Método de aislados Ex Vivo Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

Resumen

Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.

Resumen

El número de pulmones donantes aceptables disponibles para el trasplante de pulmón es muy limitada debido a la mala calidad. Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Como esta tecnología se expande y mejora, la capacidad de evaluar y potencialmente mejorar la calidad de los pulmones deficientes antes del trasplante es una necesidad crítica. Con el fin de evaluar más rigurosamente estos enfoques, un modelo animal reproducible necesita ser establecido que permita el ensayo de técnicas mejoradas y la gestión de los pulmones donados, así como para el receptor de pulmón-trasplante. Además, un modelo animal EVLP de patologías asociadas, por ejemplo, inducida por la ventilación lesión pulmonar (IVL), sería proporcionar un nuevo método para evaluar tratamientos para estas patologías. Aquí se describe el desarrollo de un programa de pulmón EVLP rata y refinamientos a esto method que permiten un modelo reproducible para una futura expansión. También se describe la aplicación de este sistema EVLP modelar IVL en los pulmones de ratas. El objetivo es proporcionar a la comunidad de investigación con la información clave y "perlas de sabiduría" / técnicas que surgieron de ensayo y error y son fundamentales para el establecimiento de un sistema de EVLP que es robusto y reproducible.

Introducción

Importancia clínica

Actualmente hay una escasez de pulmones adecuados disponibles para el trasplante con sólo el 19% de los pulmones que son capaces de ser utilizados a nivel nacional que lleva a prolongado tiempo en lista de espera o los pacientes que mueren en espera de trasplante ^1. La escasez puede ser debido a los donantes de mayor edad, traumatismos, infecciones, insuficiencia orgánica multisistémica y pulmones donados a veces heridos después de la cosecha ^2. Además, el pulmón es un órgano frágil fuera de la cavidad torácica y técnicas de transporte y conservación estándar puede conducir a un deterioro y no viables pulmones. Por lo tanto, el mantenimiento y la mejora de la viabilidad pulmonar ex vivo se ha convertido recientemente en un foco importante en la medicina de trasplante de pulmón.

Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP)

Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP) ha evolucionado para perfundir continuamente órganos que se están evaluando para el trasplante y permite un período de evaluación de que todoujos para el potencial de la reanimación pulmonar o reacondicionamiento. EVLP puede prolongar totales de los órganos del cuerpo tiempo de isquemia y permite que los órganos donados para viajar distancias más largas ^3. Típicamente, los pulmones son ventilados al 50% de la capacidad pulmonar total o 20 cmH ₂ O de la presión de la vía aérea pico con una fracción de oxígeno inspirado (FiO ₂₎ de 30% a 50% ^4. Solución de preservación se perfunde a 40-60 ml / kg (aproximadamente 40% del gasto cardíaco predicho de 100 ml / kg) en seres humanos y animales grandes ^5,6, pero se perfunde en torno al 20% del gasto cardíaco de ratas ^7. La inclusión de solución STEEN ha permitido a los pulmones humanos viajen en entornos RT sin desarrollo de edema pulmonar ^9. Este trabajo pionero ha sido refinado por la Universidad de Toronto pulmón Trasplante Programa ^10-13 y está siendo evaluado para una mejor evaluación de los pulmones de donantes marginales para el trasplante ^14,15. Sin embargo, el ventilatio óptiman y perfusión condiciones necesarias para regenerar pulmones marginales y / o sub-estándar para el trasplante no se conoce y es actualmente un área activa de investigación.

Sistemas de perfusión pulmonar aislada, se han utilizado en animales pequeños para causar lesión pulmonar, vuelva a crear enfermedades respiratorias, y perfundir los pulmones con diferentes soluciones para prevenir el daño isquémico. Los investigadores han creado un modelo de pequeños animales de trasplante de pulmón utilizando el sistema aislado de pulmón de perfusión para imitar los protocolos EVLP que podrían ser utilizados en seres humanos y animales más grandes ^16-18. Sin embargo, este modelo experimental tiene muchos retos con respecto a las diversas técnicas y parámetros utilizados para imitar la fisiología humana. En particular, hay muchas sutilezas en mantener la viabilidad de pulmón durante EVLP. Estas sutilezas pueden surgir debido a diferencias en la técnica de recolección, los ajustes de ventilación con presión positiva, composición y condiciones de flujo de perfundido y la canulación de la pulmón. Therntes, el objetivo aquí es proporcionar a la comunidad de investigación con una serie de sugerencias para solucionar problemas e implementación que hemos encontrado plomo a un método robusto para implementar EVLP en un modelo de roedores.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la guía de las líneas del Cuidado de Animales institucional y el Manual del Consejo Superior de Investigaciones para el Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) y ha sido objeto de aprobación por el Comité de Ohio State University IACUC.

