Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas

Resumen

Presentamos un método para inducir presión intraocular (PIO) elevada, mediante la inyección de microesferas magnéticas en el ojo de rata, para modelar el glaucoma. Esto conduce a fuertes aumentos de presión y muerte neuronal extensa. Este protocolo es fácil de realizar, no requiere inyecciones repetidas y produce aumentos estables y duraderos de la PIO.

Resumen

El progreso en la comprensión de la fisiopatología y en la provisión de tratamientos novedosos para el glaucoma depende de buenos modelos animales de la enfermedad. Presentamos aquí un protocolo para elevar la presión intraocular (PIO) en rata, mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo. El uso de partículas magnéticas permite al usuario manipular las perlas en el ángulo iridocorneal, proporcionando así un bloqueo muy eficaz del flujo de salida de fluido de la malla trabecular. Esto conduce a aumentos duraderos de la PIO y, finalmente, a la muerte neuronal en la capa de células ganglionares (GCL), así como a la patología del nervio óptico, como se observa en los pacientes con la enfermedad. Este método es fácil de realizar, ya que no requiere maquinaria, habilidades quirúrgicas especializadas ni muchas horas de práctica para perfeccionarlo. Además, las elevaciones de presión son muy robustas y generalmente no se requiere la reinyección de las microesferas magnéticas, a diferencia de otros modelos que usan perlas de plástico. Además, creemos que este método es adecuado para la adaptación al ojo del ratón.

Introducción

El glaucoma primario es una enfermedad ocular devastadora que afecta a aproximadamente 60,5 millones de personas en todo el mundo ^1, que puede conducir a la pérdida de la visión que altera la vida y la ceguera ^2. La investigación sobre los mecanismos de la enfermedad, y el desarrollo de nuevas terapias para el glaucoma, dependen de buenos modelos de la enfermedad que recapitulan algunas de las señas de identidad de la patología.

Presentamos aquí un modelo de glaucoma de rata basado en el método de Samsel et al. ³ El objetivo general de esta técnica es aumentar la presión intraocular (IOP) en el ojo mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior, y el uso de un anillo magnético, directa ellos en el ángulo iridocorneal. Esto impide el flujo del humor acuoso, lo que aumenta la PIO, que conduce a daño neuronal y pérdida de células. El protocolo se desarrolló para intentar proporcionar un modelo más simple, inducible de glaucoma.

Este protocolo puede tener algunas ventajassobre las técnicas existentes. Modelos genéticos de ratón como el DBA / 2J están disponibles, que no requieren procedimientos para iniciar; sin embargo, estos pueden tener un inicio impredecible de progresión de la enfermedad ^4. En contraste, los modelos inducibles, la mayoría de las cuales dependen de la elevación de la PIO quirúrgicamente en roedores, tienen la ventaja de que la iniciación se puede controlar por el usuario. Algunos de estos métodos pueden tener inconvenientes de su propio sin embargo, incluyendo ser técnicamente desafiante ^5, y puede requerir múltiples procedimientos para mantener la PIO elevada ^6.

En contraste, el método inducible se detalla en este manuscrito es una técnica sencilla, eficaz y reproducible que produce estables, fuertes incrementos en la presión, con una necesidad mínima de reinyección. Además, no se trata de un equipo costoso, y sólo requiere de habilidades quirúrgicas básicas para llevar a cabo. Este protocolo puede ser apropiado para los lectores que buscan establecer un inducible técnicamente menos exigentemodelo de glaucoma en su laboratorio.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se han realizado de acuerdo con el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC), y fueron aprobados de acuerdo con las directrices del Reino Unido Home Office ( http://goo.gl/FLkirW , consultado el pasado 10 de ^junio , 2014) y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , consultado el pasado 10 de ^junio, 2014).

