Artículo de método

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

DOI:

10.3791/52389

⸱

6 de marzo de 2015

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1Drug Delivery, Disposition, and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University (Parkville Campus)

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos una técnica para canular el conducto linfático mesentérico en ratas que permite cuantificar el transporte de lípidos y fármacos a través del sistema linfático después de la administración intestinal. La técnica se puede adaptar para evaluar las concentraciones de linfa mesentérica y/o el transporte de líquidos, células inmunitarias, péptidos, proteínas y moléculas lipofílicas.

Resumen

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El sistema linfático intestinal juega un papel clave en el transporte de líquidos, la absorción de lípidos y la función inmune. La linfa fluye directamente desde el intestino delgado a través de una serie de vasos linfáticos y los nodos que convergen en el conducto linfático mesentérico superior. La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto permite la recogida de la linfa mesentérica que fluye desde el intestino. Linfático mesentérico consiste en una fracción celular de las células inmunes (99% de linfocitos), fracción acuosa (líquido, péptidos y proteínas tales como citocinas y hormonas intestinales) y la fracción de lipoproteínas (lípidos, moléculas lipófilas y apo-proteínas). Por consiguiente, el modelo de la canulación del conducto linfático mesentérico se puede utilizar para medir la concentración y la velocidad de transporte de una serie de factores del intestino a través del sistema linfático. Los cambios en estos factores en respuesta a diferentes retos (por ejemplo, las dietas, antígenos, fármacos) y en la enfermedad (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, VIH, diabetes) puede también be determinada. Un área de expansión de interés es el papel del transporte linfático en la absorción de fármacos lipófilos administrados por vía oral y profármacos que se asocian con las vías de absorción de lípidos intestinales. Aquí se describe, en detalle, un modelo de rata canulado conducto linfático mesentérico, que permite la evaluación de la velocidad y extensión de los lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático durante varias horas después del parto intestinal. El método es fácilmente adaptable a la medición de otros parámetros en los ganglios. Proporcionamos una descripción detallada de las dificultades que se pueden encontrar al establecer este método quirúrgico complejo, así como los datos representativos de experimentos fallidos y exitosos para proveer instrucción sobre cómo confirmar el éxito experimental e interpretar los datos obtenidos.

Introducción

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La linfa fluye desde el intestino delgado a través de un proceso unidireccional que se origina en lactíferos individuales que están contenidos dentro de cada pequeño vellosidades intestinales 1. Lacteales son relativamente permeable al fluido, macromoléculas y células y la formación de la linfa por lo tanto comienza con la entrada de estos factores en lacteales. La linfa inicial en los lacteales fluye posteriormente desde el intestino a través de una red de microvasos linfáticos, la recolección (aferente) los vasos linfáticos, una serie de ganglios linfáticos mesentéricos y en última instancia los post-ganglionar (eferente) los vasos linfáticos. Dentro de los nodos, la linfa pasa a través de una serie de senos medulares donde se produce el intercambio con las células inmunes residentes nodo, así como material que entran en el nodo de la sangre. Todos los ganglios que fluye desde el intestino delgado finalmente converge en el conducto linfático eferente mesentérica superior y, posteriormente, la cisterna del quilo. La cisterna del quilo además contiene linfático de drenaje de los tejidos periféricos caudales, intestinal, regiones hepáticas y lumbares y se une al conducto linfático torácico junto con la linfa del mediastino y partes craneales del cuerpo. El conducto linfático torácico vacía linfático directamente en el sistema venoso en la unión de las venas yugular interna y subclavia izquierda. El protocolo descrito aquí, que permite la recogida de la linfa directamente desde el conducto linfático mesentérico superior, por lo tanto facilita el análisis de diversos factores que transitan directamente desde el intestino a la circulación (general) sistémica a través del sistema linfático intestinal.

Las principales funciones fisiológicas asignados al sistema linfático intestinal son para mantener el equilibrio de fluidos, para facilitar la absorción de los lípidos y la molécula lipófila, y para permitir respuestas inmunes apropiadas 1. Las células tumorales y virus también se propagan a través de los vasos linfáticos intestinales 2-4 y principales cambios se producen dentro de los vasos linfáticos en diversas patologías inflamatorias y metabólicas 5-7. Latanulation del conducto linfático mesentérico para recoger la linfa en el mesenterio permite un análisis de flujo de fluido mayor a través de los vasos linfáticos intestinales, así como la cuantificación de la tasa de concentración y el transporte de varias células y moléculas. Los cambios en la concentración o el tránsito de estos factores en respuesta a diversos desafíos (por ejemplo, dietas, antígenos, drogas) y en modelos de enfermedad (por ejemplo, colitis, VIH, diabetes) pueden también ser evaluados. Si bien es imposible describir ampliamente cada componente linfático que puede ser analizada y comparada aquí, linfático mesentérico consiste simplista de acuosa, lípidos y las fases celulares. Componentes de interés en la fase acuosa incluyen péptidos y proteínas tales como antígenos o tolerógenos 8, mensajeros inmunes tales como citoquinas y mediadores de mastocitos, 9 y mediadores metabólicos tales como incretinas 10. La fracción celular de la linfa mesentérica post-nodal consiste casi completamente (más del 99%) de lymphocytes 11. Varias células inmunes (células dendríticas, mastocitos, etc.) entran en los vasos linfáticos mesentéricos pre-nodales pero permanecen dentro del nodo 12. Si las células dentro de la linfa aferente son de interés, es posible recoger estas células a través de la eliminación de la nódulos linfáticos mesentéricos varios días antes de la canulación del conducto linfático mesentérico 12. De esta manera los aferentes y eferentes conductos linfáticos están directamente conectados y las células en los ganglios linfáticos aferentes pasan directamente en el conducto linfático mesentérico. El tránsito y el fenotipo de varias células inmunes que pasan a través de los vasos linfáticos intestinales por lo tanto pueden ser examinados. Quizás la razón más común citada para la recogida de la linfa mesentérica hasta la fecha, sin embargo, es estudiar el procesamiento intestinal, la absorción y el transporte de lípidos de la dieta y las moléculas lipofílicas 10.

