Artículo de método

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

DOI:

10.3791/52298

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28 de enero de 2015

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1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

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Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

Resumen

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Enfermedad humana cultivos neuronales específicas son esenciales para la generación de modelos in vitro para enfermedades neurológicas humanas. Sin embargo, la falta de acceso a los cultivos primarios neuronales adultas humanas plantea desafíos únicos. La evolución reciente de las células madre pluripotentes inducidas (IPSC) ofrece un enfoque alternativo para derivar culturas neuronales de fibroblastos de la piel a través de paciente específico IPSC, pero este proceso es laborioso, requiere conocimientos especiales y grandes cantidades de recursos, y puede tomar varios meses. Esto impide la amplia aplicación de esta tecnología para el estudio de enfermedades neurológicas. Para superar algunos de estos problemas, hemos desarrollado un método para obtener células madre neurales directamente de la sangre periférica humano adulto, sin pasar por el proceso de derivación de IPSC. Las células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de sangre periférica humana adulta se cultivaron in vitro y se transfectaron con los vectores de virus Sendai que contienen factores de transcripción Sox2, Oct3/4, Klf4 y c-Myc. Los resultados de transfección en cambios morfológicos en las células que se seleccionan aún más mediante el uso de medio progenitora neural humano que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las células resultantes se caracterizan por la expresión de marcadores de células madre neuronales, tales como nestina y SOX2. Estas células madre neurales podrían diferenciarse aún más a las neuronas, oligodendrocitos astroglia y en medio de diferenciación especificado. Usando muestras de sangre periférica humana de fácil acceso, este método podría utilizarse para obtener células madre neuronales para una mayor diferenciación de las células neuronales para el modelado in vitro de los trastornos neurológicos y puede avanzar en estudios relacionados con la patogénesis y el tratamiento de esas enfermedades.

Introducción

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In vitro cultivos neuronales se han utilizado como una herramienta fundamental para estudios de enfermedades neurológicas. Primarios de origen animal (principalmente roedores) los cultivos neuronales 1, 2 y líneas de células neurales humanas derivadas de gliomas u otros tumores son los más comúnmente utilizados en tales estudios. Sin embargo, se ha reconocido que existen diferencias significativas entre roedores y células humanas. Muchos hallazgos basados ​​en roedores no pueden ser traducidos a los seres humanos. Por otra parte, con el rápido desarrollo de análisis de la información genómica masiva y la edición de genes relativamente fácil y la secuenciación del genoma, la tendencia es cada vez más orientado a descubrir la enfermedad genes propensos y delinear sus funciones y roles en enfermedades específicas, lo que hace que los pocos neuronal humano líneas celulares sólo han limitado su uso. En teoría, los cultivos neuronales primarios humanos derivadas de muestras de sistema nervioso del paciente son la mejor opción, pero son imposibles de obtener; meth por lo tanto alternativaSAO son necesarios. En los últimos años, se hayan interpuesto algunos enfoques, con dos que son los más distinguibles. Tras el desarrollo de la técnica de generar células madre pluripotentes inducidas (IPSC) a través del ratón y células somáticas humanas 3, 4, células neurales podría estar más diferenciada de ellos 5-7. Sin embargo, la generación y caracterización de IPSC exige mucha mano de obra, las técnicas, y la entrada de tiempo, a veces incluso prohibitivo. Poco después, otro enfoque fue desarrollado para transformar directamente las células neuronales a partir de células somáticas 8, 9. Como las neuronas resultantes son no proliferativa, limita su aplicación en estudios intensivos y la detección de drogas, que requiere una gran cantidad de células. Para aprovechar las ventajas de ambas técnicas, la derivación directa de la madre neurales / células progenitoras a partir de células somáticas ha sido explorado por varios grupos 10-12, que no pasa por el tedioso proceso de generación y caracterización de IPSC pero todavía Provides un buen número de células madre neurales de diferenciación neuronal después. Hemos demostrado previamente que, tras la introducción de los factores de transcripción Yamanaka en células progenitoras hematopoyéticas, células madre neurales pueden ser generados directamente utilizando una célula progenitora neural seleccionando medio 13. Aquí, se presenta el método en detalle.

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Protocolo

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1. Enriquecimiento de las células progenitoras hematopoyéticas de sangre entera adulto

NOTA: células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 + se pueden purificar a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo sangre del cordón umbilical, material de leucaféresis y la sangre entera utilizando métodos basados ​​centrifugación en gradiente de densidad. El método enumerado aquí utiliza la sangre entera como un ejemplo.

