riñón en solución salina fría en un hisopo estéril en una placa de cultivo.
4. La eutanasia el ratón donante por dislocación cervical.

4. Trasplante de Riñón - Kidney Preparación

1. Crear un parche aórtico dividiendo la pared de la aorta longitudinalmente justo enfrente de la arteria renal. Identificar los lúmenes de los vasos en el parche que necesitan ser ligado o evitar cuando se realiza la anastomosis arterial.
2. Colocar una sutura 10 de E / S del exterior al interior del lumen de la vena renal y superiormente una segunda sutura separada inferior. Las suturas utilizadas para dividir la vena adrenal y la vena gonadal se pueden utilizar para orientar la embarcación.
3. Coloque el riñón en el flanco derecho del receptor (Figura 1.1) y asegurar las suturas están en condiciones de garantizar las anastomosis vasculares se pueden completar sin las suturas se entrelaza en hisopos u otros instrumentos.

5. riñón Transplantación - Vascular Anastomosis

Aplicar pinzas microvasculares primera inferiormente a continuación abarcan superiormente la vena cava y la aorta.

1. Hacer un ventomy con una aguja (31G) por punción de la pared anterior de la vena cava. Flush sangre de la vena cava mediante la inyección de aproximadamente 50 l de 0,9% de NaCl.
2. Ampliar el venotomía usando fórceps de punta fina mediante la apertura de ellos dentro de la venotomía manera que la longitud es equivalente al diámetro de la vena renal del donante.
3. Coloque la sutura superiores 10 de E / S (que ya está en el lumen de la vena renal) primero en el vértice de la venotomía (Figura 1.2) y unirse a la pared posterior de la anastomosis en una sutura continua hasta que se alcanza el ápice inferior (figura 1.3).
4. Coloque el 10 de E / S de sutura inferior y atar primero con un solo nudo (Figura 1.4) luego atar a la sutura que va desde la pared trasera.
5. Uso de la sutura inferior crear el Wal frentel de la anastomosis (Figura 1.5) con una sutura continua y atar al extremo de sutura superior en el vértice superior, (Figura 1.6).
6. Crear una aortotomía recogiendo la pared de la aorta con una pinza y corte un parche elíptico con tijeras (aproximadamente el aortotomía debe ser una quinta parte de la circunferencia de la aorta y tres veces la luz de la arteria renal de longitud).
7. Coloque una sutura de 10 E / S en el punto superior del parche aórtico del exterior al interior (Figura 1.7) y pasar a través de la aorta para empatar fuera de los vasos en el vértice superior de la aortotomía.
8. Cree la anastomosis arterial con una sutura continua de comenzar superiormente (Figura 1.8) anastomosando el parche de donantes a la aorta destinatario, tenga cuidado de no constreñir la anastomosis mediante la vinculación de la sutura demasiado apretado (Figura 1.9).
9. Retire las abrazaderas vasculares inferiores primero y luego la pinza superior a reperfundir el riñón (Figura 1.10 y 1.11). Peristaltismo visible del uréter tal vez visto si se logra el suministro adecuado de sangre al uréter.

6. Trasplante de Riñón - Anastomosis ureteral

1. Divida los archivos adjuntos de la vejiga de la pared abdominal.
2. Pasar una aguja (21G) de izquierda a derecha de la vejiga a través de ambas paredes.
3. Coloque puntas de fórceps rectos en el lumen de la aguja y pasar tanto a través de la vejiga de tal manera que las pinzas están pasando ahora de derecha a izquierda de la parte izquierda de la vejiga.
4. Dibujar la sutura en el uréter donante a través de la vejiga de tal manera que el uréter pasa en el defecto de la vejiga izquierda y luego fuera del lado derecho.
5. Suturar la adventicia del uréter a la adventicia de la vejiga con tres suturas interrumpidas simples alrededor del punto de entrada con 9 / O sutura de nylon en una aguja de cuerpo redondo.
6. Cortar el uréter proximal a la ligadura, abriendo así ªe uréter para permitir que la orina fluya y permitir que el extremo uréter se retraiga en el cuerpo de la vejiga. Visible producción de orina se puede observar a lo largo de con hemorragia de los vasos peri-ureteral.
7. Cierre el defecto de la vejiga lado derecho con un solo interrumpido 9 / O sutura de seda.

7. Recuperación y Cuidado Postoperatorio

Vuelva a colocar las vísceras gastrointestinal en el abdomen en su orientación original y cierre de la pared abdominal mediante la aproximación de los músculos rectos con 6 E / S de sutura absorbible.

1. Aproximar la piel con clips de la piel metálica.
2. Parcialmente invertir la anestesia con una inyección subcutánea de hidrocloruro de atipamazol (10 l / g).
3. Administrar analgesia por vía subcutánea hidrocloruro de buprenorfina (0,05 mg / kg) y para la inyección de fluido de soporte 1 ml de NaCl al 0,9% por vía subcutánea.
4. Recuperar el ratón en un armario de calentamiento a 28 ° C durante 24 a 48 horas. Observe el ratón para la enfermedad hasta elfinalización del experimento.
5. Retire los clips de la piel metálica 7 - 10 días después de la operación.
6. Una vez que el experimento se ha completado la eutanasia el ratón por dislocación cervical.
7. Retire y recoger el riñón contralateral y aloinjerto para el análisis histológico.