Después de la ingestión, lípidos de la dieta son digeridos (por ejemplo, de triglicéridos de ácidos grasos y monoglicéridos, phospholipid a los ácidos grasos y lisofosfolípidos, colesterol y éster de ácido graso y colesterol, etc.) y dispersas dentro de la luz intestinal en pequeñas micela y las estructuras vesiculares por medio de la adición de anfífilos de la bilis (fosfolípidos, colesterol y sales biliares) y la acción de enzimas pancreáticas 10,13. De aquí que se absorben en los enterocitos. Una proporción de los componentes absorbidos se re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos y ésteres de colesterol dentro de las células absorbentes (enterocitos). Estas re-esterificados lípidos se ensamblan a partir de una combinación de componentes lipídicos exógena ingerida y componentes de lípidos endógenos de la bilis secretada, piscinas de lípidos de la mucosa o el suministro de sangre intestinal 13. Desde aquí los lípidos esterificados se almacenan ya sea dentro de los enterocitos o ensamblados en lipoproteínas intestinales (quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)), junto con diversos apoproteínas y otras moléculas lipófilas ( por ejemplo, vitaminas) 10,13. Después de salir de los enterocitos, lipoproteínas son transportados específicamente desde el intestino a la circulación sistémica a través del sistema linfático mesentérico como los lactíferos intestinales son más permeables a su entrada de los capilares sanguíneos intestinales. Una proporción de los componentes de lípidos absorbidos también son transportados desde el intestino a la circulación sistémica a través de los capilares sanguíneos y la vena porta como individuales, no de lipoproteínas asociadas, las moléculas 14. En general, sin embargo, la ruta de transporte de la vena porta es sólo un jugador significativo en la absorción de los lípidos de longitud de cadena corta y media.

La recogida de la linfa mesentérica por lo tanto permite la evaluación del transporte de lipoproteínas y componentes asociados (lípidos, moléculas lipófilas, APO-proteínas) desde el intestino. Las lipoproteínas se pueden cuantificar y caracterizados con la ventaja de que las lipoproteínas ganglios mesentéricos, en general, están en una nascent estado, ya que no han sido ampliamente modificado por enzimas sistémicas tales como la lipoproteína lipasa 15. Mientras que el modelo de rata canulada linfático mesentérico ha históricamente quizás ha descrito más ampliamente para el análisis de transporte de lípidos / lipoproteínas de desde el intestino, un área de interés es la ampliación de la función de los vasos linfáticos en el transporte de fármacos lipófilos, profármacos y otros xenobióticos 13,16 que es el foco del modelo descrito aquí. Drogas lipofílicas (generalmente aquellos con log P> 5 y solubilidad en cadena larga de triglicéridos> 50 mg / g, aunque excepciones son evidentes) 17,18, profármacos 19 y otros xenobióticos 13,16 puede tener acceso a los linfáticos intestinales de forma pasiva o por integrando activamente en las vías de transporte de lipoproteínas intestinal 19.

Así, la técnica de canulación linfático mesentérico de rata tiene muchas aplicaciones. Bollman et al. Descrita por primera vez un technique para canular el conducto linfático mesentérico en ratas en 1948 20. Desde entonces un número de variaciones sobre el modelo se han descrito. Por ejemplo, la colección se puede producir cuando la rata se anestesió con varios anestésicos 21,22, o en el estado consciente mientras refrenado 15 o se mueve libremente 23,24. Las ratas se pueden administrar diferentes soluciones de rehidratación y otras sustancias tales como lípidos y formulaciones de fármacos a diferentes velocidades en el estómago, intestino o parenteral (típicamente 0-5 ml / hr) 25. En algunos estudios, el conducto linfático torácico en lugar de conducto linfático mesentérico se canula para estimar el transporte desde el intestino a través de los vasos linfáticos aunque esto puede sobreestimar el tránsito en el intestino delgado, en función del factor de interés, ya que el conducto linfático torácico también recibe la linfa de otra regiones 22,26. Modelos de canulación linfáticos también se han descrito en varias otras especies, incluyendo ratones 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovejas, cerdos y perros 30 31. Sin embargo, el modelo de rata es la más amplia y coherente citado. Los protocolos detallados para la canulación del conducto linfático mesentérico seguida de la recogida de la linfa en consciente 25 o anestesiado 22 ratas y ratones 15,27 se han publicado previamente y el lector interesado se dirige a estos protocolos. Este protocolo es el primero en demostrar la técnica en un formato visualizado.

