Abstract
La capacidad de las células malignas para evadir el sistema inmune, caracterizado por el escape del tumor de ambos respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se acepta ahora como un sello importante de cáncer. Nuestra investigación sobre el cáncer de mama se centra en el papel activo que desempeñan linfocitos infiltrantes de tumores en la progresión tumoral y la evolución del paciente. Hacia este objetivo, hemos desarrollado una metodología para el aislamiento rápido de células linfoides intactos de tejidos normales y anormales en un esfuerzo para evaluar los próximo a su estado nativo. Los homogeneizados preparados usando un espectáculo disociador mecánica tanto una mayor recuperación de la viabilidad celular y preservando al mismo tiempo la expresión receptor de superficie en comparación tejidos digeridos con enzima para. Por otra parte, la digestión enzimática del material insoluble restante no se recuperó células CD45 + adicionales que indican que las mediciones cuantitativas y cualitativas en el homogeneizado primaria probablemente reflejen realmente la infiltración de las subpoblaciones en la Fragm tejidoent. Las células linfoides en estos homogeneizados pueden ser fácilmente caracterizado usando inmunológica (fenotipo, la proliferación, etc.) o molecular (ADN, ARN y / o proteína) enfoques. Células CD45 + también pueden ser utilizados para la purificación subpoblación, la expansión in vitro o crioconservación. Un beneficio adicional de este enfoque es que el sobrenadante tejido primario a partir de los homogeneizados se puede utilizar para caracterizar y comparar citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos presentes en tejidos normales y malignos. Este funciones de protocolo extremadamente bien para los tejidos de mama humanos y deberían ser aplicables a una amplia variedad de tejidos normales y anormales.
Protocol
NOTA: Todos los especímenes fueron adquiridos utilizando un protocolo aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Jules Bordet con el consentimiento informado por escrito obtenido de cada paciente.
1. Preparación del homogeneizado de tejido
- Diseccionar tejidos resecados (tejido maligno y normal resecado de la sala de operaciones) están en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomada la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normal se procesan de forma rutinaria plazo de 1 - 3 horas de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 usando procedimientos de bioseguridad estándar para los tejidos humanos. Un diagrama de flujo del protocolo se ilustra en la Figura 1.
- Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumorales) y medir la longitud, anchura y altura (largo x ancho x alto). Este es un paso importante para la posterior normalización de las subpoblaciones de células, el ARN extraído, etc.
NOTE: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000 mm 3 con nada de grasa si es posible. - Pie de imprenta el fragmento del tumor en un portaobjetos de vidrio para tinción H & E para verificar que el tejido es en realidad parte del tumor.
- Para ello, pulsando un microscopio portaobjetos de vidrio en el fragmento del tumor y aplicar una suave presión con los dedos durante unos segundos.
- Fijar el portaobjetos con isopropanol durante 2 min seguido de una etapa de lavado en agua. Contratinción el tejido durante 30 segundos con hematoxilina de Mayer.
- Lave la diapositiva en seis baños de agua. Teñir en Floxina B 2% durante 15 s.
- Lave en un baño de agua, seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua.
- Incubar en isopropanol durante 1 min y de drenaje. Claro en dos baños de xileno.
- Montar con medio de montaje basado xileno. Examine para celularidad tumoral (Figura 2).
NOTA: Principalmente, las células tumorales se adhieren a la diapositiva improntado - el estroma, linfoide o adipose células raramente permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2).
- Coloque el fragmento de tejido en un pequeño plato de cultivo que contiene 1 ml de la, medio de células hematopoyéticas libre de suero definido químicamente (en lo sucesivo denominado medio) a temperatura ambiente y trocea en pedazos pequeños (~ 1 - 2 mm 2) utilizando un estéril bisturí.
- Transferir todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo disociador C mecánica.
- Enjuague la placa de Petri y el bisturí con 2 ml de medio con una pipeta Pasteur y añadir esta al tubo C (volumen de medio para la disociación = 3 ml).