1. Configuración inicial

1. Monte el circuito EVLP y tienen tibia (37 ° C) perfundido que circula por el sistema antes de incorporar el pulmón ex plantado (Figura 1).
2. Ajuste el baño caliente de agua, que se utiliza para la chaqueta del depósito líquido de perfusión, intercambiador de calor, y el tórax artificial, a 37 ° C y en circulación (Figura 1).
3. Ejecutar una solución de-oxigenación (por ejemplo, 6% O _2, 8% de CO _2, 84% N ₂₎ en sentido contrario actualmente a través del líquido de perfusión en el filtro de gas para asegurar el perfundido tiene ~ 6% de oxígeno disuelto para el experimento.
   NOTA: Este perfundido de-oxigenada permite la evaluación of la función pulmonar midiendo el oxígeno se introduce en el líquido de perfusión, post-órgano.
4. Abrir el programa de adquisición de datos y conectar el transductor de presión de la arteria pulmonar, transductor de presión diferencial traqueal, transductor de presión diferencial del flujo respiratorio, transductor de peso del pulmón, y el transductor de velocidad de la bomba al circuito EVLP y la caja del convertidor de adquisición de datos / de analógico a digital ( la Figura 2).
5. Configure la mesa de operaciones y herramientas de operación en el circuito EVLP (Figura 3).
6. Establecer un pequeño contenedor de nitrógeno líquido cerca del circuito EVLP si se pueden obtener muestras.
   NOTA: El sistema de autor ha sido modificado para recoger pre-órgano y perfundido post-órgano sin interrumpir la dinámica de presión-flujo que pueden potencialmente dañar el pulmón.

2. Preparación de anestésicos y heparina, anestesia de la Rata

1. Ponga en el siguiente equipo de protección personal(PPE) antes de manipular las ratas y los tejidos de rata: máscara quirúrgica, guantes quirúrgicos, y bata desechable.
2. Pese la rata y registrar el peso.
3. Preparar 1.200 U / kg de heparina.
4. Preparar tanto 60 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina en la misma jeringa, la preparación de la primera ketamina.
5. Por vía intraperitoneal inyectar la mezcla de ketamina y xilazina en la rata y permiten 5 min para que la rata se convierten inconsciente.
6. Confirme anestesia adecuada marcando reflejo pizca dedo del pie. Si la rata no retira su dedo del pie, no se siente dolor.
7. Mueva rata para mesa de operaciones, asegurar en posición supina, y rociar con alcohol para la esterilización.