El modelo de rata linfático canulado tiene ventajas sobre los modelos animales más grandes en términos de costo, la facilidad de la cirugía y las consideraciones éticas. Cuando se compara con el modelo de ratón, la cirugía canulación linfático mesentérico es también más fácil en la rata Aunque el modelo de ratón permite estudios más detallados en los animales transgénicos 27. Sin embargo, hay algunas limitaciones del modelo de rata, en particular aquellos asociados con diferencias en la fisiología, que extrapolat límiteiones a otras situaciones pre-clínicos y clínicos. Por ejemplo, en el flujo de bilis de rata es constante e independiente de la ingesta de alimentos mientras que en mayor alimentos especie o lípidos estimulan el flujo de bilis 32. Esto crea desafíos para la obtención de los entornos de pre y post-prandial de representación en la rata que reflejan lo que se ve en las especies y los seres humanos más grandes. Para los estudios de administración de fármacos, las especies más grandes también pueden ser preferidos cuando se evalúa el transporte linfático después de la administración de la dosis humana realista forma 25. En un estudio reciente, se encontró que las tasas de transporte de lípidos en la linfa mesentérica ser comparables entre especies (ratón, rata, perro) después de la administración de una masa equivalente y el tipo de lípidos que proporciona cierta confianza en la extrapolación de los datos de transporte de lípidos a través de especies 27. Sin embargo, el transporte de un modelo lipofílica drogas, halofantrina, clasificados en orden de tamaño de los animales (es decir, perro> rata> ratón). Un factor de escala puede, pues, ser obligado a exextrapolar los datos de transporte de drogas linfáticos de rata para otras especies.

Una limitación de los modelos de canulación de la linfa, en general, es que la recogida pasiva linfático directamente de un conducto linfático puede modificar el flujo y transporte linfático desde los vasos linfáticos trabajan en contra de un gradiente de presión que se altera una vez que el recipiente se canula 33. El modelo canulación linfáticos también puede ser difícil de establecer en los laboratorios que no están familiarizados con la técnica. Así, se han descrito modelos alternativos. Por ejemplo, el tránsito de factores través del sistema linfático intestinal, tales como lipoproteínas y moléculas lipofílicas, se ha estudiado indirectamente a través de la colección de la sangre. Uno de estos modelos consiste en comparar las concentraciones sanguíneas de lípidos y / o drogas tras la administración oral en presencia y ausencia de inhibidores (por ejemplo, colchicina, Pluronic L81, cicloheximida) de la producción de lipoproteínas intestinal que bloquean el transporte linfático 34. Una ventajade los modelos que cuantifican el transporte linfático indirectamente a través de la recolección de muestras de sangre es que permite cierta evaluación del transporte linfático en los seres humanos como no se requiere cirugía invasiva 35. Sin embargo, los inhibidores de transporte linfático no son específicos y los factores que son transportados a través de los vasos linfáticos se diluyen y se modifican en la circulación sistémica que complica tales evaluaciones. In vitro alternativas también se han descrito. Por ejemplo, los cultivos de células Caco-2 o aislado de los enterocitos se han utilizado para estudiar en más detalle la secreción intestinal de moléculas que entran en los vasos linfáticos 36-38. Un modelo avanzado in vitro que es más representativo del microambiente intestinal humano también fue recientemente descrito 39. En este modelo de una capa de células endoteliales linfáticas es co-cultivadas con células Caco-2 que permite análisis más detallado de la transferencia de sustancias desde el intestino en los vasos linfáticos. Sin embargo, en vitro sistemas de células carecen de flujo de intercambio y transferencia denominado interconexión con un lumen intestinal y sangre subyacente y de aporte vascular linfático. En un enfoque alternativo, Kassis et al. Estableció un doble canal (vídeo de alta velocidad de campo claro y fluorescencia) en el sistema de formación de imágenes in situ que permite comparaciones cuantitativas entre contracción de los vasos, el flujo de la linfa y las concentraciones de lípidos fluorescentes en los vasos linfáticos mesentéricos 33. Una ventaja de este modelo sobre el mencionado en sistemas in vitro es que permite un seguimiento preciso del paso de las células inmunes a través de los vasos linfáticos. Las medidas absolutas de lípidos masa (o drogas) de transporte son, sin embargo, aún no se establecerán a partir de los métodos de imagen. In vitro e in silico enfoques para predecir específicamente el grado de transporte del fármaco lipofílico a través de los vasos linfáticos intestinales también se han publicado 40-42. Por ejemplo, la afinidad ex vivo de varios ccomuestos para quilomicrones plasma se encontró correlación razonablemente bien con su transporte linfático en vivo 41. Posteriormente, el mismo grupo estableció un modelo en silico para predecir la afinidad fármaco para quilomicrones basados ​​en múltiples propiedades fisicoquímicas 40. Holm et al. También estableció un relativamente complejo en el modelo de silico para predecir de plano de transporte linfático de compuestos lipófilos sobre la base de los descriptores moleculares 42. Estos modelos pueden proporcionar un enfoque útil para predecir el grado de transporte linfático de fármacos desconocidos. Será, sin embargo, se requerirá la validación de los modelos con una amplia gama de medicamentos y en los diferentes laboratorios para confirmar su exactitud y reproducibilidad.

La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto sigue siendo el único medio para examinar directamente el contenido de drenaje linfático del intestino delgado y la velocidad de tránsito de la compleja serie de factores (células, proteínas,péptidos, lípidos, drogas) en la linfa en una situación in vivo. Aquí se describe un protocolo para la canulación del conducto linfático y carótida arteria mesentérica que permite la recogida de la linfa mesentérica y la sangre sistémica de las ratas anestesiadas. Los datos representativos demuestran cómo el modelo puede ser utilizado para examinar los lípidos y el transporte del fármaco desde el intestino a través del sistema linfático mesentérico. Esto es seguido por una discusión de las dificultades que se pueden encontrar en el establecimiento del modelo y una guía para resolver problemas. Una vez establecido el modelo es una herramienta poderosa para investigar el transporte linfático intestinal.

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Protocolo

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Los estudios descritos en este manuscrito fueron aprobados por el comité de ética animal local y se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo de Australia y Nueva Zelanda para el cuidado de los animales en las directrices de investigación y docencia. Antes de iniciar cualquier procedimiento de animal, asegúrese de que el permiso adecuado se obtiene a través de la institución / organización local. Al igual que con todas las cirugías animales, asegúrese de que la cirugía es realizada por operadores debidamente capacitado, en condiciones asépticas y que los anestésicos, analgésicos y antibióticos se administran cuando sea necesario para asegurar un resultado ético y exitoso.

