La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos. Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.
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Artículo de método
El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada
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Resumen
Resumen
Las células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSCs) se consideran el estándar de oro para las aplicaciones de ingeniería de tejidos basadas en células madre. Sin embargo, el proceso por el cual deben ser cosechados puede estar asociado con una morbilidad significativa en el sitio donante. Por el contrario, las células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) son más abundantes y fáciles de recolectar, lo que las convierte en una alternativa atractiva a las BM-MSC. Al igual que las BM-MSC, las ASC pueden diferenciarse en células de linaje osteogénico y se pueden utilizar en aplicaciones de ingeniería de tejidos, como la siembra en andamios para su uso en defectos esqueléticos craneofaciales. Las ASC se obtienen de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo digerido, que es una mezcla heterogénea de ASCs, células vasculares endoteliales y murales, células musculares lisas, pericitos, fibroblastos y células circulantes. El análisis de citometría de flujo ha demostrado que el perfil del marcador de superficie para las ASC es similar al de las BM-MSC. A pesar de varios informes publicados que establecen marcadores para el fenotipo ASC, todavía hay una falta de consenso sobre los perfiles que identifican las células osteoprogenitoras en esta población heterogénea. Este protocolo describe cómo aislar y utilizar una subpoblación de ASC con capacidad osteogénica mejorada para reparar defectos críticos de la pantorrilla.
Introducción
La naturaleza heterogénea de las poblaciones de células madre aún no se comprende completamente y sigue siendo un impedimento importante para el desarrollo de aplicaciones terapéuticas basadas en células madre clínicamente efectivas. Una de las formas más comunes de caracterizar una población heterogénea de células madre es emplear un método de clasificación celular, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), para separar las células en función de sus perfiles de expresión de marcadores de superficie. A medida que los métodos de clasificación se vuelven más complejos, es posible identificar subpoblaciones funcionales de células más distintas. Las....
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Protocolo
NOTA: Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con consentimiento informado, y los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de Stanford (Protocolo # 2188 y # 9999).
1. Aislamiento de células y Cultura:
- Obtener tejido adiposo subcutáneo humano a partir de pacientes de sexo femenino sanos sometidos a lipoaspiración electiva del abdomen, flanco, y / o la región del muslo bajo anestesia local / general. Asegúrese de que la Junta de Revisión Institucional (IRB) haya obtenido la aprobación para el protocolo de aislamiento de ASC a partir de tejidos huma....
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Resultados
El uso de CD90 como un marcador para las células con una mejora de los resultados de la osteogénesis en el aislamiento de una población altamente enriquecido de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC se tiñeron con Pacific Blue-CD45 conjugado anti-humano, conjugado con FITC anti-CD105 humano, y CD90 anti-humano conjugado con APC. Después de la clasificación, el nivel de pureza era mayor que 98%, cuantificada por análisis post-especie.
Definición de grupos de células en base a perf.......
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Discusión
Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones homogéneos de ASC de la SVF de tejido adiposo humano sigue siendo un reto aunque objetivo deseable. El aislamiento de subpoblaciones ASC pro-osteogénicas es particularmente deseable, ya que tales células se pueden utilizar para estudiar la formación y la homeostasis de los tejidos esqueléticos. Sin embargo, el SVF del tejido adiposo alberga heterogeneidad significativa con respecto al vástago capacidad de la célula y el potencial de diferenciación. 11 La base .......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene un interés financiero en cualquiera de los productos, dispositivos o medicamentos mencionados en este manuscrito. Ninguno de los autores tiene ningún interés financiero en competencia reportar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE021683-01 y los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE019434 a MTL; Instituto Médico Howard Hughes de Becas de Investigación para MTCDCW fue apoyado por la AEC Franklin Martin Facultad de Becas de Investigación, El Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa, y el Premio Académico Facultad Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos cónicos desechables de 250 ml | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, Suplemento GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Solución antiséptica de povidona/yodo | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Solución salina equilibrada de Hank, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Suero fetal bovino, certificado, origen estadounidense | Gibco | 16000-044 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASA Solución de Desprendimiento de Células Madre | Tecnologías de Células Madre | 7920 | |
| APC Ratón Anti-Humano CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Ratón anti-Humano CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Humano CD45 eFluor 450 (Azul Pacífico de reemplazo) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Estreptavidina PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
Referencias
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298
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Reimpresiones y permisos
