Artículo de método

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 de noviembre de 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

En este artículo

Resumen

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Describimos un ensayo colorimétrico cuantitativo simple que mide específicamente la actividad proteolítica de Granzima B (GzmB) humana, de ratón o de rata. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para determinar la actividad proteasa de otras proteasas de serina en gránulos mediante la hidrólisis de otros sustratos peptídicos sintéticos con una secuencia de reconocimiento adecuada.

Resumen

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La serina proteasa Granzyme B (GzmB) media la apoptosis de las células diana cuando es liberada por los linfocitos T citotóxicos (CTL) o las células asesinas naturales (NK). La GzmB es la granzima más estudiada en humanos y ratones, por lo que los investigadores necesitan herramientas específicas y fiables para estudiar su función y papel en la fisiopatología. Esto requiere especialmente ensayos que no reconozcan proteasas como caspasas u otras granzimas que estén estructural o funcionalmente relacionadas. Aquí, aplicamos la preferencia de GzmB por la escisión después de los residuos de ácido aspártico en un ensayo colorimétrico utilizando el péptido tioéster Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. La GzmB es la única serina proteasa de mamíferos capaz de escindir este sustrato. El sustrato es escindido con una eficiencia similar por el GzmB humano, de ratón y de rata, una propiedad que no comparten otros sustratos de péptidos disponibles comercialmente, incluso algunos que se anuncian como adecuados para este propósito. Este protocolo se demuestra utilizando lisados no fraccionados de células NK activadas o CTL y también es adecuado para proteasas recombinantes generadas en una variedad de sistemas procariotas y eucariotas, siempre que se utilicen los controles correctos. Este ensayo es un método altamente específico para determinar la actividad proapoptótica potencial de las moléculas citotóxicas en los linfocitos de mamíferos y de sus contrapartes recombinantes expresadas por una variedad de metodologías.

Introducción

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Granzimas son una familia de serina proteasas que se encuentran en los lisosomas secretores de las células (NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 1 asesino natural. Existen cinco granzimas diferentes en los seres humanos (A, B, H, K y M), y diez en ratones (A - G, K, M y N) 2,3. Granzima A y granzima B (GzmA, GzmB) son las más abundantes y han sido investigadas extensamente en el ambiente humano y de roedor.

La función clásica de GzmB es la inducción de apoptosis en las células diana ejecutados en conjunción con la proteína de perforina de formación de poros, que permite la granzima para acceder al citosol de la célula diana 4. Aunque la expresión GzmB se encuentra de manera inequívoca en los linfocitos citotóxicos, estudios recientes se han ocupado de una variedad de otros tipos de células que expresan GzmB, incluyendo pero no limitado a los queratinocitos 5, 6 basófilos, mastocitos, células dendríticas 7 plasmacitoides 8, 9 y las células B, 10.En este contexto, las funciones GzmB no apoptóticas fueron revelados desde la participación en los procesos inflamatorios, la remodelación de tejidos y otras propiedades inmunorreguladoras 11-14.

Dado que un papel biológico más amplio se ha propuesto para GzmB lo que se sospechaba previamente, los investigadores necesitan herramientas fiables y específicos para su detección. De la ventaja es requisito específico de GzmB para escindir en el lado carboxilo de residuos de ácido aspártico, una propiedad única entre serina proteasas eucariotas 15. Ratón, humano y de rata GzmB son estructuralmente muy similares, sin embargo, la especificidad de sustrato prolongado de GzmB ratón difiere sutilmente de que tanto de humano y de rata 16, lo que significa que ciertos sustratos genéricos con Asp en la terminal (P1) se pueden escindir eficientemente por GzmB de las tres especies, mientras que otros sustratos con secuencias más complicadas aguas arriba de P1 puede dar resultados muy variables. Tanto en el pasado y li más recienteterature, este hecho ha causado gran confusión y mala interpretación de la importancia biológica de algunos resultados experimentales, aunque cuidadosamente controlado, estudios cinéticos han tratado de corregir la situación 17.