1. Preparativos el día antes del procedimiento quirúrgico

  1. Fast la rata la noche antes de la cirugía si es necesario. Asegúrese de que la rata tiene libre acceso al agua.
  2. Preparar las soluciones que se administran a la rata.
    1. Preparar una solución de rehidratación tal como solución salina estéril o solución de Ringer.
    2. Preparar unsoluciones estéticas como se requiere. El anestésico utilizado en los experimentos descritos aquí consistía en "Cocktail 1" preparada combinando 1,9 ml de ketamina 100 mg / ml, 0,5 ml de xilazina 100 mg / ml, 0,2 ml de acepromacina 10 mg / ml y 2,5 ml de solución salina y " Cocktail 2 "que consta de 1 ml de ketamina 100 mg / ml y 0,1 ml acepromacina 10 mg / ml. NOTA: inhalado isoflurano o sevoflurano pueden ser preferibles ya que puede proporcionar un plano quirúrgico de anestesia durante un período de tiempo más largo.
    3. Opcionalmente preparar una formulación que contiene el fármaco, por ejemplo, una emulsión de lípidos. Realizar estudios de estabilidad apropiadas para asegurar la estabilidad de la formulación durante el período de almacenamiento y administración.
      NOTA: La naturaleza exacta de la formulación y fármaco a administrar variará con cada estudio como el objetivo de los estudios de transporte de drogas linfático es más a menudo para evaluar la eficiencia del transporte de drogas linfático como una función de la formulación y de drogas administrado.
      1. La formulación utilizada en los experimentos representativos en la figura 4 y 5 aquí se prepara, como se ha descrito previamente 43. En pocas palabras, incorporar 14 C ácido oleico (2-5 Ci) y halofantrina (200 mg) en 40 mg de ácido oleico antes de la dispersión en 5,6 ml de una fase acuosa que consta de taurocolato de sodio 5 mM en tampón fosfato salino (pH 6,9).
      2. Para las formulaciones que contienen 2-monooleına, añadir 7,1 mg de 2-monooleına junto con otros componentes, a la fase acuosa, al mismo tiempo que la fase de ácido oleico que contiene halofantrina. Preparar las formulaciones que contienen 2-monooleına inmediatamente antes de la administración a la rata como 2-monooleına es relativamente inestable y isomerises a 1-monooleına.
      3. Posteriormente emulsionar las formulaciones por ultrasonidos durante 2 min a TA.
        NOTA: Como se ha descrito previamente 43, vigilar la estabilidad de las formulaciones por i) inspección visual de la emulSion bajo luz polarizada para asegurar que la emulsión no se separa en fases, ii) análisis de tamaño de partículas inmediatamente después de la preparación y después de la dosificación utilizando dispersión dinámica de la luz para proporcionar una indicación de cualquier cambio de fase y / o la separación, y iii) el análisis de las concentraciones de halofantrina usando un ensayo de HPLC validado.
  3. Preparar la solución de anti-coagulante que contiene 10 mg / ml de EDTA en agua estéril o 10 UI / ml de heparina en solución salina para lavar la cánula linfático. También preparar la solución de anti-coagulante que contiene 2,5 a 10 IU / ml de heparina en solución salina para lavar la cánula de la arteria carótida.
  4. Preparar las cánulas de polietileno para la inserción en el conducto linfático mesentérico (0,8 mm OD, 0,5 mm ID), la arteria carótida (0,96 mm OD, 0,58 mm ID o 0,8 mm OD, 0,5 mm ID) y el duodeno (0,96 mm OD, 0,58 mm ID )
    1. Cortar las cánulas a la longitud requerida (típicamente de 25 - 30 cm de la arteria carótida y la cánula duodenal y 10 - 15 cm para la Cann linfáticoULA) y colocar un bisel en la punta de las cánulas utilizando una cuchilla quirúrgica estéril (véase la Figura 1).
      NOTA: Esto aumenta la facilidad de inserción de la cánula y reduce la incidencia de la obstrucción de la cánula post-inserción.
    2. Colocar un punto de anclaje forma J en la cánula intraduodenal colocando un pequeña porción de la cánula sobre sí mismo, calentándolo con una placa más claro o más caliente y luego cortar al tamaño (véase la Figura 1).
  5. Coloque la cánula linfático a una aguja 25 G y la jeringa que contiene una solución anticoagulante (preparado en el paso 1.3). Llene la cánula linfático con la solución de anti-coagulante y dejar la solución en la cánula O / N para reducir la incidencia de formación de coágulos en la cánula linfático durante la recogida de la linfa.
  6. Preparar tubos de linfa y muestra de sangre recogida. Pre-sopesar tubos de recogida de la linfa, tubos de etiquetas para la linfa y muestra de sangre recogida y añadir solución anticoagulante. Añadir suficiente solut anticoagulanteion para lograr una concentración final de 1 mg / ml de EDTA en agua estéril o 10 a 20 UI / ml de heparina en la linfa o la sangre recogida.