  1. El aislamiento de PBMCs de sangre entera:
    1. Añadir 4,5 ml de medio de separación de linfocitos al tubo SepMate pipeteando a través del orificio central de la pieza de inserción.
    2. Diluir la muestra de sangre con un volumen igual de DPBS estériles que contienen 2% de suero humano (v / v). Por ejemplo, diluir 5 ml de muestra con 5 ml de DPBS + 2% de suero humano.
    3. Añadir la muestra diluida pipeteando hacia abajo el lado del tubo. Tenga cuidado de no verter la muestra directamente a través del agujero central.
    4. Centrifugar a 1200 xg durante 10 min a TA.
    5. Retire con cuidado el sobrenadante por encima de la capa de PMBC.
    6. Recoger la capa de PBMC (nublado) en un nuevo tubo.
    7. Añadir 15 ml de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) que contiene 2% de suero humano en el tubo y centrifugar a 150 xg durante 10 min a TA con el freno.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de DPBS que contenía 2% de suero humano. Contar el número de células.
    9. Centrifugar a 690 xg durante 10 min a TA. Eliminar todo el sobrenadante del tubo.
    10. Resuspender las células en 1 x 10 7 células por 15 ml de de Dulbecco modificado por Iscove medio (IMDM) que contenía 1% de antibióticos (v / v) y 10% de suero humano (v / v).
    11. Se incuban las células O / N a 37 ° C en el 5% de CO2 antes de aislar las células CD34 +.
  2. La selección positiva de células CD34 + a partir de PBMCs utilizando CD34 multisort Kit:
    NOTA: trabajo rápido y utilizar soluciones pre-enfriado para fabricar células frío y prevenir tapadode anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado de células no-específica por la instrucción kit.
    1. Recoge todas PMBCs en un tubo de 50 ml y contar el número de células totales en el medio.
    2. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. Retire completamente todo el sobrenadante.
    3. Resuspender hasta 10 8 células por 300 l en tampón de talón (DPBS que contenía 0,5% de suero humano (v / v) y EDTA 2 mM).
    4. Añadir 100 l de FcR Reactivo de bloqueo y añadir 100 l de MultiSortMicroBeads CD34.
    5. Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en el frigorífico (2-8 ° C).
    6. Lavar las células mediante la adición de 2 ml de tampón de grano por 10 8 células y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante.
    7. Resuspender hasta 10 8 células en 500 l de tampón.
    8. Colocar la columna MACS LS en el campo magnético de un MACS Separador y preparar la columna de lavado con 3 ml de tampón de perla.
    9. Aplicar la suspensión de células en el center de la columna. Células no marcadas fluirán a través del cual se pueden recoger, si se prefiere.
    10. Lavar la columna tres veces con 3 ml de tampón de perla.
    11. Retire la columna del separador y colocarlo en un tubo de 15 ml.
    12. Añadir 5 ml de tampón de la gota sobre la columna y eliminar inmediatamente las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo en la columna.
    13. Añadir 20 l de multisort liberación de reactivo por 1 ml de suspensión celular. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el frigorífico (2-8 ° C).
    14. Añadir 1 - 2 ml de tampón de grano por 10 7 células y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante.
    15. Resuspender las células en 50 l de tampón de grano por 10 7 células.
    16. Añadir 30 l de multisort Detener Reactivo por 10 7 células y se incuba durante 15 minutos en el refrigerador.
    17. Añadir 5 ml de tampón de talón y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante.