3. Extracción y ventilación inicial de los pulmones de ratas

1. Preparar 20.4 cm suturas de seda largo (3-0 o 4-0 debería ser suficiente).
2. Comienza la grabación de datos utilizando el programa de adquisición de datos.
3. Entradas para la profundidad adecuada de la anestesia, utilizando tijeras quirúrgicas entran ca peritonealvidad por una laparotomía media e inyectar heparina en la vena cava inferior.
4. Llevar la incisión cranealmente pasado del manubrio en el cuello hasta que se expone la tráquea. No romper la cavidad torácica (Figura 4A).
5. Diseccionar posterior a la tráquea en la línea media posterior y deslice una sutura de seda a la tráquea (Figura 4B).
6. Levante la sección anterior de la tráquea y hacer una incisión transversal entre los anillos cartilaginosos, altas en la tráquea. No corte a través de la porción membranosa posterior de la tráquea en este punto (Figura 4C).
7. Canular la tráquea con la cánula traqueal y segura con la sutura de seda (Figura 4D). Asegúrese de que la ligadura de sutura se asegura en la muesca para mitigar la migración de la cánula.
8. Conectar la cánula de la tráquea al circuito de ventilación.
9. Encienda el ventilador mecánico para iniciar mecánicamente la ventilación del luNGS.
   NOTA: Los ajustes iniciales fueron escogidos para ser un volumen corriente de 4 ml / kg y la presión positiva espiratoria final (PEEP) de 2 cm H ₂ O. Estos ajustes son los ajustes iniciales y dependiendo de las condiciones experimentales se pueden ajustar una vez que el órgano se encuentra en el sistema de perfusión ex vivo.
10. Introduzca la cavidad torácica a través del esternón / xifoides y continuar cranealmente hacia la horquilla esternal. Tenga cuidado de no tocar los pulmones.
    NOTA: Como el pulmón de rata es frágil, cualquier manipulación inadvertida puede conducir a trauma y edema pulmonar (Figura 5A).
11. Uso de 2 retractores, retraer la cavidad torácica para exponer correctamente la anatomía (Figura 5A). Una vez más, tenga cuidado de no tocar los pulmones.
12. Retire el timo con una ligera elevación y disección roma.
13. Desplaza los contenidos abdominales a un lado para dejar al descubierto ya sea la vena cava inferior (IVC) o de la vena mesentérica (MV).
14. Incisión ya sea el IVC o de la MV a Exsanguinate la rata, proporcionando la eutanasia.
15. Colocar una sutura de seda posterior a la arteria pulmonar y la aorta en preparación para asegurar la cánula de la arteria pulmonar (Figura 5B).
16. Haga una incisión de 2-3 mm en la superficie anterior del tracto de salida del ventrículo y colocar la cánula en la incisión y en la arteria pulmonar principal y seguro con la sutura de seda (Figura 5C).
17. Seccionar el ápice del corazón para permitir el acceso al ventrículo izquierdo y lave cualquier coágulo dentro de la vasculatura pulmonar haciendo fluir ~ 15 ml de una solución de bajo K ⁺ electrolito a través de la arteria pulmonar y hacia fuera a través de la punta del corazón en la cavidad torácica ( Figura 5D).
18. Conecte la cánula de la arteria pulmonar (AP) al circuito EVLP. Asegúrese de que la línea de flujo de entrada procedente del circuito a la cánula PA se cebó con perfundido para evitar cualquier aire que entra en el corazón y los pulmones.
19. Encienda elprincipal de la bomba peristáltica y la puso a un mínimo (~ 2 ml / min) la velocidad para permitir perfundido a ejecutar a través de la arteria pulmonar y el ventrículo izquierdo hacia la cavidad torácica. ** Paso crítico ** Asegúrese de que la presión de la AP no pico como esto es una señal de cualquiera de un bloqueo o mala canalización (Figura 6).
20. Apague la bomba peristáltica.
21. Coloque una sutura de seda detrás del corazón, alrededor de los ventrículos (Figura 7).
22. Comience el proceso de canulación de la aurícula izquierda mediante la inserción de un pequeño par de pinzas quirúrgicas en el ápice, a través de la válvula mitral, y hacia la aurícula izquierda.
    NOTA: Esto dilatar la válvula mitral y facilitar la canalización. Dilatación agresiva, o dilatación demasiado profundo, pueden lacerar inadvertidamente la aurícula izquierda haciendo que la adquisición ineficaz.
23. Retire las pinzas desde el corazón.
24. Inserte la cánula aurícula izquierda en el vértice a través de la válvula mitral y en la izquierda enbrio.
25. Fije la cánula de aurícula izquierda con la sutura de seda detrás del corazón (Figura 8).
    NOTA: Esta sutura puede ser "pre-atado" para facilitar la canalización.
26. Conecte la cánula de la arteria pulmonar a la ex-vivo circuito de perfusión pulmonar (Figura 9A). No conecte la cánula aurícula izquierda al circuito EVLP hasta que el bloque corazón-pulmón se ha eliminado completamente del cuerpo.
27. Sujetar el esófago con una pinza hemostática y corte por debajo de la abrazadera (entre la abrazadera y el diafragma), de modo que el esófago se puede utilizar para elevar la estructuras cardiopulmonar cefálica.
28. Sin rodeos diseccionar el tejido circundante y cortar la aorta descendente y los vasos auxiliares para liberar el bloque de corazón-pulmón a medida que se eleva a través del esófago (Figura 9B).
29. Seccionar la tráquea cefálica a la cánula traqueal para liberar completamente el bloque corazón-pulmón.
30. Retire el bloque corazón-pulmón y el lugar en el desiubicación gnated en el circuito EVLP (Figura 9C).
31. Conecte la cánula aurícula izquierda a la línea de salida e iniciar el principal de la bomba peristáltica (Figura 9D).

4. perfusión ex vivo de los Pulmones

1. Eliminar rápidamente la línea de ventilación desde la parte superior del aparato EVLP y fijar la caja con los sensores de presión, a continuación, insertar la línea de ventilación en la parte superior de la carcasa en la parte superior del aparato EVLP.
   NOTA: Esto permitirá que los datos de ventilación para ser registrados y presión controlados.
2. Asegúrese de que la trampa de burbujas se llena con una cantidad adecuada de líquido de perfusión de manera que no hay burbujas de aire (es decir, embolia de aire) se introducen a los pulmones.
3. Poco a poco cambiar de ventilación y perfusión ajustes a los niveles experimentales deseados durante el inicial 15 min. Además, durante esta fase inicial de aceleración, aumentar la tasa de flujo de perfusión a la velocidad y / o presión deseada.
   NOTA: Programming el ventilador para producir respiraciones suspiro intermitentes, que facilitan la circulación de fluido fuera del espacio de pulmón y por lo tanto retrasar la aparición de edema, se recomienda. Estos pueden ser producidos por ventiladores equipados con la función suspiro.
4. Definir "Hora 0" como el momento en el que los parámetros de ventilación se encuentran en un volumen corriente de 4 ml / kg, PEEP a 2 cm H ₂ O, y parámetros de perfusión están en sus niveles esperados y que permanece constante.
5. Si es necesario, tomar muestras de perfusado desde el puerto de la muestra, la congelación de flash en nitrógeno líquido, y anotar el tiempo de las muestras.
6. Cuando el experimento se ha completado, aislar cualquier piezas anatómicas necesarias para la recogida y destella congelación en nitrógeno líquido o lugar en solución fijadora para estudios posteriores.