Resultados

Rechazo de aloinjerto renal puede ser evaluada por análisis histológico de parafina embebido en secciones de tejido fijadas con methacarn del riñón trasplantado (Figura 2). El trasplante de riñones entre isoinjerto resultados ratones singénicos en la lesión por reperfusión isquémica renal, sin embargo por 4 semanas, los túbulos se han recuperado y son histológicamente comparables a los riñones nativos. El rechazo agudo puede ser modelado por C57BL / 6 trasplante de riñón en receptores BALB / c, dentro d...

Discusión

La manera más bien descrito para realizar la anastomosis arterial es utilizar la aorta distal del donante, con la arteria renal en la continuación, de una manera de extremo a lado a la aorta destinatario. Se describe el uso de un parche de aorta, similar a la creación de reflejo 'Carrell parche' que lleva a cabo en el trasplante de riñón humano que creemos que es más conveniente. Aunque los informes en la literatura de donante y receptor operativo de tiempo son escasos creemos que la utilización de un parche aór...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumentos quirúrgicos
Tijeras de disección romas Herramientas de	ciencia fina	14072-10	Para el corte de piel
Tijeras curvas Castoviejo	Herramientas de ciencia fina	15017-10	Para corte de tejidos
Tijeras de resorte y ndash; rectas	Herramientas de ciencia fina	15000-08	suturas
Pinzas dentadas 1x2 dientes	Herramientas de ciencia fina	11021-12
2 x Pinzas de punta fina (Dumont No.5)	Herramientas de ciencia fina	11251-20
Pinzas angulares de punta fina (Dumont n.º 5/45)	Fine Science Tools	11253-25	Para disección roma
Pinza curva de punta fina (Dumont n.º 7)	Fine Science Tools	11273-22	Útil para pasar alrededor de los vasos
Crile Curveed Haemostat	Fine Science Tools	1300-04
Aplicador de microclip con bloqueo	Fine Science Tools	18056-14
2 x Micro serrefines, ancho del resorte 2 mm, longitud de la mordaza 4 mm	Fine Science Tools	18055-04	Pinzas microvasculares
2 x Retractor de alambre Colibri de 3 cm	Fine Science Tools	17000-03
Portaagujas Castroviejo con cerradura	Fine Science Tools	120660-01
Aplicador de pinzas para heridas	Fine Science Tools	12031-07
Pinzas para heridas de 7 mm	Fine Science Herramientas	12032-07	Retirar de 7 a 10 días después de la cirugía
Equipo
Microscopio óptico OPMI	Carl Zeiss	S100
Unidad de cauterización térmica con punta fina	Geiger	150A
Almohadilla electrónica de calor	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
Desechable equipo
7/O Sutura trenzada de seda	Pearsall	30514
10/O Sutura de Dafilon (poliamida)	B-Braun
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Aguja biselada regular, 1 pulgada, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	Para anastamosis ureteral
Aguja biselada regular, 5/8 pulgadas, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Aguja biselada regular, 1/2 pulgada, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Aguja de insulina 1 ml, 29 G	Bection, Dickinson and Company	324827
Aguja de insulina 0,3 ml, 30 G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml punta deslizante de jeringa	Bection, Dickinson and Company 300184
5 ml punta deslizante de jeringa	Bection, Dickinson and Company 302187
hisopos de papel Wypall	Kimberley-Clark	L40	esterilizado en autoclave
Yemas de algodón	Johnson and Johnson n	/a	esterilizadas en autoclave
Cortinas lisas	Guardian	CB03	esterilizadas en autoclave
Placa de cultivo celular 60mm x 15mm	Corning Incorporated
Pin dispensador	B-Braun	DP3500L / 413501	Utilizado con NaCl 0.9%
Reactivos y Medicamentos
(Lacri-Lube) Parafina blanda blanca 57,3%, aceite mineral 42,5% y alcoholes de lanolina 0,2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidona yodada 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Clorhidrato de ketamina	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	solución de 100 mg/ml (dosis 200 mg/kg)
(Domitor) Clorhidrato de medetodidina	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1 mg/ml (dosis 0,5 mg/kg)
(Vetergesic) Clorhidrato de bupernorfina	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3 mg/ml (dosis 0,05 mg/kg)
(Antisedán) Hidrochorro de atipazol	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5 mg/ml (dosis 2 mg/kg)
Solución de la Universidad de Wisconsin	Belzer Bridge to Life	n/a	dosis aproximada 500 microlitros/ratón
NaCl 0,9%	Baxter	FKE1323
sulfato de heparina	no patentado	N/A	5000 unidades/ml (dosis 5 unidades/ratón)

Para corte de G1118099 430166