- Utilice la A.01 programa disociador mecánico para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una suspensión de células individuales. Coloque el tubo de C en el aparato y ejecutar el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 segundos).
NOTA: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado por el tejido mamario humano, otra tumo tejido o tipos pueden necesitar usar un programa diferente y debe ser probado primero. - Retire el tubo C del aparato y decantar el homogeneizado directamente en un filtro de células de 40 micras sentado en un tubo de 50 ml. Usando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, transferir cualquier líquido restante en el tubo C para el filtro de células.
- Transferir el líquido filtrado en un tubo de 15 ml con una punta de micropipeta 1 ml. Temporalmente mantener el filtro de células y su tubo 50 ml.
- Enjuague el tubo C con un adicional de 3 ml de medio y transferir este, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, para el filtro de células todavía sentado en el tubo de 50 ml. Exprima una cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido no homogeneizada en el tubo de 50 ml moviendo suavemente alrededor del filtro con una pipeta Pasteur limpia o 1 ml punta que posteriormente desechado para evitar contaminar el eluido.
- Coloque el colador celular al revés de tél tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido no homogeneizada cae de nuevo en el tubo C.
- Vuelva a homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01.
- Verter esta segunda homogeneizado a través del filtro de células sentado en el tubo de 50 ml, lavar el tubo C de nuevo con medio de 3 ml (como en el paso 1,10) y transferir con la pipeta Pasteur para el filtro de células sentado en el tubo de 50 ml de nuevo apretando un máximo cantidad de líquido desde el tejido conectivo residual atrapado en el filtro de células.
- En este punto, un volumen de ~ 2,5 ml es en el tubo de 15 ml y ~ 9 ml en el tubo de 50 ml.
2. La separación del sobrenadante de tejidos y células
- Centrifugar los homogeneizados en los 15 ml y 50 ml tubos durante 15 min a 600 xg a temperatura ambiente.
- Decantar el SN desde el tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o Ti normalesDICIÓN SN (volumen final de 2,5 ml) se precisó y alicuotó antes de su almacenamiento a -80 ° C para análisis futuros (ver más abajo).
- Desechar el sobrenadante del tubo de 50 ml.
- Resuspender suavemente ambos sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero romper suavemente el sedimento celular en ambos tubos (tocando el tubo sobre una superficie dura). Resuspender el sedimento celular suelta en los 50 ml con 500 l de medio y transferir la suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspender el pellet segundos. Repita este paso una vez con los segundos 500 l de medio para la recuperación máxima de las células.
- Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 l de azul de tripano (dilución 1: 1) y contar el número de células viables utilizando un hemocitómetro.
NOTA: En este punto una fracción de la suspensión celular puede también ser analizada por citometría de flujo para evaluar el tamaño celular, granularidad y si se desea un número limitado de marcadores subpoblación para más precise evaluación de la distribución relativa de célula en el homogeneizado antes de extenso análisis o experimentación. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan etiquetado CD45 para la normalización de las subpoblaciones. - Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT, o tejido normal están ahora listos para la purificación adicional o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan en el mismo día de la cirugía.
NOTA: Para el análisis de citometría de flujo pero no de clasificación de células de las células rojas de la sangre residual debe ser lisadas después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de sangre roja tampón de lisis celular al sedimento celular, inmediatamente agitación durante 1 seg y la incubación de un mínimo de 10 min en la sala de temperatura (protegido de la luz) antes del análisis.
3. Aclaración del sobrenadante de Tejidos
- Centrifugar los tubos de 1,5 ml con SN tejido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Retire con cuidado tél sobrenadante sin tocar o alterar el sedimento. Transferir a un tubo limpio (o tubos) dependiendo del número y volumen de alícuotas deseados.
- Almacenar el sobrenadante a -80 ° C para uso futuro.