1. Hipertensión Ocular Inducción

1. Inducir glaucoma experimental mediante la elevación de la presión intraocular (PIO) a través de la inyección unilateral de microesferas paramagnéticas en la cámara anterior de las ratas Brown Norway, basado en el método de Samsel et al. ³ Otros ratas pigmentadas pueden ser adecuados, aunque éstos tendrían que ser validado primero por el usuario.
2. Casa 250-300 g femeninoratas ex criador Brown Norway en un ambiente con poca luz constante (40-60 lux) para minimizar las fluctuaciones diurnas de la PIO ^7, con el acceso a alimentos y agua ad libitum.
3. Tomar mediciones de la PIO de línea base en animales despiertos ⁸ antes de la anestesia y la inyección del grano, usando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de rata ^9. IOP se toma como la media de cinco lecturas.
4. Anestesiar ratas con 37,5 mg / kg de ketamina, y 0,25 mg / kg de medetomidina clorhidrato entregado por vía intraperitoneal. Confirmar profundidad de la anestesia mediante el ensayo reflejos del pie trasero de animales, antes de la aplicación povidona yodo (véase el paso 1.5), y la inyección de talón (véase el paso 1.8). Administrar 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia.
   NOTA: No dilatar la pupila en cualquier etapa. Esto ayudará a que las perlas se asientan mejor en el ángulo iridocorneal, y evitar la unión a la lente. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea en el ojo contralateral no operado.
5. Wcenizas del ojo operativa con 5% de yodo povidona en agua ¹⁰ 5 min antes de la inyección.
6. Después de 5 min, Wick la povidona yodada fuera usando una gasa estéril, y lavar el ojo con solución salina estéril al 0,9%. Mantenga el ojo húmedo durante la anestesia con la aplicación regular de solución salina estéril.
7. Coloque un imán toroidal alrededor del ojo.
8. Inyectar 25 l de una solución que contiene 30 mg / ml de irradiación gamma esterilizado 8 micras microesferas magnéticas en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en la cámara anterior, utilizando una aguja biselada 33 G.
   1. Para preparar perlas, lavar por la re-suspensión, centrifugando a continuación 3 veces a 10.000 xg durante 5 min con 1 ml de HBSS, antes de hacer el / ml solución 30 mg final. Mantener condiciones estériles en todo.
   2. Para la inyección, tener cuidado de evitar la inserción de la aguja para el iris, para minimizar el riesgo de trauma iris. Esto se puede prevenir orientando la aguja tangencial a la superficie de la córnea, como paralelo ael iris como sea posible. Esto también ayudará a minimizar la pérdida de talón desde el sitio de inyección.
      NOTA: Inyectar cuentas a un ritmo rápido para asegurar una distribución uniforme en todo el ángulo iridocorneal, que es fundamental para elevar la PIO. Además, los granos de tiendas, agujas y anillos magnéticos por separado de modo que las perlas no forman agrupaciones, haciéndolos difíciles de cargar en la jeringa e inyectar, y la aguja no se magnetizan.
9. Deje la aguja en su lugar durante 1 min después de la inyección para asegurar que los granos se depositan en el ángulo iridocorneal para impedir el drenaje acuoso de la malla trabecular. Ligeramente ángulo de la aguja después de las cuentas se han establecido inicialmente para permitir cierta fuga de acuoso, para minimizar los aumentos transitorios de la presión intraocular. Al final de la cirugía limpiar la aguja a través con la primera salina tamponada con fosfato (PBS), luego etanol al 70%, seguido de agua destilada, para asegurar el uso continuado de la aguja en procedimientos separados. Alternativamente, se podría usaragujas desechables si la combinación correcta de calibre y una jeringa está disponible. Opcional: agujas pueden ser afiladas utilizando un beveller para prolongar su uso.
10. En esta etapa, si es necesario, retire el imán, y lo utilizan para sacar cuentas en áreas de cobertura incompleta.
11. Deje el imán en su lugar alrededor de los ojos para un 10 minutos después de la inyección de más para garantizar los granos se asientan bien en el ángulo iridocorneal.
12. Anestesia inversa utilizando 0,25 mg / kg atipemezole clorhidrato.
13. Administrar cloranfenicol, u otro ungüento antibiótico, por ejemplo gentamicina o terramicina por vía tópica para prevenir la infección, y 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia. Deje a los animales para recuperar en una estera de calor hasta que recuperar el movimiento, a continuación, transferir a una caja caliente y de suministro con la nutrición adicional, tal como un suplemento alimenticio o dieta regular humedecido hasta que la recuperación es completa. Analgesia sistémica o local se debe dar a los animales que presenten signos de dolor de 24 horas después de la cirugía. Si thessíntomas e persisten a pesar del tratamiento, los animales deben ser sacrificados humanitariamente.
14. Utilice el ojo contralateral como control no operado.
15. Tomar mediciones de la PIO cada 2-3 días después de la administración de perlas, y cada 2-3 días a partir de entonces utilizando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de la rata ^9.
16. Los criterios para la inclusión de los ojos en los estudios pueden ser: si 1) la PIO se eleva por encima de la presión de control contralateral por 5 mmHg, y 2) no excederá de 60 mmHg.
17. Ojos, donde la presión vuelve a la línea de base (generalmente por 1 semana después de la inyección) no deben ser incluidos en los estudios, sin embargo, es posible volver a inyectar los granos en los ojos que no logran desarrollar una PIO elevada si se desea.
18. La eutanasia a los animales por asfixia de CO ₂ al final del experimento.
19. Diseccionar los ojos y los nervios ópticos, y fijar en el 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche para su posterior análisis histológico.