2. Preparativos Inmediatamente antes de comenzar el procedimiento quirúrgico

  1. Compruebe todas las cánulas mediante el lavado con solución salina estéril o solución anti-coagulante para asegurarse de que son patentes.
  2. Preparar la rata para el procedimiento quirúrgico.
    NOTA: El conducto linfático mesentérico es más visible en las ratas que han comido o han administrado una dosis de aceite como la linfa mesentérica vuelve lechoso y opaco, con una mayor carga de lípidos. Algunos operadores, especialmente los nuevos en la cirugía, por lo tanto, les resulta más fácil para canular el conducto linfático mesentérico cuando las ratas son pre-dosificados con un aceite (alrededor de 0.1 - 1 ml) como el de oliva o aceite de soja 0,5 a 2 horas antes de la cirugía de comenzar . Sin embargo, antes de la dosificación de aceite afecta el transporte linfático de los lípidos, medicamentos lipofílicos y otros factores en los ganglios de tal manera que puede no ser ideal para pre-dosis de aceitedependiendo del objetivo del experimento.
    1. Anestesiar la rata durante todo el periodo de recolección de la cirugía y de la muestra.
      1. Por ejemplo, iniciar la anestesia mediante inyección subcutánea de 1,5 ml / kg de cóctel I (de la etapa 1.2.2) en un pliegue de piel en la parte posterior del cuello ratas usando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 25 G. Mantener la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 0,44 ml / kg de Cocktail 2 (de la etapa 1.2.2) aproximadamente cada hora según se requiera, usando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 25 G.
      2. Antes de comenzar la cirugía asegurar que la profundidad de la anestesia es suficiente mediante la observación de la frecuencia respiratoria, el movimiento de la barba, el tono muscular y respuestas a estímulos tales como pinzamiento de pie. Administrar anestesia adicionales según sea necesario.
    2. Afeitarse la piel de las regiones quirúrgicos, que incluyen el lado derecho del abdomen para la linfa y la canulación duodeno, y el cuello y la región de la clavícula izquierda para cánula de la arteria carótidación.
    3. Limpie las regiones quirúrgicos asépticamente utilizando solución de clorhexidina o solución de povidona yodada y un exfoliante etanol al 70%. Repita esto 3 veces para cada región, terminando con una limpieza final con etanol al 70%.
  3. Colocar el animal en decúbito dorsal en una hoja limpia por encima de un cojín quirúrgico climatizada (37 ° C).

3. La canulación de la mesentérica linfa del conducto

  1. Colocar el animal con el lado derecho hacia el operador. Realizar la cirugía con o sin la ayuda de un microscopio quirúrgico según sea necesario.
  2. Abra la capa superior de la pared muscular abdominal con una incisión recta 4 cm que se extiende desde la línea media (apéndice xifoides) para el flanco derecho de aproximadamente 2 cm por debajo de la caja torácica (margen costal) usando una hoja de bisturí estéril (véase la Figura 2B).
  3. Abra las capas restantes de la pared muscular abdominal 4-5 mm laterales a la línea media a la banda derecha con un pequeño parde tijeras quirúrgicas (véase la figura 2B).
  4. Retraer el intestino delgado debajo de la pared muscular abdominal izquierda y mantenerlo en su lugar con 2-3 piezas de gasa estéril saturadas con solución salina normal.
  5. Puente la rata a través de una jeringa de plástico de 10 ml en posición horizontal debajo de la espalda de la rata a nivel de riñón derecho para facilitar la visualización del conducto linfático mesentérico.
  6. Localizar el conducto linfático mesentérica superior: un recipiente de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diámetro, que es perpendicular a la riñón derecho e inmediatamente rostral y paralela a la arteria mesentérica (un recipiente pulsante de sangre de color rojo oscuro; véase la Figura 2C).
    NOTA: En ratas pre-dosificados no de ayuno o de aceite de la vasija es de color blanco, opaco y más fácil de visualizar que en ratas en ayunas en los que es bastante translúcido.
  7. Inspeccionar el área inmediatamente caudal a la gran conducto linfático mesentérico superior y la arteria mesentérica para determinar si un segundo conducto linfático accesorio más pequeño, espresente. Si está presente, bloquear el flujo de la linfa a través del conducto cortando el conducto y ocluir con superglue, o atando una sutura alrededor del conducto, para asegurar que todo el volumen de la linfa que fluye desde el intestino se recoge desde el conducto linfático mesentérico superior.
  8. Pasar un par de pinzas rectas a través del lecho de grasa peri-renal en el margen inferior del riñón derecho, ya través de las capas de tejido conectivo inmediatamente por debajo de la vena cava, en una dirección paralela con el conducto linfático mesentérica superior.
  9. Con la punta de las pinzas apoderarse de la cánula linfático y tire de ella a través del lecho de grasa peri-renal con un extremo inmediatamente adyacente al conducto linfático mesentérico y el otro exteriorizado del animal a nivel del riñón derecho.
  10. Aislar el conducto linfático mesentérico de capas superpuestas de tejido conectivo y grasa por disección roma. Tenga cuidado de no perforar o dañar el conducto linfático.
  11. Después de aislar el conducto linfático, hacer un pequeño hole en el conducto linfático, ya sea con micro-tijeras, la punta afilada de pinzas de joyero o una aguja de 25 G. Tenga cuidado de no cortar completamente el recipiente.
  12. Asegúrese de que la cánula linfático está completamente llena con una solución de anti-coagulante (usando una jeringa y aguja de 25 G) sin espacios de aire. Insertar la cánula linfático aproximadamente 2 - 4 mm en el interior del conducto linfático mesentérico a través del pequeño agujero con la ayuda de un pequeño par de fórceps.
  13. Observe la cánula linfático durante un par de minutos. Observe un flujo gradual de la linfa intestinal desde el extremo de recogida gratuita de la cánula si la canalización se realiza correctamente. Si la canalización no es correcta, repita los pasos 3.8 a 3.12.
  14. Si la canulación es exitosa, asegurar la cánula mediante la colocación de una pequeña gota de adhesivo veterinaria sobre el orificio de entrada en el conducto linfático. Tenga cuidado de no ocluir el vaso a través de la aplicación de un exceso de adhesivo veterinaria.
  15. A la espera de que el adhesivo veterinario para establecer, observe el flujo de la linfa durante varios minutos para asegurar que el procedimiento de canulación fue exitosa. Una vez determinado el éxito de la canulación, retirar las piezas de gasa que se colocaron en la cavidad abdominal con cuidado y colocar el intestino delgado en su posición original.
  16. Colocar un tubo de recogida de la linfa que contiene anti-coagulante (véase el paso 1.6) en el extremo de la cánula para recoger la linfa de flujo libre.
  17. A continuación, canular el duodeno para la infusión de soluciones de rehidratación y / o formulaciones.