Resultados

Los datos mecánicos en tiempo real recogidos a través del programa de adquisición de datos pueden ser fácilmente analizados para probar cualquier número de hipótesis. Por ejemplo, la Figura 10A muestra el peso medio del pulmón a través de 60 min de 10 experimentos con ratas donde los animales fueron ventilados con un volumen corriente bajo / bajo PEEP de 4 ml / kg y 2 cm H ₂ O. Aunque hay un aumento muy pequeño en peso de los pulmones durante todo el experimento, este aumento no es estadísticamente significativa (ANOVA, p = 0,92). La figura 10B muestra la presión media arterial pulmonar (PAP) a través de 60 min de 12 experimentos con ratas. El PAP inferior en el punto de tiempo 0 min es el resultado de la configuración de flujo y de ventilación inferiores utilizados en el comienzo de todos los experimentos y la PAP se mantiene constante después de este punto de tiempo sin cambios estadísticamente significativos después de t = 10 min (ANOVA en filas, p = 0.89). Figura 10C muestra la resistencia vascular pulmonar (PVR) a través de 60 min de 12 ratasexperimentos y aunque hay una pequeña disminución de la PVR después de t = 20 min, no había ninguna diferencia estadísticamente significativa en PVR durante este experimento (ANOVA en filas, p = 0,65). En comparación con los datos de PVR se muestra aquí, Noda et al. ha mostrado el PVR para aumentar ligeramente con el tiempo durante 4 h. Sin embargo, los autores informan de datos en PVR a partir de 1 hr en lugar del inicio del experimento y no hay valores de desviación estándar se proporcionan ^7. Noda et al. también no muestra datos de edema pulmonar de los 4 experimentos hr por lo que no se puede hacer la comparación con los datos presentados aquí en la figura 10A. Las principales diferencias en Noda et al. procedimiento en comparación con lo que se muestra en este trabajo son: a conservación en frío de 1 hora en una solución de LPS antes EVLP, las ratas fueron ventilados inicialmente con una mezcla de gas que incluye isoflurano para hacerlos inconsciente, la solución de perfusión se complementó con 50 mg de metilprednisolona y 50 mg de cefalosporina, total flow se definió como 20% de la gasto cardíaco calculado, se tomaron muestras de perfundido sólo después de que el pulmón se había ventilado en 100% de O ₂ durante 5 min antes y el experimento se realizó durante 4 hr.

Las muestras tomadas durante el experimento desde el perfundido también pueden ser analizados para muchos propósitos. Como ejemplo, en la Figura 11 se demuestra cómo alto volumen / ventilación de alta PEEP tidal puede inducir una respuesta pro-inflamatoria en 60 min. Para estos experimentos, la perfusión de 4 ratas ventilado en condiciones perjudiciales, es decir, de alto volumen corriente de 10 ml / kg y de alta PEEP de 8 cm H ₂ O, se analizaron por citoquinas pro-inflamatorias y anti-IL1β, TNFa e IL-4 utilizando el estándar técnicas ELISA. Como se muestra en la Figura 11, en ​​comparación con los niveles de citocinas antes de la ventilación (0 min), 60 min de la ventilación perjudicial resultó en un aumento estadísticamente significativo de IL-1β y TNF (citoquinas pro-inflamatorias) una nd ningún cambio en IL-4 (una citoquina anti-inflamatoria) de concentración. Por lo tanto, este sistema EVLP es capaz de generar perfiles de lesión pulmonar observadas comúnmente durante la ventilación mecánica.

Figura 1. Esquema y fotografía de animales ex vivo de perfusión pulmonar (EVLP) circuito pequeño. Las letras en el diagrama coinciden con las letras en la fotografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Todos los transductores están conectados firmemente a las cajas de control."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La mesa de operaciones rata se establece firmemente situado junto al circuito de perfusión ex vivo de pulmón (EVLP). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. (A) Se hace una incisión cranealmente para exponer la tráquea. La cavidad torácica no está expuesto. (B) Una sutura de seda se coloca detrás de la tráquea. (C) La tráquea se cortó parcialmente para prepararse para la canulación. (D) La cánula se coloca en la tráquea positio n y se fija con una sutura de seda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. (A) La cavidad torácica se tira hacia atrás para permitir el acceso al corazón y pulmón. (B) Preparación para la colocación de la sutura detrás de la arteria pulmonar. (C) La arteria pulmonar se canula y atado con la sutura de seda colocado previamente. (D) Una solución de bajo K ⁺ electrolito se vacía a través de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para eliminar los coágulos de sangre. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.