En este trabajo hemos tratado de ilustrar estos puntos usando dos sustratos disponibles en el mercado, a saber, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl y N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Los dos reactivos hacer generar diferentes grupos reactivos después de la escisión (un sulfhidrilo libre versus un paranitroanilida libre fluorescente), pero esto no tiene efecto alguno sobre la escisión proteolítica. El protocolo descrito es una adaptación moderna de un protocolo muy antiguo 18, pero debería ayudar a los investigadores a utilizar los diferentes sustratos GzmB adecuadamente, mientras que también proporciona un marco metodológico para la detección de la actividad de otros granzimas, como GzmA y GzmH.

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Protocolo

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NOTA: Los bazos fueron derivadas de ratones (6-10 semanas de edad) y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Ética Animal del Centro de Cáncer Peter MacCallum (E486).

1. Preparación de las muestras.

  1. Preparación de células de ratón NK activadas.
    1. Aislar las células NK ingenuos primarias a partir de suspensiones de una sola célula de bazo de C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) ratones por selección negativa utilizando kits disponibles en el mercado.
    2. Siga el protocolo de los fabricantes. Brevemente, magnéticamente marcar las células NK "no", tales como las células T y B, células dendríticas, granulocitos, macrófagos, y células rojas de la sangre utilizando anticuerpos conjugados con biotina contra sus marcadores de superficie específicos. Utilice separación magnética con cuentas anti-biotina para agotar las células NK "no".
    3. Aislado Cultura células NK durante 5-7 días en medio que contenía IL-2 (1000 U / ml) a 700,000 células / ml en placas de 24 pocillosa 37   ° C.
    4. Alternativamente, el uso de células T activadas 19, CTL restringido el antígeno principal de OT1 receptor de células T de ratones transgénicos 20, CTL generados en cultivos mixtos de linfocitos 21, o los sobrenadantes de las células NK activadas para determinar la actividad de secretada GzmB 19.
  2. Mantenimiento de la línea humana de células NK y el aislamiento de células primarias NK.
    1. Mantener la leucemia NK humana (células YT) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Alternativamente, purificar células NK primarias de la sangre periférica de sujetos sanos y estimular durante 2-3 días en medio que contiene IL-2 a 100 U / ml como se ha descrito previamente 22.
  3. Generación de lisados ​​celulares.
    1. Lavar las células tres veces en PBS (pH 7,4), a continuación, suspender en Nonidet P-40 tampón de lisis (0,1% NP-40, NaCl 250 mM, 25 mM Hepes, EDTA 2,5 mM). Idealmente, la lisis de un mínimo de 5 x 10 6 células NK, o 1 x 10 7 células T en 100 l de tampón. No añadir inhibidores de la proteasa, ya que muchos son inhibidores irreversibles de proteasas de serina, y en triptasas particulares como GzmA. Incubar en hielo durante 20 min, y luego sedimentar los núcleos en una microcentrífuga a 15.000 xg durante 10 min. Desechar el pellet nuclear y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  4. Determinar la concentración de proteína de los lisados.
    1. Use un protocolo disponible comercialmente de elección tales como, Bradford o ácido bicinconínico (BCA) y determinar la concentración de proteínas. Asegúrese de que la concentración es de ~ 2 mg mínimo / ml. Lisados ​​almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario (actividad granzima es estable durante muchos meses a -20 ° C).