4. La canulación del duodeno

  1. Coloque la cánula duodeno a una jeringa (por ejemplo, 10 ml) lleno con la solución de rehidratación.
  2. Identificar el duodeno como el rosa brillante (con más vasos sanguíneos) sección del intestino delgado, que al suave hacia abajo tirando revela el estómago.
  3. Hacer un pequeño orificio de punción en el duodeno aproximadamente 2 cm por debajo de la unión del estómago y el duodeno (píloro) usandoun estéril 23 G aguja.
  4. Insertar el extremo de gancho en forma de J de la cánula duodenal a través del orificio de punción. Asegure en su lugar con una gota de pegamento de cianoacrilato.
  5. Comenzar la hidratación de la rata mediante la unión de la cánula a la jeringa de rehidratación cargada en una bomba de infusión. De acuerdo con la literatura tasas de rehidratación van 0,5-3 ml / hr 15,25.
  6. Después de la terminación de la linfa y la canulación duodeno, cerrar la incisión en la pared muscular abdominal con suturas. Entonces cerrar la incisión de la piel mediante la aplicación de unas cuantas gotas de adhesivo de tejido (cianoacrilato) a lo largo del lado de la incisión y pellizcando la piel en ambos lados de la incisión juntos.

5. La canulación de la arteria carótida

La canulación de la arteria carótida se puede realizar antes o después de la canulación del conducto linfático mesentérico. Algunos operadores prefieren para canular la arteria carótida antes de la canulación del conducto linfático a fin de reducir pocialmente desalojar la cánula linfático cuando se mueve el animal.

  1. Colocar una marca en la cánula de la arteria carótida 2,5 cm desde la punta de bisel para identificar la porción del tubo para insertar en la arteria. Conectar el otro extremo de la cánula (es decir, sin bisel) a una aguja G 23 o 25 unida a una jeringa llena con solución de anti-coagulante y llenar la cánula con la solución de anti-coagulante asegurándose de que no están presentes los espacios de aire.
  2. Para facilitar la canalización, coloque la rata anestesiada en decúbito dorsal con el cuello estirado y la cabeza apuntando hacia el operador. Tenga en cuenta que algunos operadores prefieren realizar esta técnica con la cola de la rata que apunta hacia el operador.
  3. Coloque un 1 - incisión longitudinal de 1,5 cm a través de la capa de piel por encima de la izquierda de la tráquea en el plano sagital.
  4. Diseccionar el tejido conectivo subcutáneo usando pinzas de punta roma para exponer los músculos del cuello pareadas subyacentes.
  5. Retraer los músculos del cuello to revelar la arteria carótida izquierda (ubicado ~ 1 cm por debajo de la superficie de la piel e intermitente). Limpiar el tejido conectivo suprayacente de la arteria mediante disección roma.
  6. Aislar una sección ~ 1 cm de la arteria cuidadosamente usando pinzas de tejido contundentes, teniendo cuidado de no dañar el nervio vago pista adyacente. Realice esto mediante la apertura y el cierre de las pinzas de punta roma verticalmente a lo largo de cada lado de la arteria para liberarlo del tejido circundante y el nervio vago.
  7. Con unas pinzas de punta fina, enhebrar dos suturas de seda por debajo de la arteria carótida y colocarlos en cada extremo de la sección de la arteria aislado. Tie fuera de la sutura más próximo al operador y más lejos de corazón y la clavícula (Figura 3A) de la rata.
  8. Ocluir el flujo sanguíneo a través de la arteria por la colocación de un par de pinzas de punta fina directamente debajo de la arteria (Figura 3B).
  9. Utilizando las tijeras iris de punta fina, colocar una pequeña incisión en la superficie superior de la arteria (alrededor de 1/3 de lacamino hacia abajo desde la parte superior de la zona aislada). Lave toda la sangre derramada en la superficie de la arteria con solución salina heparinizada y limpie suavemente con puntas de algodón.
  10. Inserte la punta de la cánula en la arteria con un par de pinzas punta curvada. Una vez insertado, retirar las pinzas de punta fina rectas ocluir el flujo de sangre y avanzar la cánula de 2,5 cm en la arteria utilizando dos pares de pinzas, una para sujetar la cánula dentro de la arteria para evitar que la sangre se escape hacia atrás y la otra para insertar la cánula.
  11. Utilice una abrazadera arteria pequeño para contener la cánula dentro de la arteria y retirar las pinzas de punta fina rectas que fueron colocados debajo de la arteria en el paso 5.8 para ocluir el flujo de sangre.
  12. Confirmar la permeabilidad de la cánula mediante la inyección de solución de anti-coagulante en la cánula y el dibujo de nuevo una pequeña cantidad de sangre (Figura 3C). A continuación, enjuagar la cánula con una solución anticoagulante y sellar el extremo usando la llama de un mechero o un tapón de la cánula.
  13. Ate ªe cánula en su lugar con las dos suturas colocadas debajo de la arteria en el paso 5.8.
  14. Retire la abrazadera arteria y asegurar una tercera sutura alrededor de la arteria y la cánula. Cierre del cuello de la herida con puntos de sutura.