2. La derivación de células madre neuronales inducida de células CD34 +

  1. Las células CD34 + cultura:
    NOTA: medio recién preparado se debe utilizar dentro de los 7 días cuando se almacena en el refrigerador. Pérdida significativa de células CD34 se observó después de 24 hr, pero la proliferación significativa de células debe ser perceptible, especialmente después de día 5. Si el número de células disminuye continuamente o no hay proliferación, implica ya sea mala calidad de las células medianas o CD34 y las células no debe ser utilizado para el siguiente paso.
    1. + Resuspender las células y la cultura CD34 en CD34 mantenimiento de medio (medio StemSpan SFEM que contiene trombopoyetina humana (TPO, 100 ng / ml), de tipo fms tirosina quinasa 3 (Flt-3) ligando (100 ng / ml) y factor de células madre (SCF, 100 ng / ml), interleucina-6 (IL-6, 20 ng / ml) y la interleucina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) en una placa de 24 pocillos (hasta 3 x 10 5 / pocillo en 1 ml de medio por pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    2. After 24 horas, recoger las células flotantes y centrifugar las células a 110 xg a temperatura ambiente para deshacerse de las células unidas y restos celulares. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de mantenimiento y CD34 semilla fresca en una nueva placa de 24 pocillos (hasta 1 x 10 5 / pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora durante 5 días adicionales.
    3. Reemplazar la mitad del medio cada otro día por aspiración cuidadosamente la mitad superior del sobrenadante mientras que las células CD34 + están flotando en la parte inferior de los pocillos (Figura 1A).
  2. Sendai transfección virus:
    1. En el día 5, recoger las células CD34 y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante.
    2. Resuspender las células en medio fresco a 1 x 10 5 / pocillo en una placa de 24 pocillos en 1 ml de medio.
    3. Descongelar un kit de reprogramación cytotune-iPS Sendai sumergiendo primero la parte inferior de los tubos en un baño a 37 ° C durante 10 segundos y luego descongelar completamente unt RT. Brevemente centrifugar los tubos y los puso en hielo. Preparar la mezcla de virus Sendai mezclando el volumen recomendado de cada virus que aparece en el certificado de análisis (COA) para el lote correspondiente. Se recomienda MOI 15.
    4. Añadir la mezcla de virus Sendai a cada pocillo de células CD34. Mezclar los pozos sacudiéndolo suavemente. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    5. Observar la eficacia de transfección después de 24 horas. Observe que los agregados de células y formación de esferas son indicadores para la transfección con éxito (Figura 1B).
    6. Cambie la mitad del medio transfiriendo cuidadosamente la mitad superior del medio a otro también. Si hay esferas de células en el nuevo bien, añadir la misma cantidad de medio fresco.
    7. Cambio de medio cada otro día a paso 2.2.6 repetir.
  3. Neural la inducción de células madre:
    NOTA: Dependiendo de las condiciones de células, a unos 5 o 7 días después de la transfección, las células adherentes monocapa alcanzarán 30 -50% de confluencia (Figura 1C).
    1. Retirar los sobrenadantes que contienen células flotantes y esferas y luego añadir 1 ml de medio de progenitor neural (Medio Eagle Modificado de Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12), que contiene suplemento 1x N2, 0,1% (w / v) de albúmina de suero bovino ( BSA), 1% (v / v) antibióticos, 20 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF)) en las células adherentes.
    2. Opcionalmente, disociar las esferas de células pipeteando suavemente y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de progenitor neural en una nueva placa de 24 pocillos recubierta con Matrigel por instrucción como una copia de seguridad.
    3. Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia, por lo general después de 1 semana.
    4. Descartar el sobrenadante y añadir en 1 ml de medio de células madre neurales (medio libre de suero, NSC SFM). Disociar las células utilizando un raspador de células seguidocon la pipeta muy suave.
    5. Retire las células y sembrar todos ellos en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir otro 1 ml de medio de células madre neurales para hacer 2 ml de medio para cada pozo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    6. Cambie medio cada otro día.
    7. Cuando las células alcanzaron 60% de confluencia, disociar y replate las células en relación 1: 3 siguiendo los pasos de los puntos 2.3.4 y 2.3.6.
  4. La congelación de las células madre neurales:
    1. Preparar célula madre neural medio de congelación mediante la adición de 20% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) en el medio de células madre neural. Mantenga el medio de congelación en el hielo.
    2. Disociar las células en una placa de 6 pocillos, con un raspador celular seguido pipeteando suavemente. Contar las células. Centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante.
    3. Resuspender las células en medio de células madre neurales a 1 x 10 6 / ml. Añadir el mismo volumen de medio de congelación a las células.
    4. Añadir 1 ml (5 x 10 5 células totales) de células en un criovial. Congelar las células utilizando un recipiente de congelación Sr. Froster después de la instrucción.