iempre ">
Figura 6. El aumento del flujo arterial pulmonar al lavar el pulmón puede causar la presión arterial pulmonar para aumentar dramáticamente. Si la canalización se ha realizado correctamente y no hay obstrucción importante, la presión debe disminuir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Figura 7. sutura de seda se coloca alrededor de todo el corazón en la preparación para la canulación aurícula izquierda. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

n-page = "always">
Figura 8. La cánula aurícula izquierda se sujeta en su lugar con una sutura de seda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. (A) La cánula de la arteria pulmonar se conecta al circuito de perfusión pulmonar ex-vivo. (B) El esófago se sujeta y el tejido conectivo se disecciona sin rodeos para quitar el bloque de corazón-pulmón. (C) El bloque corazón-pulmón se retira de la cavidad del pecho y se coloca en el circuito de perfusión pulmonar ex-vivo. (D) La aurícula izquierda está conectado al circuito de perfusión pulmonar ex-vivo. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10. (A) peso de los pulmones de ratas macho Sprague Dawley a través de 60 min de perfusión ex vivo de pulmón (n = 10). (B) la presión arterial pulmonar de ratas macho Sprague Dawley a través de 60 min de perfusión ex vivo de pulmón (n = 12). (C) La resistencia vascular pulmonar de ratas Sprague Dawley a través de 60 minutos de perfusión ex vivo de pulmón (n = 12), NS indica que no hay diferencias estadísticamente significativas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"Figura 11" src = "/ files / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg" />
Figura 11. Efecto de ventilación 1 hora a altos volúmenes corrientes (10 ml / kg) y alta PEEP (8 cmH ₂ O) en las concentraciones de citoquinas pro-inflamatorias y anti-en el perfundido. N = 4, * indica diferencia estadísticamente significativa con respecto a la muestra 0 h (p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12. (A) A correctamente ventilación y perfusión del pulmón conectado al circuito EVLP. (B) de alta presión al final de la espiración (PEEP) causa un desgarre en la bifurcación tráquea causando que se formen burbujas en la lesión y llenar el tórax artificial. en / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13. (A) cánula de la arteria pulmonar. Esta cánula es menor que la cánula de aurícula izquierda. (B) Izquierda cánula atrio. Esta cánula es mucho mayor que la cánula de la arteria pulmonar. (C) de la cánula de la tráquea. Esta cánula tiene nervios para ayudar en la obtención de la tráquea con sutura de seda. El fin que se inserta en la tráquea también está apuntando ligeramente para ayudar en la inserción de la cánula en la tráquea. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

09fig14highres.jpg "/>
Figura 14. (A) El ápice del corazón está en manos de un par de pinzas como el ventrículo derecho está a punto de incisión con el fin de canular la arteria pulmonar. (B) La dilatación del anillo de la válvula mitral con un par de pequeños con extremos romos pick-ups hace que sea más fácil visualizar las vías hacia la aurícula izquierda. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

MONITOREO DEL SISTEMA

¿Qué cosas se ven como cuando experimento está funcionando bien:

Una vez que las cánulas se han colocado en el circuito y los pulmones están ventilación, hay varias maneras de asegurar que el sistema está funcionando correctamente. No debe haber fugas de líquido de perfusión en toda la línea. La resistencia vascular pulmonar (PVR) debe permanecer relativamente constante (suponiendo un flujo constante). El intercambio de oxígeno debería aumentar una vez que el ventilador está funcionando correctamente y la ampliación de los pulmones para reclutar más alvéolos para el intercambio de gas. Figura 12A muestra pulmones conectados al circuito EVLP dentro del tórax artificial adecuada ventilación y perfusión.

¿Qué cosas se ven como cuando experimento no está funcionando bien:

Hay algunos problemas comunes que han tenido la mayor tasa de ocurrencia durante las etapas iniciales de un experimento EVLP. La primera y más fácil to remedio es una fuga en la línea que sale de los pulmones. Esto se nota por un conjunto de puesta en común de perfusión bajo parte del circuito y el nivel en el depósito disminuye continuamente. Compruebe y apriete cualquier conector del tubo alrededor del área del derrame e inspeccionar el propio tubo de escape. Si esta pérdida se produce antes de que el pulmón, puede también introducir burbujas en el pulmón. Esto debería remediarse lo más rápidamente posible como burbujas de aire en el perfundido se traducirá en daño a los tejidos y causar un aumento significativo en el PVR. También puede haber una fuga procedente del pulmón o de una de las cánulas. Esto puede ser causado por cualquiera de deslizamiento de una cánula o una obstrucción en la línea de salir causando una acumulación de presión. Inspeccione la posición de ambas cánulas para asegurar ninguno ha deslizado o torcido. La presión de la AP también debe ser monitoreado durante este proceso, ya que un aumento instantáneo de la presión PA es un signo evidente de que se ha producido recientemente una obstrucción de algún tipo. Figura 12Bmuestra un pulmón roto que se rompió debido a las altas presiones. Un escape del propio pulmón también puede ser causado por un desgarro en el tejido. Este problema puede o no ser reparable pero reposicionamiento y volver a apretar las cánulas es la mejor opción en este escenario.