Período 6. Post-quirúrgica y Formulación Infusión

  1. Seguir manteniendo la rata bajo anestesia y en la almohadilla caliente.
  2. Rehidratar la rata a través de la infusión de solución de rehidratación en el duodeno durante al menos 0,5 horas tras la finalización de las canulaciones. Observe la disminución de la tasa de flujo de la linfa (~ 0,1-0,5 ml / h) durante el período inicial después de la canulación y pronto aumentará a una línea de base estable (0,4 a 2,5 ml / hr dependiendo de la velocidad de rehidratación).
  3. Tras el período de recuperación, infundir la formulación de interés (que contiene lípidos, medicamentos, etc.) en el duodeno a través de la cánula. Opcionalmente, utilizar una bomba de infusión para regular la velocidad de flujo de formulación. NOTA: En el protocolo descrito aquí los animales permanecen ANAESthetised durante todo el período de la cirugía y la recogida de la linfa y por eutanasia bajo anestesia de tal manera que no se requiere analgesia adicional. Si el protocolo se modificó y los animales están habilitadas para recuperar la conciencia, se requerirán analgesia adecuada y la atención post-operatoria.
  4. A la finalización de la infusión de la formulación de continuar para rehidratar la rata a una velocidad de 1,5-3 ml / hr con solución salina normal en el duodeno para prevenir la deshidratación.
  5. Siga manteniendo la rata en la plataforma quirúrgica climatizada 37 ° C para mantener la temperatura (como en el paso 2.3), orina expresa de la vejiga a través de suave empujón hacia abajo en la parte inferior del abdomen como sea necesario y volver a aplicar la pomada oftálmica cada hora (como en el paso 2.2. 3). Se recomiendan los cambios de posición del cuerpo regulares si el animal es recuperar la conciencia después del procedimiento.

7. Recogida de los nódulos linfáticos y las muestras de sangre para evaluar los lípidos y la absorción del fármaco

  1. Recogen linfa continuamente entubos que contienen anti-coagulante. Cambio de tubos en los intervalos de tiempo requeridos (por ejemplo, cada hora).
  2. Recoger muestras de sangre en los puntos de tiempo establecidos.
    1. Ocluir el flujo sanguíneo a través de la cánula por la flexión de la cánula hacia atrás aproximadamente 2 cm desde el extremo sellado. Quitar el sello de la cánula cortando el extremo sellado o quitar el tapón de la cánula.
    2. Usando una jeringa vacía, retirar salina heparinizada de la cánula hasta que la sangre llena toda la cánula.
    3. Utilizando una nueva jeringa vacía, retire el volumen deseado de sangre y colocar en un tubo que contiene anticoagulante.
    4. Utilizando la primera jeringa, reemplace la sangre tomada antes del muestreo para reducir la pérdida de sangre innecesario. Antes de la inyección, golpecitos en la jeringa mientras lo mantiene en posición vertical para asegurarse de que no hay burbujas de aire entran en la cánula.
    5. Usando una jeringa, reemplazar el volumen de sangre extraída de la rata con una solución de anti-coagulante. Asegúrese de que no hay sangre residual es visible en la cánula como cualquier restante puede coagulary bloquear la cánula.
    6. Doble la cánula aproximadamente 2 cm del extremo no sellado para bloquear el flujo de sangre y retire la jeringa. Uso de la llama de un mechero o un tapón de la cánula, vuelva a sellar la cánula.
  3. A la finalización de la sangre y la linfa colección de la rata, la eutanasia a las ratas mediante la administración intraperitoneal de> 100 mg kg pentobarbital / sodio.
  4. Determinar la tasa de flujo de la linfa mediante la medición de la masa de la linfa recogida durante cada período de tiempo.
  5. Medir la concentración de fármaco y el lípido en la linfa y la sangre utilizando, por ejemplo, HPLC, HPLC-MS o el uso de kits comerciales, para evaluar los lípidos y la absorción del fármaco eficiencia.
  6. Calcular el transporte de masa de fármaco y los lípidos en los ganglios partir del producto de las concentraciones y el volumen de la linfa medidos recogidos.