2. Evaluación de la retina Neurona daños Usando TUNEL STaining

1. Para cuantificar las células apoptóticas en todo el montaje retinasuse el ensayo de deoxinucleotidil transferasa terminal mediada por dUTP nick-etiquetado (TUNEL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Diseccionar la retina de la copa para el ojo, para lavar 3 x 5 min en 0,3% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS-T).
3. Permeabilizar el tejido en 3% T-PBS durante 2 hr.
4. Pre-equilibrar retinas en tampón de equilibrio durante 10 min, antes de la incubación en solución de reacción TUNEL durante 1 hora a 37 ° C.
5. Lave el tejido durante 3 x 5 min en 0,3% T-PBS, enjuague en 0,3% T-PBS que contenía 5 mM DAPI y montaje plana en los medios de montaje.
6. Para cuantificar los núcleos TUNEL positivas utilizan un microscopio confocal de tomar 10 micras z-pilas a través de la capa de células ganglionares de 20 aumentos. Tomar 3 imágenes en cada uno de los 4 pétalos, en sitios cercanos al nervio óptico, en la periferia media, y en la lejana periferia de la retina, dando un total de 12 imágenes por toda mount, el muestreo de aproximadamente 7.000 células. Criterios morfológicos discriminados células no neuronales (endotelial y glial) de las células neuronales.
7. Seleccione las áreas de imagen utilizando sólo el canal DAPI, y los investigadores de la máscara a los grupos de tratamiento.

3. La evaluación de daño del nervio óptico Usando azul de toluidina tinción

1. Fijar nervios ópticos durante la noche en solución de Karnovsky a 4 ° C.
2. Tratar las muestras durante 2 horas en 1% (w / v) de tetróxido de osmio y luego deshidratar en etanol al 100%.
3. Incubar nervios ópticos en óxido de propileno durante 30 minutos, y el lugar en una mezcla 50:50 de óxido de propileno: durante la noche araldite.
4. Cambie esta solución a 100% araldite, seguido de incubación durante la noche a 60 ° C.
5. Cortar semifinas secciones (0,75 mm de espesor) y mancha con 1% de azul de toluidina / bórax (TB) en etanol al 50% antes del examen con el microscopio óptico.

4. Análisis estadístico

1. Realizar ana estadísticalyses usando un paquete de software estadístico apropiado. Un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Newman-Keul se puede utilizar para calcular la significación estadística para la PIO cambia con el tiempo.
2. Un valor de p menor de 0.05 puede ser considerado significativo.

Resultados

La inyección de perlas magnéticas en el ángulo iridocorneal indujo consistentemente un aumento prolongado y robusto de la presión (Figura 1), que fue fácilmente observable en el primer punto de tiempo, 3 días después de la inyección. Además, el aumento de la presión se mantuvo durante toda la duración del experimento, y aunque nuestro curso de tiempo terminó a los 18 días después de la inyección, otros han informado de que la presión persiste a largo plazo ^3. La PIO media promediada sobre la longitud total del experimento de control, los ojos inyectados de no-grano fue de 19,7 ± 0,3 mmHg, en comparación con 40,5 ± 2,8 mmHg para los ojos de perlas con inyección (P <0,001). Además, el pico IOP aumentó de 22,8 ± 0,3 mmHg a 49,9 ± 2,3 mmHg.

Para determinar si la elevación de la PIO conduce a la muerte de las células ganglionares de la retina, se realizó la tinción de TUNEL en retinas, y la histología en secciones transversales del nervio óptico (Figura 2). En la retina se observó un aumento en la tinción de TUNEL (Figura 2A) en los ojos de talón-inyectados con PIO elevada. El número de núcleos apoptóticos aumentó aproximadamente 15 veces, de 1,6 ± 0,5 células en los controles contralaterales, a 24,5 ± 0,5 células en retinas hipertensos (Figura 2B; p <0,05). Además, en ojos en los que se inyectaron perlas magnéticas pero la presión no aumentaron (probablemente debido a la obstrucción incompleta del ángulo iridocorneal), el número de células TUNEL positivas no fueron significativamente diferentes de los de los controles no inyectados (P> 0,05). Esto sugiere que la muerte celular se relacionó con la presión aumenta, no debido a la toxicidad directa de las microesferas magnéticas. Finalmente, se investigó la patología del nervio óptico en el modelo de glaucoma, y vimos acumulación de azul de toluidina en muchos de los axones, lo que indica la degeneración de estos procesos celulares (Figura 2C).