Principales puntos de aprendizaje / Oportunidades:

Ensayo y error el desarrollo del sistema de perfusión pulmonar ex vivo ha permitido identificar varias cuestiones clave que esbozamos para facilitar la aplicación eficaz del sistema EVLP. En primer lugar, respecto de la contratación, es importante que las técnicas anestésicas estándar se siguen correctamente para anestesiar a los animales (suficiente anestésicos, inyección en el peritoneo) y el cumplimiento de todas las políticas IACUC se requiere. La cánula (mostrado en la Figura 13 A, B, y C) debe lavarse repetidamente con el fin de eliminar cualquier coágulo y / o escombros dentro de la vasculat pulmonarUre. Con respecto a la selección de los animales, le sugerimos que utilice Sprague Dawley o ratas Lewis con un peso de 250-350 g. Especial cuidado debe ser tomado al cannulating ratas que pesa cerca de 250 g desde los vasos será más pequeño y por lo tanto mucho más difíciles de canular sin lesionar la vasculatura. Si las ratas más pequeñas, o un modelo de ratón, se va a utilizar, puede necesitar ser usado más pequeña cánula.

Canulación traqueal no es típicamente un reto, siempre y cuando la sutura está fijado adecuadamente haciendo pasar primero una posterior sutura de seda a la tráquea después de la disección de la fascia de los alrededores y antes de la canulación. Siga esto con una incisión anterior 1-2 anillos traqueales por encima de la sutura para pasar la cánula. Atar nudos en cuadrados entre los anillos traqueales con el fin de asegurar que dentro de una ranura para una mejor seguridad (Figura 4C). La canulación de la arteria pulmonar (AP) es más difícil en comparación con la cánula traqueal. Los pasos siguientes se utilizaron en este estudiopara este procedimiento. En primer lugar, comprender el ápice del corazón con un par de pinzas. Pase otro par de pinzas en el seno transverso y el hilo de sutura para fijar la cánula en la PA proximal. Incisión en el ventrículo derecho inmediatamente antes del tracto de salida del ventrículo (TSVD) (Figura 14A). Después de la incisión en el TSVD, la cánula se orientará hacia el tracto de salida pulmonar arteria. Tener la sutura en posición detrás de la arteria pulmonar / aorta antes de la ventriculotomía derecha aumenta la eficiencia (Figura 5C). La cánula debe estar asegurado en el lugar con la sutura para evitar el desplazamiento. Una complicación importante puede ocurrir si la cánula PA no está en la orientación anatómica correcta. La cánula puede ser insertado demasiado lejos y sólo perfundir una rama o convertirse-mal posicionado con torsión de la muestra de corazón-pulmón después de retirarlos de la cavidad torácica. Esto puede ser fácilmente orientado de nuevo a la posición original para preservar el ángulo apropiado de anatomiposición de cal. Por último, la aurícula izquierda (LA) canulación es la parte más difícil del procedimiento. La cánula LA tiene que ser colocado dentro de la aurícula izquierda. Con los tejidos de ser extremadamente friable, ser conscientes de no utilizar la fuerza o la torsión significativa con el fin de evitar un desgarro en la vena pulmonar y la aurícula izquierda que luego hacer el experimento insalvable. La cánula PA es el mejor situado antes de la cánula LA. A ventriculotomía izquierda con la eliminación del ápice se ha demostrado que alteran la tendinosas cordae y permitir un acceso más fácil a través de los velos mitrales. Además, el ventriculotomía hace que sea más fácil para dilatar y visualizar la válvula mitral y para alimentar la cánula a través de la válvula mitral. La dilatación del anillo de la válvula mitral con un par de pequeñas de extremos romos pick-up se puede hacer con el fin de visualizar el tracto en el LA (Figura 14B). Sutura debe colocarse detrás del corazón antes de la canulación. Esto se puede hacer simplemente levantando el corazón usando un par de small pick-ups extremos romos y la colocación de la sutura debajo ya través del corazón. El LA ahora está listo para ser canulado. Alimentar a la cánula LA a través de las pick-ups con el fin de visualizar correctamente la colocación de la cánula en la aurícula izquierda. Tenga especial cuidado de no desplazar la cánula hacia el ventrículo izquierdo. La sutura debe entonces ser fijado firmemente a lo largo del miocardio del ventrículo izquierdo. Fijación de la sutura a la aurícula izquierda podría ocluir la totalidad o parte de la cánula.

