Medir la barrera a la transmisión entre especies de enfermedades priónicas es un desafío y generalmente implica desafíos con animales o ensayos bioquímicos. Aquí, presentamos un ensayo de conversión de proteínas priónicas in vitro con la capacidad de predecir barreras de especies.
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Artículo de método
La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un
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Resumen
Resumen
Los estudios para comprender la transmisión entre especies de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades priónicas) son desafiantes en el sentido de que generalmente se basan en estudios de desafío in vivo en animales largos y costosos. Se han desarrollado una serie de ensayos in vitro para ayudar a medir las barreras de las especies de priones, reduciendo así el uso de animales y proporcionando resultados más rápidos que los bioensayos animales. Aquí, presentamos el protocolo para un ensayo rápido de conversión de priones in vitro llamado ensayo de relación de eficiencia de conversión (CER). En este ensayo, la proteína priónica celular (PrPC) de un cerebro huésped no infectado se desnaturaliza a pH 7,4 y 3,5 para producir dos sustratos. Cuando el sustrato de pH 7.4 se incuba con el agente TSE, la cantidad de PrPC que se convierte en un estado resistente a la proteinasa K (PK) es modulada por la barrera de la especie del huésped original al agente TSE. Por el contrario, la PrPC en el sustrato de pH 3,5 se pliega incorrectamente por cualquier agente TSE. Al comparar la cantidad de proteína priónica resistente a PK en los dos sustratos, se puede hacer una evaluación de la barrera de especies del huésped. Demostramos que el ensayo CER predice correctamente las barreras de especies de priones conocidas de los ratones de laboratorio y, como ejemplo, mostramos algunos resultados preliminares que sugieren que los gatos monteses (Lynx rufus) pueden ser susceptibles al agente de la enfermedad de desgaste crónico del ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus).
Introducción
Encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades de priones) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales con periodos de incubación prolongados que afectan a una variedad de animales y seres humanos. El agente etiológico putativo de las EET se compone de un isómero mal plegada de la proteína priónica host (PrP) que es capaz de auto-propagación por conversión basado en plantillas de la forma celular normal de PrP (PrP C) en una, asociada a la enfermedad infecciosa forma (PrP TSE) que se acumula en los tejidos del sistema nervioso central del huésped infectado 1. Priones mamíferos infecciosas en general transmit....
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Protocolo
Trabajo Animal realizado en el Centro Nacional de Salud de la fauna de USGS fue realizado de acuerdo con la Oficina de NIH de directrices Laboratorio Animal Welfare y bajo cuidado de los animales institucional y el empleo protocolo # EP080716. Los tejidos de animales cazadores-cosechada fueron regalos de la Wisconsin o Michigan Departamentos de Recursos Naturales.
1. Preparación de la solución
NOTA: Las soluciones que se indican a continuación son necesarios para la preparación del sustrato de ensayo CER en la Sección 2 a continuación. Preparar cada una de estas soluciones de soluciones de conce....
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Resultados
El uso exitoso del ensayo CER es dependiente en gran medida de la calidad de los pares de sustrato utilizado en reacciones de conversión. Por esta razón, siguiendo los procedimientos para preparar pares sustrato CER, un inmunoblot de control de calidad debe llevarse a cabo (Figura 2). Para ambos sustratos, ensayo de 10-25 l por inmunotransferencia. PrP C debe ser fácilmente detectable en cada sustrato y los niveles de PrP C debe ser aproximadamente la misma entre los dos. Inmunorea.......
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Discusión
Para completar con éxito de este protocolo, se debe prestar atención a los niveles de PrP C en el tejido cerebral infectado utilizado para la preparación del sustrato (paso 2.1.2) y la semilla al sustrato ratio para reacciones de conversión (paso 4.4.2). En nuestra experiencia, los cerebros pueden ser extraídos para su uso como sustrato CER luego de un período sustancial post-mortem, siempre que la PrP C está presente por inmunotransferencia (Figura 4). De hecho, algunos autolisis .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien y Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturales de Michigan) y al Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Salud de la Vida Silvestre del USGS) por su ayuda con la adquisición de tejidos. También agradecemos al Laboratorio Estatal de Higiene de Wisconsin por los servicios de pruebas diagnósticas, y a la Dra. Tonie Rocke y su personal (Centro Nacional de Salud de Vida Silvestre del USGS) por el uso del equipo. Cualquier uso de nombres comerciales, de productos o de empresas es solo para fines descriptivos y no implica la aprobación por parte del Gobierno de los EE. UU....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 12% Bis-Tris Geles SDS-PAGE | Life Technologies | NP0342 | |
| 0,5 mm Perlas de óxido de circonio | Siguiente Avance | ZROB05 | Otras variedades de perlas también son efectivas |
| Anticuerpos | varios proveedores | Seleccione los anticuerpos primarios y secundarios apropiados para la detección de inmunotransferencia de PrPres de especies de interés | |
| Homogeneizador | de perlasSiguiente Avance | Centrífuga BBY24M | |
| Beckman | Coulter | 369434 | Alta velocidad con control |
| de temperatura Tubos cónicos | de cualquier marca | ||
| Aplicador con punta de algodón | Uline | S-18991 | |
| Sonicator Cuphorn | Sistemas de calor-Ultrasonidos | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. ahora es Qsonica, LLC |
| Densitometría programa de software | UVP | Vision Works LS Software de adquisición y análisis de imágenes | Otros programas, como NIH ImageJ, también funcionarán |
| Homogeneizador de onzas | Kimble Chase | 885300 | |
| Mezclador de extremo a extremo | Labnet International | H5600 | |
| Ácido etilendiaminotetra acético | Boston Bioproducts | P-770 | Producto químico peligroso: irritación ocular |
| Clorhidrato de guanidina, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos |
| Bloque calefactor | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Ácido clorhídrico | Sigma-Aldrich | 435570 | Producto químico peligroso: ácido fuerte |
| Tampón de muestra de dodecilo sulfato de litio, 4x | Life Technologies | NP0008 | Producto químico peligroso: piel & irritación respiratoria, daño ocular grave, sólido inflamable |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda, líquido inflamable |
| Tubos de microcentrífuga | cualquier marca | ||
| Minicentrífuga | Labnet International | C1301 | |
| N-laurol-sarcosina (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Producto químico peligroso: irritación de la piel, daño ocular |
| Sistema de gel SDS-PAGE | Sistema | electroforesis Life | NuPAGE Otros sistemas SDS-PAGE también funcionarán |
| Tubos de PCR (de baja fijación) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Homogeneizador | de morteroFisher Scientific | 03-392-106 | |
| Medidor de pH | Sentron | SI600 | |
| Membrana de polivinildifluoruro | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinasa K | Promega | V3021 | Producto químico peligroso: irritación de la piel y los ojos, sensibilización respiratoria, toxicidad orgánica |
| Agente reductor para muestras SDS-PAGE, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda |
| Dodecil sulfato de sodio | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular, sólido inflamable |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | S5881 | Producto químico peligroso; base fuerte |
| Jeringa | BD Biosciences | Varios | Uso Tamaño de jeringa adecuado a los volúmenes de sustrato a homogeneizar |
| Agujas de jeringa | BD Biosciences | varios | |
| Thermoshaker (agitador de tubos de PCR) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Producto químico peligroso: irritación de la piel, los ojos, las vías respiratorias |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación ocular |
| Vórtice | Fisher Científico | 12-812 |
Referencias
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expre....
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Reimpresiones y permisos