4. sangre del paciente
- Se recoge una muestra de sangre de cada paciente como un control por punción venosa en tubos heparinizados el día antes de la cirugía. Centrifugar la sangre a 400 xg durante 10 min a 20 ºC con el freno para obtener el plasma y la capa leucocitaria.
- Retire el plasma y clarificar por centrifugación a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alícuota y almacenar plasma a -80 ° C para uso futuro. Se diluye la capa leucocitaria en medio
- Separar las células mononucleares utilizando estándar de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque antes del análisis inmediato, el aislamiento subpoblación, ADN / ARN / extracción de la proteína o la criopreservación.
5. Citometría de Flujo
- Las células de la etiqueta según fabricacióninstrucciones del r a 4 ° C, protegido de la luz. Lisar las células rojas de la sangre en las suspensiones de células a partir de fragmentos de tejido después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de tampón de lisis celular al sedimento celular.
- Vortex inmediatamente durante 1 segundo e incubar un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Pasar las células marcadas en un citómetro de flujo para la adquisición de datos sin lavar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La digestión enzimática de fragmentos de tejido, ya sea con soluciones disponibles en el mercado de disociación de tejido o diversas mezclas de laboratorio de colagenasa, DNasa y / o inhibidores de hialuronidasa, escinden una amplia variedad de receptores en la superficie de las células. Nuestros estudios, se centró inicialmente en las células T CD4 + que infiltran los tumores de mama, se presentaron rápidamente con un problema técnico importante debido a la escisión de los receptores de CD4 de la superficie utilizando protocolos de digestión enzimática estándar 4-8. Hemos probado una variedad de enzimas de colagenasa con o sin DNasa y los inhibidores de hialuronidasa, encontrando que la colagenasa I y II eliminado por completo CD4 de la superficie celular, a pesar de alta viabilidad de los linfocitos (Figura 3A). Un efecto moderado sobre CD4 se observó con colagenasa IV a tiempos cortos de incubación (1 - 2 hr) con etiquetado anticuerpo CD4 inferior detectados en los ganglios linfáticos y el tejido digerido tumor en comparación con la sangre y la médula ósea no digerido del mismo paciente (La Figura 3B; que debido a las limitaciones en el tejido que recibimos hemos podido comparar los ganglios linfáticos digerido y no digerido y tejido tumoral). Esta pérdida de CD4 se confirmó que era un subproducto técnica de digestión de colagenasa IV mediante la comparación de las células no digerido y digerido T CD4 + aisladas de la sangre de donantes sanos (datos no mostrados). Mientras que estas células CD4 lo T se pueden aislar a partir de fragmentos de tejido IV-digerido con colagenasa utilizando perlas magnéticas, las poblaciones purificadas frecuentemente contienen cantidades variables de contaminación por otras células del microambiente del tumor y por lo tanto eran subóptimas para nuestros propósitos experimentales.
En una constante búsqueda de un mejor enfoque, en 2008 se probó un nuevo disociador mecánica sin el uso de enzimas. Este aparato produce homogeneizados de tejido de mama rápidamente y con integridad receptor de superficie mantenida 9. Representante flujo citometría de gráficos de puntos del tumor homogeneizados de células Follodisociación ala y etiquetado con anticuerpos específicos contra las células epiteliales (EpCAM) y leucocitos (CD45) se muestran en la Figura 3C. Estas imágenes son observaciones ordinarias típicas para homogeneizados tumorales de mama. Este protocolo no altera significativamente la viabilidad de las células (4% de células muertas) CD45 +; sin embargo, hay una pérdida considerable de EpCAM + células viables (38% de células muertas en el tumor que se muestran; varía entre los tumores). A pesar de esta pérdida, el EpCAM + CD45 + viables y subconjuntos pueden ser segregadas sobre la base de tamaño y la estructura en grandes células epiteliales (= células tumorales), pequeñas células epiteliales y células grandes CD45 + y células CD45 + pequeña (la mayoría de las células , que son principalmente los linfocitos; Figura 3C).