Durante el procedimiento, es crucial que el aire no permanece en la sección de flujo de entrada del aparato. Cualquier aire significativa puede producir una embolia de aire aumentar la PVR (efectivamente un "air-lock") que se traducirá en un flujo de perfundido mucho menor para una presión dada. Varios puntos se pueden utilizar para eliminar el aire dentro del sistema. Se espera que el aire dentro de la sección de flujo de salida y no debe tener ningún efecto perjudicial sobre los pulmones. Un modelo porcino para la hipertensión pulmonar ha sidose muestra para recrear la patología de pequeñas cantidades de aire continuo durante un período de 8 semanas. El aumento de aire disminuye la cantidad de perfusión presente mientras que causan la inflamación de los tejidos circundantes ^19.

El inicio de la perfusión puede ocurrir una vez que la canulación es completa, pero antes de que el tubo procedente de la LA está conectado a la línea de EVLP. Perfundido se debe ejecutar a través de despejar cualquier coágulo de sangre y esto perfusión puede vaciar en la pared torácica sin ningún problema. Cambio de la bomba de perfusión a modo manual y aumentando lentamente el caudal a ~ 2 ml / min permite una estrecha vigilancia de la presión de la AP. Presiones más de 20 a 30 cm H ₂ O pueden indicar una obstrucción y mirando para perfusión de salir de la LA es también un indicador, pero esto puede ser muy difícil de ver. Si la presión aumenta a más de 20 a 30 cm H ₂ O, detener la bomba y vuelva a revisar ambos canulaciones. Una vez que la presión es constante alrededor de 10 a 20 cm H ₂ O permitir ªe perfundido para ejecutar a través y en la cavidad torácica durante 2 min. En este momento la línea desde el LA se puede conectar al circuito de EVLP. La velocidad de la bomba de perfusión se puede aumentar a 5-10 ml / min. A medida que el cabezal de fluido avanza a través del circuito, habrá un aumento en la presión PA debido al aumento de la altura de la cabeza de fluido y por lo tanto la presión estática. Si el fluido no puede fluir por encima del punto más alto en la línea, puede ser necesario o bien aplicar una fuerza de succión en el extremo opuesto de la línea o intentar bajar la parte más alta de la línea. Una vez que este problema se supera, la perfusión debe circular sin ningún problema.

Unos temas deben ser controlados con respecto al ventilador. En primer lugar, la torsión de los bronquios / tráquea y la posición de corazón-pulmón puede ocurrir como los pulmones se vuelven más edematosa y aumenta el peso. Es importante para las cánulas para permanecer en una posición anatómica relativamente cerca, por lo tanto alterando uno o ambos cánulae puede ser necesario. La presión o ventiladores controlados por volumen, así como la ventilación positiva o negativa se pueden utilizar con este sistema EVLP. Para el modelo de rata, hemos encontrado el uso de presión positiva, la ventilación controlada por volumen funciona bien en volúmenes corrientes entre 4-10 ml / kg y en las presiones positiva espiratoria final (PEEP) entre 2-8 cm H ₂ O. Sin embargo, una PEEP de 8 cmH ₂ O puede causar una posible rotura en la bifurcación de la tráquea. Después de cada experimento (o conjunto de experimentos si se realiza-back-to-back), la línea de ventilación que conduce a la tráquea debe limpiarse de cualquier lavado broncoalveolar (BAL) que pueden haber viajado hasta la tráquea. Este líquido se endurecerá si se deja intacto y puede bloquear completamente la línea de ventilación.

La composición perfundido es crítica para un experimento EVLP éxito. Una mezcla de dextrano al 5% permite la perfusión pulmonar que está cerca de las condiciones fisiológicas, mantiene una presión oncótica estable para conducir b fluidoack en la vasculatura para prevenir el edema y previene la trombosis dentro de los vasos pulmonares. Es importante señalar que algunas especies de ratas pueden ser alérgicos a dextrano que puede provocar edema pulmonar ^20. El contenido de la perfusión fue consistente en todos los grupos experimentales en este estudio, por lo tanto, el contenido de dextrano no debe ser un factor de confusión. La presión oncótica es una variable crítica que tiene el potencial para mejorar o producir edema tisular. Disoluciones de perfusión comercialmente disponibles que están optimizados para almacenamiento estático frío o perfusiones normothermic se han utilizado en este sistema para aumentar los tiempos de viabilidad de pulmón. Tomamos nota de que algunas de estas soluciones contienen albúmina y una preocupación es la posibilidad de albúmina bovina desencadenar una respuesta inflamatoria en el pulmón de roedores. Aunque la composición óptima perfundido es un tema en curso de la investigación, el perfusado debe tener en cuenta la presión oncótica, la capacidad de presión osmótica y el almacenamiento en búfer. We recomienda que la solución se basa en una solución o cultivo celular Krebs-Henseleit medios modificada. La presión oncótica debe ser mantenida por dextrano o albúmina, dependiendo de la aplicación. La tasa de la presión de perfusión y el flujo afecta a los parámetros de perfusión de órganos y supra-fisiológica pueden hacer que el órgano propensos a trauma mecánico.

