En ny teknik för kvantitativ analys av håravfall hos möss Använda gråskala Analys

Summary

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Abstract

Alopecia är en vanlig form av håravfall som kan förekomma i många olika förhållanden, bland manliga mönster håravfall, polycystiskt ovariesyndrom, och alopecia areata. Alopecia kan också uppstå som en bieffekt av kemoterapi hos cancerpatienter. I denna studie, vårt mål var att utveckla en konsekvent och tillförlitlig metod för att kvantifiera håravfall hos möss, vilket gör det möjligt för utredarna att korrekt bedöma och jämföra nya behandlingsmetoder för dessa olika former av håravfall. Metoden utnyttjar en vanlig gel imager att skaffa och bearbeta bilder av möss, som mäter ljuset absorption, vilket förekommer i grov proportion till mängden svart (eller grå) hår på musen. Data som har kvantifierats på detta sätt kan därefter analyseras med användning av statistiska standardtekniker (dvs., ANOVA, t-test). Denna metod testades i musmodeller av kemoterapi-inducerad alopeci, alopecia areata och alopeci från vaxning. I denna rapport, är den detaljerade protokollet presterade för att utföra dessa mätningar, inklusive datavalidering från C57BL / 6 och C3H / HeJ stammar av möss. Denna nya teknik ger ett antal fördelar, inklusive relativa enkelhet ansökan, beroende utrustning som är lätt tillgängliga i de flesta forskningslaboratorier, och tillämpa en objektiv, kvantitativ bedömning som är mer robust än subjektiva bedömningar. Förbättringar i kvantifiering av hårväxt hos möss kommer att förbättra studie av alopeci modeller och underlätta utvärdering av lovande nya terapier i prekliniska studier.

Introduction

Alopeci (håravfall) kan vara ett psykologiskt och känslomässigt påfrestande händelsen med flera orsaker. Manligt håravfall är den vanligaste orsaken till håravfall, drabbar cirka två tredjedelar av män efter ålder 35 ^1. Ett liknande mönster av håravfall kan observeras hos kvinnor med polycystiskt ovariesyndrom. I båda dessa sjukdomar, är håravfall androgen medierad. Alopeci kan också förekomma som en autoimmun sjukdom, alopeci areata, som drabbar 1,7% av befolkningen ^2. Alopecia kan uppstå som en bieffekt av vissa medicinska behandlingar, såsom kemoterapi ^3. En hög andel (65-85%) av kemoterapi patienter upplever någon grad av håravfall ^4,5. De psykologiska konsekvenserna av håravfall har väl studerat i inställningen kemoterapi. Cytostatika-inducerad alopeci kan resultera i ångest, depression, negativ kroppsuppfattning, sänkt självkänsla och en minskad känsla av välbefinnande ^6,7. En hög percentage (47-58%) av cancerpatienter kvinnliga anser håravfall vara den mest traumatiska aspekten av kemoterapi, och upp till 8% nedgång behandling av rädsla för håravfall ^4,6. Det finns också bevis i androgen alopeci att stödja behandling för att reducera psykologiska och även medicinska konsekvenserna av håravfall ^8,9. Likaså har alopecia areata rapporterats ha allvarliga psykologiska konsekvenser ^2, och den ojämna karaktären av håravfall kan leda till en mer obehaglig kosmetiskt resultat än de flesta andra orsaker till håravfall.

Medan läkemedel med milda anti-androgena effekter (dvs, spironolakton) hade använts med begränsad framgång som terapi för alopeci, den första effektiva läkemedel för alopeci var minoxidil ^10. Denna blodtryckssänkande har en observerad bieffekt av att orsaka hårväxt, och används nu som lokalbehandling för många former av alopeci. Men svaren är ofta ofullständiga, med vissa ämnen visar bara långsamting av håravfall snarare än faktiska återväxt ^10. Finasterid är en kompetitiv antagonist till typ II 5α-reduktas som blockerar omvandlingen av testosteron till dihydrotestosteron, vilket resulterar i förbättringar i androgen alopeci på bekostnad av partiell systemisk androgenblockad. Svarsfrekvensen med långvarig (10 år) terapi är runt 50% ^11. Sammantaget trots omfattande forskning inom detta område, finns det fortfarande ingen lämplig behandling för håravfall.

I decennier har forskare och kliniker undersökt metoder för att mäta hårbotten hårväxt i kliniska prövningar. Med utvecklingen av läkemedel som behandlar alopeci, har det funnits ett större behov av tillförlitliga, ekonomiska och minimalt invasiva sätt att mäta hårväxt och särskilt svar på terapi. Bildanalysteknik för exakt kvantifiering av hår densitet hos patienter med håravfall störningar gav konsekventa och giltiga resultat i det förflutna med hjälp av olika techniques, inklusive analys av digitaliserade bilder ^12, bildanalys av individuella hårstrån och hudskador ^13, och mikroskopisk skanning att kvantifiera håret massa i ett definierat hårbotten region ^14.

Tyvärr, medan ovanstående metoder har gett förbättrad bedömning av effektiviteten för hårväxt främjande insatser i kliniska prövningar, dessa metoder har inte tillämpats på gnagare i prekliniska undersökningar. Vårt mål är att utveckla en konsekvent och tillförlitlig metod för att kvantifiera håravfall hos möss, vilket gör det möjligt för utredarna att mer exakt bedöma och jämföra nya terapeutiska metoder för olika former av håravfall. Vi har utvecklat en metod med hjälp av utrustning lätt tillgänglig i de flesta laboratorier som kommer att möjliggöra snabb och tillförlitlig kvantifiering av hår densitet i möss med brun eller svart hår. Denna metod har testats i musmodeller av kemoterapi-inducerad alopeci, alopecia areata, och alopeci från Waxing. En detaljerad protokoll presenteras för att utföra dessa mätningar, inklusive datavalidering från C57BL / 6 och C3H / HeJ stammar av möss. Som denna teknik bygger på att detektera ljus absorption från pigment i hårstrået, kan den inte användas för att upptäcka hårväxt i vita möss eller albinomöss.

Protocol

Etik Uttalande: Alla studier med djur måste godkännas av IACUC institutionens (för de uppgifter som följer, har protokoll godkändes av Montefiore IACUC, protokoll # 11-6-240 och # 13-7-100). Djur finns ljus anestesi som anges för det enda syftet att hålla dem stilla under fotografering, det finns inga smärtsamma procedurer som krävs för detta protokoll. 1. Förvärv av fotografier Sätt fokus och synfält för gel imager använder papper med tryckt text. Verifiera enhetl…

Representative Results

Denna teknik validerades med C3H / HeJ ympade möss, mus modell av alopecia areata 16. Dessa djur utvecklar globala håravfall som fortskrider gradvis över tiden. Dock förekommer håravfall fläckvis, och kan variera från en mus till nästa, införa betydande variabilitet och hämmar kvalitativa bedömningar. Denna modell gav en möjlighet att testa samband mellan mätningar av optisk densitet vid olika platser på musen som en bedömning av giltigheten. Den första frågan var…

Discussion

I denna rapport en detaljerad beskrivning tillhandahålls av en ny teknik för kvantifiering av håravfall hos gnagare. Denna teknik utnyttjar en gel imager för bildtagning och analys, utrustning som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. Mätningarna har visat sig vara stabil gent smärre variationer i tekniken (figurerna 4-5), och är väl korrelerade med graden av visuell håravfall hos behandlingsmodeller (figur 6). Dessa tekniker har framgångsrikt använts i utvärderi…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest, http://www.imatest.com/docs/q13/		Greyscale standard
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study
C3H/HeJ engrafted mouse	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Mice for representative study