El aumento significativo de células CD45 + viables obtenidos utilizando este enfoque permite la adquisición de multicolor reproducible citometría de flujo de datos (usandohasta diez colores) para caracterizar mejor los subconjuntos TIL en el cáncer de mama. Representante citometría de flujo de gráficos de puntos de los principales subconjuntos TIL se muestra en la Figura 4, con nuestros experimentos recientes que demuestran que también es posible detectar y cuantificar menores subconjuntos de células T y B infiltrantes del tumor 10-12, incluyendo la tinción intracelular para T canónica y la transcripción de células B factores 12. Estrategias de compuerta de linfocitos se basan en células CD45 + viables identificadas con una tinción de viabilidad (nota:. Los tumores pueden variar mucho en la cantidad de restos celulares y células epiteliales muertas, según el subtipo C., grado, etc.). Este enfoque ha sido utilizado con éxito para purificar subpoblaciones de linfocitos desde el homogeneizado con cuentas magnéticas o clasificación de células para el análisis de la expresión génica utilizando microarrays o QRT-PCR 9. Mediadores solubles de la SN, incluyendo citoquinas y las inmunoglobulinas, se han cuantificado usando un Microesfera inmunoensayo basado con los datos resultantes se normalizaron con el tamaño del fragmento de tejido. Una comparación de la expresión de citoquinas (una piscina Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) o inmunoglobulinas totales (IgA, IgE, IgG, IgM) en BC SN con SN a partir de tejido de mama normal revela aumentos tanto en asociados con el tejido del tumor (Figura 5). Estas de SN tejido primario También se han analizado con eficacia para los antígenos 10-12 y usado para tratar experimentalmente los linfocitos de donantes sanos, reproduciendo así el fenotipo TIL en las células normales 9.
Figura 1. Protocolo de diagrama de flujo. Nuestro procedimiento para el procesamiento de tejidos humanos frescos y algunos enfoques analíticos que pueden utilizarse posteriormente para evaluar la infiltración de linfocitos tejidos humanos se muestran.
Imagen de una huella tejido del tumor de mama Figura 2. H & E manchadas. Esta huella, tomado de un fragmento de tejido del tumor de mama fresco, muestra la presencia de células tumorales con los espacios abiertos áreas que no fueron transferidos reflectantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
. Figura 3. Optimización de la disociación del tejido mamario para el análisis de linfocitos análisis de citometría de flujo de: (A) expresión de superficie CD4 en los linfocitos de no digerida y la colagenasa I / II digerido tejido tumoral; (B) la expresión de CD4 en los linfocitos de los ganglios linfáticos y el tejido digerido tumor ingenioh colagenasa IV y en comparación con la sangre y la médula ósea células no digeridas del mismo paciente; y (C) el análisis de los leucocitos totales (CD45 +) y células epiteliales (EpCAM +) a partir de tejido tumoral rápidamente disociado mecánicamente utilizando el protocolo descrito aquí. La viabilidad de las células epiteliales y células CD45 + utilizando nuestro protocolo se evaluó a través de la incorporación de colorante de viabilidad puede arreglar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. tumor infiltrante subconjuntos de linfocitos en el homogeneizado. Multicolor análisis de citometría de flujo se realizó en el día de la cirugía después de la disociación mecánica utilizando el protocolo descrito aquí. La células viables y las principales subpoblaciones linfocitarias unre mostrado: CD3 es un pan marcador de células T, CD4 y CD8 son importantes marcadores de subconjuntos de células T y CD19 es un marcador de células B sartén. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. mediadores solubles en el sobrenadante. Un panel de citoquinas (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) y las inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) se evaluaron utilizando inmunoensayos basados en perlas para analizar SN deriva de normal y BC tejidos utilizando el protocolo descrito aquí.