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Resultados

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Los resultados de un experimento representativo para cuantificar la medida acumulativa y la tasa de lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático intestinal después de la entrega utilizando el modelo de canulación linfático mesentérico se muestra en la Figura 4 y la Figura 5. En este experimento, 200 g de el modelo lipófilo halofantrina fármaco se administró en el duodeno de ratas durante 2 h en una formulación que contiene 40 mg de ácido oleico (incluyendo 2 - 5 Ci...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El modelo de rata mesentérica linfáticos canulación permite la cuantificación directa de la concentración y la velocidad de transporte de varias células y moléculas (tales como lípidos y fármacos) del intestino a la linfa y los cambios a estos que se producen en respuesta al desafío de diversas sustancias (dieta , antígenos, fármacos, formulaciones, etc.) 10,27 y la enfermedad (cáncer, los virus, la colitis, la resistencia a la insulina, etc.) 5-7. Los componentes recogidos en los...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se agradece la financiación del Consejo Australiano de Investigación (ARC) y del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Suero fisiológico estérilBaxter healthcareAHB 1307Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Baxter de 100 ml de bolsas de solución salina, caja de 50
70 % de etanol en aguaCualquieraSe puede utilizar cualquier marca
Solución de gluconato de clorhexidina (Microshield 4)Livingstone InternationalJJ60243LSe puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Solución BetadineLivingstone InternationalBU0510Se puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)PROVET VICTORIA KETA I 1http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xilacina 100 mg/ml)PROVET VICTORIA TRO-3828http://www.provet.com.au/
ACP 10 Inyección (Acepromazina 10 mg/ml)PROVET VICTORIA VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Pentobarbitona sódicaPROVET VICTORIA 24529Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Lethabarb ® 325 mg/ml de pentobarbitona sódica, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparina (35000I.U. en 35 mL)Sigma Pharmaceuticals337220http://sigmaco.com.au/
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sal disódica dihidratadaSigma-AldrichE1644Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la sal disódica de EDTA de Sigma.
Cánula de polietileno (PE) diámetro exterior 0,96 mm x diámetro interno 0,58 mmExtensiones de microtubosPE8050Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el tubo de PE de 0,96 x 0,58 mm, 30 m
Cánula de polietileno (PE) de diámetro exterior 0,8 mm x diámetro interno 0,5 mmExtensiones de microtubosPE9658Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el tubo de PE de 0,8 x0,5 mm, 30 m
ReglaCualquieraSe puede utilizar cualquier marca
MarcadoresCualquieraSe puede utilizar cualquier marca
Encendedor de cigarrillosCualquieraSe puede utilizar cualquier marca
Adhesivo veterinarioCualquieraSe puede utilizar cualquier marca
Agujas de calibre 23Livingstone InternationalDN23GX0.75LVSe puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Livingstone Aguja Desechable, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6& search=DN23GX0.75LV
Agujas de calibre 25Livingstone InternationalDN25GX1.0LVSe puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la Aguja Desechable Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
Jeringa DN25GX1.0LV
1 ml LivingstoneInternational T3SS01TASe puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
Jeringa de 10 ml LivingstoneInternational T3SS10SASe puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Hisopos de gasaLivingstone InternationalGSC075Se puede utilizar cualquier marca y cortar a la medida requerida. Un ejemplo aquí es el hisopo de gasa relleno de algodón de 7,5x7,5 cm, 8 capas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Bastoncillos de algodónLivingstone InternationalCTAST075DPSe puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el aplicador de algodón Livingstone de plástico de doble punta. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Almohadilla térmicaRatekWT1Se puede utilizar cualquier marca que mantenga la temperatura a 37 ° C. Un ejemplo de ello es la bandeja de calentamiento Ratek.
Lámpara quirúrgicaHarvard Apparatus72-0215 con 72-0267Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el aparato de Harvard V-Lux 1000 Fuente de luz fría con guía de luz de cuello de cisne bifurcada, negro, fibra de 4,7 mm de diámetro (cada brazo). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail y  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Microscopio quirúrgicoZeiss495005-0014-000Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot y KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Sutura de sedaLivingstone InternationalDTSK163019F4Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es  

3/8 círculo corte inverso sutura de seda 3/0 rosca 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Hojas de bisturíFine Science Tools (FST)10020-00Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la hoja de bisturí FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Mango de bisturíFine Science Tools (FST)10004-13Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el mango de bisturí FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Tijeras quirúrgicas pequeñasFine Science Tools (FST)14060-09Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Tijeras finas, de 9 cm con filo de 21 mm, afiladas, rectas. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Pinzas con punta curva dentadaFine Science Tools (FST)11001-13Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la pinza de patrón estándar FST de 13 cm con punta curvada de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Tijeras de iridectomíaFine Science Tools (FST)15000-08Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Pinza con punta recta dentadaFine Science Tools (FST)11650-10Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Graefe de 10 cm recto con punta dentada de 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Pinzas con punta lisa, afilada, recta y finaFine Science Tools (FST)11251-10Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la pinza FST Dumont #5 recta de 11 cm con punta de 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Pinzas con pinzas curvas finas lisasFine Science Tools (FST)11063-07Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello son las pinzas delicadas FST de 9 cm con punta lisa de 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x HemostáticosFine Science Tools (FST)13010-12Se puede utilizar cualquier marca. No todos los operadores utilizan los hemostáticos. Un ejemplo es FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats con 20 mm de largo x 1,3 mm de ancho dentado, punta recta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Portaagujas de suturaFine Science Tools (FST)12001-13Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el portaagujas Hasley FST de 13 cm con punta de 16 mm de largo x 1,9 mm de ancho. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Pinza para arteriasFine Science Tools (FST)18050-28Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la mordaza recta FST Bulldog Serrefines, de 28 mm de largo y 9x1,6 mm con prensa de abrazadera mediana. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Ácido oleicoSigma AldrichO1008Cuando se requiera, se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es ácido oleico puro al 99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
Ácido 14C-oleicoPerkin NEC317050UC Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el ácido oleico, [1-14C]-, 50µ Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Taurocolato de sodioSigma AldrichT4009Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el ácido taurocólico, sodio, sal, hidrato, ≥ 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU
HalofantrineGlaxo Smith KlineLa halofantrina fue amablemente proporcionada como regalo por Glaxo Smith Kline
Fosfato de sodio monobásicoSigma Aldrich71507Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el fosfato de sodio monobásico monohidratado, BioXtra, para biología molecular, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU
Fosfato sódico dibásicoSigma Aldrich71643Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el fosfato de sodio dibásico dihidratado, BioUltra, para biología molecular, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU

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Canulaci n del conducto linf tico mesent ricotransporte linf tico intestinalt cnica de recolecci n de linfam todo de canulaci n duodenalcanulaci n de la arteria car tidamedici n de la tasa de flujo linf ticoevaluaci n del transporte de l pidosevaluaci n del transporte de f rmacosabsorci n linf tica de f rmacospreparaci n del modelo quir rgico

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