Indicadores visuales durante el experimento:

Hay muchas señales visuales, así como indicaciones de datos en tiempo real que se puede utilizar para determinar si un experimento EVLP está funcionando bien. El pulmón seguirá siendo el mismo tamaño y se desinflará en el mismo volumen después de cada respiración. También habrá ninguna fuga del propio pulmón. El PVR, peso de los pulmones, y el cumplimiento se mantendrá relativamente constante. La producción de oxígeno se mantendrá constante o aumentar ligeramente.

Hay muchos indicadores visuales cuando el pulmón se convierte en peligro durante un experimento. El pulmón se convierte en un edematosand crece rápidamente en tamaño y peso. El color de los cambios pulmonares (desde una tan-rosa a blanco) y bolsas de líquido puede ser identificado en el tejido. Si la tráquea o los pulmones rupturas de barotrauma o más de distensión, habrá burbujeando desde el punto de la lesión (Figura 12B). La producción de oxígeno disminuye y el PVR y el cumplimiento se incrementará dramáticamente.

El potencial del uso de un modelo EVLP en animales pequeños como roedores abre la puerta a futuros estudios mejorando el tratamiento de los trasplantes de pulmón. Sin embargo, el modelo animal pequeño requiere una mejor comprensión de imitar verdaderamente un trasplante de pulmón. Este modelo puede ser utilizado en el futuro para mejorar los tratamientos médicos y definir los parámetros de línea de base para futuros estudios de trasplante de pulmón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IPL-2 Sistema Básico de Perfusión Pulmonar	Harvard Apparatus Pinza
#5 acero inoxidable, curvado 11  cm	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pinza #5 Dumostar, 11  cm	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Pinza #7 Titanio, 12  puntas de cm curvadas	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tijeras McPherson-Vannas 8  cm, Str 5  mm	Kent Scientific Corporation	INS14124
Tijeras Vannas 8  cm Str 5  mm	Kent Scientific Corporation	INS14003
Bandeja de esterilización de instrumentos 5" x 7"	Kent Scientific Corporation	INS800101
Heparina 30,000 unidades por 30 ml	Productos farmacéuticos APP	suministrados por OSU Pharmacy
Ketamina 500  mg por 5   ml	JHP Pharmaceuticals	suministrado por OSU Pharmacy
Xylazine 100  mg por 1  ml	Akorn	Suministrado por la farmacia
10  cc jeringa de insulina 29  Aguja G x 1/2"	B-D	309301
Hyflex NBR	Ansell	S-17310M	Guantes a prueba de mordeduras
BL1500	Sartarius	Practum 1102-1S	Scale
Large Flat Bottom Rerestraint	Braintree Scientific Inc	FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat	Túnel de ratas para inyección
Guantes de examen sin polvo de nitrilo Sterling, grandes	Kiberly-Clark	50708
Rapidpoint 405	Analizador de gases en sangre	Siemens
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
LabChart v7.3.7	ADInstrumentos
cánula traqueal	Harvard Apparatus 733557
Pulmonar Cánula arteria	Harvard Apparatus	730710
Cánula de aurícula izquierda	Harvard Apparatus 730712
Bomba peristáltica	Ismatec	ISM 827B
Ventilador para animales pequeños modelo 683	Harvard Apparatus	55-000
Ecoline Star Edition 003, E100	Lauda	LCK 1879
Tubo de calentador de agua Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Kit de conexión D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
PowerLab 8/35	ADInstrumentos	730045
Módulo amplificador de transductor TAM-A tipo 705/1	Hugo Sachs - Harvard Aparato	73-0065
Amplificador de transductor TAM-D tipo 705/2	Hugo Sachs - Harvard Aparato	73-1793
SCP Servocontrolador para perfusión tipo 704	Hugo Sachs - Harvard Apparatus	732806
Amplificador de puente de frecuencia portadora CFBA tipo 672	Hugo Sachs - Harvard Apparatus
control de ventilador VCM de 731747 tipo 681	Hugo Sachs - Harvard Apparatus	731741
Módulo de control de tiempo TCM tipo 686	Hugo Sachs - Harvard Apparatus	731750
IL2 Juego de tubos para perfusar	Harvard Apparatus	733842
Juego de tubos para cámara húmeda	Harvard Apparatus	73V83157
Tygon E-3603 Tubo 2.4  mm ID	Aparato de Harvard	721017	línea de perfusión que ingresa al pulmón
Tygon E-3603 Tubo 3.2  mm ID	Aparato de Harvard	721019	línea de perfusión que deja el pulmón
solución			que enjuaga el pulmón