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Figura 1. Elevación de la presión intraocular utilizando microesferas magnéticas. La inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior indujo un aumento robusto, significativa en la presión intraocular (IOP) en comparación con el control contralateral, los ojos no inyectados. Unidades del eje Y = milímetros de mercurio (mmHg). Datos = media ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Esta cifra se ha modificado desde Foxton y otros, Am.. . J. Pathol 182 (4): 1379-1390.

Figura 2. La elevación de la PIO mediante la inyección de microesferas magnéticas en el ángulo iridocorneal, inducida por la muerte neuronal en la capa de células ganglionares (GCL). (A) Imágenes representativas de retinas de control (izquierda) y glaucoma (derecha) ojos teñidos para núcleos apoptóticos por TUNEL (verde;flechas blancas) y DAPI (azul), indicando el número de núcleos apoptóticos aumentó a medida que aumentó la PIO. (B) Cuantificación de las células TUNEL positivas en la GCL, que muestran que los ojos con PIO elevada (en el centro), tenían significativamente más células apoptóticas en comparación con control (izquierda). En contraste, en los ojos de talón inyectado donde la presión no se levantó (derecha), no se observó ningún aumento significativo en la tinción de TUNEL. Datos = media ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) Imágenes representativas de tinción nervio óptico, lo que demuestra un aumento en la acumulación de azul de toluidina (flechas negras) en los axones dañados por el glaucoma (derecha), pero no tiene control ojos (izquierda).. Las barras de escala = 50 m. Esta cifra ha sido modificado desde Foxton et al., Am. . J. Pathol 182 (4): 1379-1390.

Discusión

Aquí se demuestra un método para inducir la PIO elevada en la rata, mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo. Este método es fácil de llevar a cabo, y requiere poca experiencia quirúrgica, o las horas de práctica y refinamiento. Además, el procedimiento es eficaz; rara vez se requiere más que una sola inyección de perlas para inducir una fuerte subida, robusto en presión (aproximadamente el 10% de tasa de reinyección). Esto puede proporcionar una ventaja sobre los métodos inducibles existentes, como la vena episceral técnicamente difícil esclerosis ¹¹ modelo, o protocolo de la fotocoagulación con láser ^6, que puede requerir múltiples procedimientos para mantener planteadas PIO.

Para que el método para tener éxito sin embargo, hay algunos pequeños pasos críticos que necesitan ser tomadas. En primer lugar, es útil utilizar un imán de forma toroidal para dibujar perlas en el ángulo iridocorneal. Este paso es una modificación del protocolo original, where las perlas se inyectan en la cámara anterior, y luego se trasladó a mano alzada alrededor del ojo ^3. Usando un imán toroidal significa que las microesferas deben instalarse de manera uniforme en todo el ángulo, lo que requiere la redistribución manual mínima. En segundo lugar, la tasa de inyección debe ser rápido - demasiado lento y las perlas se acumulará predominantemente en un lado del ángulo, dando lugar a una cobertura incompleta, y potencialmente no aumento de presión. En términos generales, sin embargo, el método es lo suficientemente sencillo que el usuario podría fácilmente hacer modificaciones en el protocolo, tales como variando el tamaño o el volumen de las partículas de microesferas, tal vez para intentar alterar el grado de la elevación de la PIO.

Sin embargo, un inconveniente potencial del método es que uno tiene poco control sobre la extensión de la hipertensión, que en aproximadamente el 5-10% de los casos se observó subió por encima de 60 mmHg. Alzas excesivas en la PIO puede ser muy destructivo para los tejidos de la retina, y pueden hacer que el estudio de los mecanismos y biología de la muerte celular desafiante. Sin embargo, el método produce una patología neuronal consistente, tanto en la retina y del nervio óptico, que puede ser manipulado farmacológicamente ^12. Esto puede hacer que el modelo atractivo para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del glaucoma. Además, debido a que las perlas se dirigen en el ángulo iridocorneal, esto deja el eje visual libre para imágenes en vivo de la retina o de disco óptico. Anticipamos que este modelo será adaptado y utilizado para futuras aplicaciones en otras especies, incluyendo ratón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
250 - 300 g Ratas hembras marrones noruegas ex reproductoras	Harlan UK	203
Tonolab Tonómetro de rebote	Tiolat	TV02
Ketaset (ketamina)	Fort Dodge Salud animal	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (clorhidrato de medetomidina)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Povidona yodada	Ecolab	BN4369LE10	5% en H2O
Solución salina de Minim	Bausch and Lomb	PL00033/5017
Imán toroidal	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microesferas magnéticas	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G aguja biselada	Hamilton	7747-01	Aguja personalizada
Jeringa de punta Luer Hamilton		80601
Antisedán (clorhidrato de atipemezol )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Pomada de cloranfenicol	Medicom	18956-0005
TUNEL kit de tinción	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield medios de montaje	Vector Labs	H-1000