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudio describe un método optimizado para la rápida preparación de los homogeneizados de tejidos normales y malignos de mama sin digestión enzimática para la clasificación posterior de células, la extracción, la criopreservación y / o análisis fenotípico de CD45 + subpoblaciones. El objetivo de este enfoque experimental es para producir imágenes de la TIL que refleja de cerca su estado in vivo y compararlos con los tejidos normales con mínima manipulación de los tejidos frescos de la sala de operaciones. Hasta la fecha, nuestro laboratorio ha utilizado este protocolo para analizar> 250 BC tejidos frescos (tumorales y NANT),> 35 tejidos normales del seno de las reducciones mamarias. En principio, este protocolo debe ser directamente aplicable a otros tipos de tumores o tejidos; sin embargo, algunos de optimización puede ser necesario (es decir, el programa de disociación mecánica, número de ciclos, el volumen de medios de comunicación, etc.). Para tejidos con baja infiltración de linfocitos, utilizando un fragmento de tejido más grande puede ser necessary, que es lo que hacemos por los tejidos normales, donde el recuento de linfocitos es baja. Alternativamente, se podría añadir una etapa de centrifugación en gradiente de densidad para enriquecer la suspensión de leucocitos. Este análisis de la T y B subpoblaciones de células que infiltran los tumores de mama humanos incluye una evaluación de> 100 marcadores por citometría de flujo (citometría de flujo de datos para 74 marcadores está disponible en los datos suplementarios de Gu-Trantien, et al. 9) y purificación de linfocitos específica subpoblaciones para los análisis inmunológicos y moleculares subsiguientes. Además, hemos evaluado citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos tumorales en el SN tumor primario (en comparación con NANT y SN tejido normal) 10,11 como un reflejo de estos mediadores moleculares en el microambiente tumoral. También hemos probado el efecto de tratar los linfocitos de sangre periférica de donantes sanos con SN tumor y demostrado que muchos de los cambios en la expresión de genes detectados en el TIL pueden ser reproducidos específicamente <sup> 9.
En su microambiente, las células tumorales y estroma están más estrechamente a cabo en la matriz de tejido de las células inmunes, que son característicamente migratoria. El método aquí descrito proporciona un medio sencillo y rápido para aislar y analizar TIL sin digestión enzimática. Nuestros numerosos intentos de este enfoque se unen a la homogeneización mecánica con una breve digestión enzimática para producir células viables y receptor linfoides positivo y epiteliales de la misma fragmento de tumor no han tenido éxito. Homogeneización de tejido libera de manera eficiente los linfocitos pero resulta en una pérdida significativa de la viabilidad de células tumorales. Una breve digestión enzimática del tejido libera las células tumorales viables (los aumentos número total como una función del tiempo de digestión), pero tiene la consecuencia de una disminución paralela de la expresión de muchos receptores de la superficie, particularmente aparentes en los linfocitos. Por lo tanto, para el análisis comparativo de las células tumorales y TIL de la misma tumo todavía es necesario para procesar por separado dos fragmentos de tumor secuenciales.
Actualmente, la mayoría de los estudios diseñados para caracterizar TIL han empleado digestión enzimática (hora a O / N) acoplados con frecuencia con algún tipo de disección mecánica 4-8. La expansión de TIL para su posterior análisis o terapia implica generalmente la posterior cultivo ex vivo de TIL o fragmentos de tejido tumoral con agentes estimulantes (días o semanas) 13-15. El método rápido, no enzimática para la disociación de tejido aquí descrito proporciona un medio simple y reproducible para la extracción de CD45 + células intactas a partir de fragmentos normales y anormales de tejido antes de su expansión o análisis. Esta rápida adquisición de las células CD45 + de pacientes sometidos a tumorectomía posiblemente podría ser desarrollado para su uso en un ensayo de biomarcador de pronóstico. Además, se puede producir TIL con mayor potencial para la expansión ex vivo antes de la adoptivas immunothepia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas fromthe Fondo Belga para la Investigación Científica (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Cáncer del Plan de Bélgica, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson y Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