3. Neural Diferenciación Celular

  1. Células neuronales de diferenciación:
    1. Cuando las células madre neurales alcanzan el 80% de confluencia, separar las células madre neurales utilizando una goma de policía y luego disociarse pipeteando suavemente.
    2. Contar las células y ajustar la concentración de 1 x 10 5 / ml en medio de células madre neurales.
    3. Para la diferenciación neuronal, la placa de las células en la cubierta de poli-D-lisina / laminina recubierto desliza en placas de 24 pocillos a 1 x 10 5 / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    4. Reemplazar el medio con medio de diferenciación neural (DMEM / F12 que contiene suplemento N2 1x, 1x suplemento de B27, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM de vitamina C, 10 cerebro ng / ml factor neurotrófico derivado (BDNF) y 10 ng / ml de células gliales deriva factor neurotrófico (GDNF)) after 24 hr. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    5. Cambiar medio de diferenciación neural dos veces a la semana durante 2 semanas.
  2. Diferenciación astroglial:
    1. Disociar las células madre neurales con la pipeta.
    2. Contar las células y ajustar la concentración de células a 5 x 10 4 células / ml. Sembrar las células en placas de 24 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    3. Reemplazar el medio con DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    4. Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas. Si las células alcanzan la confluencia antes de 2 semanas, replate las células siguientes pasos 3.2.1 y 3.2.2.
  3. La diferenciación de oligodendrocitos:
    1. Disociar las células madre neurales con la pipeta.
    2. Contar las células y semillas de 1 x 10 5 células de recubrimiento 24 y placas de poli-L-ornitina en 1 ml de differenti oligodendrocitosación medio que consiste en DMEM / F12 que contiene suplemento N2, 10 ng / ml de derivado de plaquetas factor de crecimiento-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml de neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), y 3 nM de triyodotironina (T3). Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora.
    3. Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas.
    4. Sustituya el medio por DMEM / F12 con suplemento 1xN2 y 3 nM de T3 y cultivar las células para una semana adicional para la proteína básica (MBP) la producción de mielina.

4. La tinción de inmunofluorescencia

  1. Reemplace medios con 4% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA.
  2. Desechar PFA y lavar con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBS-T) 3 veces, 5 minutos cada vez.
  3. Permeabilizar las células con PBS que contenía 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a RT.
  4. Bloquear las células con PBS-T que contiene 4% de suero de cabra durante 20 min a TA.
  5. Se incuban las células con Antibo primaria correspondientemuere diluido en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 2 horas a RT o O / N en la habitación fría.
  6. Lavar las células durante 3 veces con PBS-T, 5 min cada vez. Se incuban las células con los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados con un fluorocromo usando dilución 1: 400 en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 1 hora en un agitador en la oscuridad.
  7. Lavar las células con PBS-T que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min a TA.
  8. Lavar las células dos veces más con PBS-T durante 5 min cada uno a TA.
  9. Observar las células marcadas con un microscopio y tomar fotos (Figura 3).

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Resultados

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La calidad de las células CD34 es crítico para el éxito de la transducción de células madre neural. Células CD34 de alta calidad proliferan durante el primer par de días de cultivo y aparecen como no adherente, células homogéneamente redondas, flotando justo por encima de la parte inferior de los recipientes de cultivo (Figura 1). Los resultados de infección exitosas en agregados de células, que se expande a través del tiempo (Figura 1B), mientras que se pueden producir agregados de cél...

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Discusión

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Se proporciona un protocolo detallado para generar directamente las células madre neurales a partir de células progenitoras hematopoyéticas periféricas.

En comparación con células de fibroblastos, la sangre periférica humana es más accesible. Utilizando el protocolo presentado, más de 1 x 10 5 células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 positivas, pueden enriquecerse a partir de 10 ml de sangre entera. Aunque la contaminación con plaquetas por lo general no se puede preven...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio está financiado por fondos intramuros de los NIH.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio de separación de linfocitosLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Suero humanoInvitrogen34005-100
AntibióticosGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-CL2 mM
Columna MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM medioStemcell Technologies96501x
IMDMProductos biológicos de calidad112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
Kit de reprogramación IPS SendaiLife TechnologiesA1378001
Rascador de célulasSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
Viales CryoTubeThermo368632
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
N2 suplementoLife Technologies17502-0481x
Albúmina sérica bovinaSigmaA29340,1% (p/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFPeprotechAF-100-15
B27 suplementoLife Technologies17504-0441x
medio libre de suero NSCLife TechnologiesA10509011x
cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina/lamininaBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Vitamina CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poly-L-ornitinaSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484%
PBSCalidad Biológico119-069-1011x
Suero de cabraSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Ratón monoclonal anti-NestinaMilliporeAB5922dilución 1:1.000
Anti-SOX2 anticuerpoApplied StemcellASA0120Listo para usar
Anti-& beta de ratón; Anticuerpo III-tubulinaPromegaG712Adilución 1:1.000
Anticuerpo anti-GFAP de conejoSigmaG4546dilución 1:100
Anticuerpo anti-O4R& D SystemsMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 anticuerpo anti-conejo de cabraLife techniologiesA11012dilución 1:400
Alexa Fluor 488 anticuerpo anti-ratónde cabra Life techniologiesA11001dilución 1:400
Alexa Fluor 488 anticuerpo IgM anti-ratón de cabraLife techniologiesA21042dilución 1:250
DAPISigmaD95421 y mu; g/ml

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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