2. granzima B Ensayo de la actividad

  1. Preparación de los reactivos
    1. Preparar una mM balance de los sustratos (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-PNA) 10 en DMSO (~ 5 mg / ml) y almacenar en alícuotas a -20 & #176; C. Prepare una dilución de trabajo recién y desechar después de cada día, como Boc-AAD-S-Bzl hidroliza parcialmente en el almacenamiento en DMSO.
    2. Preparar una población de 250 mM de reactivo colorimétrico (5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico), DTNB) en DMSO (0,09 g / ml) y se almacena a -20 ° C. Prepare una dilución de trabajo nueva cada día. Este reactivo sólo se requiere para sustratos con grupos indicadores SBzl, no ANP.
    3. Invente tampón fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) cada 2-3 semanas.
  2. Llevar DTNB y sustratos sintéticos a temperatura ambiente. Diluir sustratos (1:16, por ejemplo, 100 l en 1,6 ml de tampón) y DTNB (1: 250, por ejemplo, 10 l en tampón 2,5 ml) y mezclar bien.
  3. Diluir un mínimo de 100 g de proteína de lisado de cada muestra en un tampón a un volumen final de 160 microlitros. Usando una pipeta multicanal añadir 50 l por pocillo por triplicado (~ 33,3 g / pocillo) en una '' U '' de vinilo del fondo placa de 96 pocillos.Incluir un "búfer de sólo" control (también por triplicado).
  4. Añadir 100 l de diluirse DTNB para el control de muestras / tampón (omita este paso cuando se trabaja con Ac-IEPD-pNA.
    NOTA: La escisión de Ac-IEPD-pNA por GzmB libera directamente fluorogénica pNA (Figura 4B).
  5. Utilizar una pipeta multicanal para añadir rápidamente 50 l de sustratos diluidas a cada conjunto de triplicados, empezando con el tampón entonces cualquier controles negativos y terminando con muestras positivas esperados.
  6. Colocar la placa en el lector de placas. Medir la actividad Asp-asa por hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA en un lector de microplacas a OD 405 nm. Utilice un protocolo de ensayo cinético, tomar 25 lecturas, cada 15 segundos (aprox 6 min tiempo de lectura total).
  7. Use las lecturas de absorbancia generadas en cada punto de tiempo para calcular manualmente la tasa de escisión de sustrato de si el software del lector de placas no puede generar un valor de Vmax.

3. Análisis de Data

NOTA: Los datos generados se presenta como velocidad máxima, que se define como el cambio de OD en el tiempo (mod / min).

  1. Para analizar los datos, determinar la tasa máxima de escisión de sustrato, que se calcula a partir de la tasa de cambio en la absorbancia. Hacer esto automáticamente con el software lector de placas, que normalmente tiene esta opción.
  2. Alternativamente después de ver las parcelas cinéticos de cambio en la absorbancia, que se generan durante el ensayo cinético en el lector de placas, seleccionar manualmente los puntos de datos que dan a la línea recta más empinada. Para la mayoría de los ensayos se consigue la tasa máxima dentro de la primera 2 min del ensayo.
  3. Restar la lectura OD inicial a partir de la lectura más alta OD en esta línea recta y se dividen por el intervalo de tiempo. Transferir datos brutos a Microsoft Excel / Gráfico almohadilla para el análisis estadístico y gráfico.

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Resultados

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El sustrato Boc-AAD-S-Bzl es específico para GzmB

El GzmB serina proteasa es un constituyente principal de los linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) y es predominantemente responsable de inducir la rápida muerte apoptótica en las células diana, tales como células infectadas por virus o transformadas. Esto es en gran parte debido a su preferencia de sustrato para la escisión después de ciertos residuos de aspartato específicos en las proteínas seleccionadas, un atributo c...

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Discusión

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Históricamente las granzimas fueron identificados como moléculas efectoras clave de linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) capaces de inducir una muerte apoptótica rápida en las células diana. Esto se debió principalmente a la acción de GzmB, que escinde moléculas de sustrato diana a aspartato (D) los residuos y por lo tanto fue capaz de activar la cascada de caspasas por ambas escisión pro-caspasas, así como varios de sus objetivos de abajo. Sin embargo, ahora se aprecia que la expresión GzmB no se limita a las célu...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo recibió apoyo a través de la subvención HA 6136/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) a MH. JAT cuenta con el apoyo de subvenciones para programas y proyectos del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Sustrato Granzyme B (ratón y humano)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009Sustrato Granzyme B (solo humano)
N-α-CBZ-L-lisina-S-BzlSigma-AldrichC3647Sustrato Granzyme A
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Sustrato Granzyme H
5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Reactivo
Kit de aislamiento de células NK II ratónMiltenyi Biotec GmbH130-096-892kit de selección de
negativos kit de aislamiento de células NK humanoMiltenyi Biotec GmbH130-092-657 kit deselección de negativos
Lector de placasBiorad iMarkBiorad Microplate Manager versión del software MPM6.3
Serocluster Vinilo con fondo en U Placa de 96 pocillosCorning, MA, EE. UU2797
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Referencias

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