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Artículo de método

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un

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DOI:

10.3791/52522

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10 de marzo de 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

En este artículo

Resumen

Medir la barrera a la transmisión entre especies de enfermedades priónicas es un desafío y generalmente implica desafíos con animales o ensayos bioquímicos. Aquí, presentamos un ensayo de conversión de proteínas priónicas in vitro con la capacidad de predecir barreras de especies.

Resumen

Los estudios para comprender la transmisión entre especies de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades priónicas) son desafiantes en el sentido de que generalmente se basan en estudios de desafío in vivo en animales largos y costosos. Se han desarrollado una serie de ensayos in vitro para ayudar a medir las barreras de las especies de priones, reduciendo así el uso de animales y proporcionando resultados más rápidos que los bioensayos animales. Aquí, presentamos el protocolo para un ensayo rápido de conversión de priones in vitro llamado ensayo de relación de eficiencia de conversión (CER). En este ensayo, la proteína priónica celular (PrPC) de un cerebro huésped no infectado se desnaturaliza a pH 7,4 y 3,5 para producir dos sustratos. Cuando el sustrato de pH 7.4 se incuba con el agente TSE, la cantidad de PrPC que se convierte en un estado resistente a la proteinasa K (PK) es modulada por la barrera de la especie del huésped original al agente TSE. Por el contrario, la PrPC en el sustrato de pH 3,5 se pliega incorrectamente por cualquier agente TSE. Al comparar la cantidad de proteína priónica resistente a PK en los dos sustratos, se puede hacer una evaluación de la barrera de especies del huésped. Demostramos que el ensayo CER predice correctamente las barreras de especies de priones conocidas de los ratones de laboratorio y, como ejemplo, mostramos algunos resultados preliminares que sugieren que los gatos monteses (Lynx rufus) pueden ser susceptibles al agente de la enfermedad de desgaste crónico del ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus).

Introducción

Encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades de priones) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales con periodos de incubación prolongados que afectan a una variedad de animales y seres humanos. El agente etiológico putativo de las EET se compone de un isómero mal plegada de la proteína priónica host (PrP) que es capaz de auto-propagación por conversión basado en plantillas de la forma celular normal de PrP (PrP C) en una, asociada a la enfermedad infecciosa forma (PrP TSE) que se acumula en los tejidos del sistema nervioso central del huésped infectado 1. Priones mamíferos infecciosas en general transmiten desde el host-a-host de una manera específica de la especie, lo que ha dado lugar al concepto de la "barrera de las especies TSE" limitar los eventos de transmisión entre especies 2. Los determinantes biológicos de la barrera de especies prión no se comprenden bien. Secuencia de aminoácidos similitud entre la infecciosa PrP TSE y el anfitrión PrP C cUna influencia fuertemente si la conversión tiene lugar 3-5, pero sigue siendo insuficiente para explicar todos los eventos de transmisión de priones observados in vivo 6,7.

Por lo tanto, la caracterización de las barreras de especies de EET se ha basado en gran medida en estudios de desafío de los animales: la exposición de los animales no tratados previamente de una especie dada a los priones de otro y midiendo el tiempo de incubación resultante de la aparición de la enfermedad y la tasa de ataque como indicadores de la eficacia de la transmisión. Los ratones que expresan PrP C a partir de especies heterólogas también se utilizan para este tipo de estudio 8. Los costos asociados a la producción de ratones transgénicos y bioensayos priónicas prolongadas, así como las consideraciones éticas del uso de los animales, son obstáculos para la investigación experimental de la EET barreras entre especies. Evaluación de la barrera de la especie humana a las EET se basa en ratones modificados para expresar humana PrP C. Estos ratones requieren largos períodos de incubación a sucumbir a las EET o modificaciones a T humanosél molécula PrP C humana de inicio rápido de la enfermedad 9. Los períodos de incubación de las EET no humana en estos ratones pueden extenderse más allá de la vida útil normal de ratón haciendo la interpretación de los resultados negativos desafiantes. Los primates no humanos también han sido utilizados como indicadores para el estudio de las barreras entre especies humanas, pero estos estudios están llenos de los mismos desafíos que otros tipos de experimentación con animales y primates no humanos pueden no recapitular precisamente la enfermedad a medida que avanza en el huésped humano.

Bioensayos animales siguen siendo el método "estándar de oro" para medir la susceptibilidad de una especie a dicha enfermedad, pero los obstáculos, los costos y la ética de estos estudios en animales vivos han obligado investigación sobre alternativas. Un número de ensayos in vitro, basados ​​en la evaluación de la conversión de PrP C anfitrión a una proteinasa K (PK) estado resistentes (PrPres) cuando se sembró por PrP TSE, se han desarrollado y utilizado para investigar TSE spECIES barreras 10-12. Ejemplos de ensayos in vitro incluyen ensayos libres de células de conversión, la proteína misfolding amplificación cíclica (EPCP), y el ratio de eficiencia de conversión (CER) ensayo de 10-14. Aunque ninguno de estos ensayos tienen en cuenta los factores periféricos que intervienen en las barreras de especies después de la infección natural, todo puede ser útil para identificar hosts potencialmente susceptibles para las EET.

Aquí presentamos el protocolo para el ensayo CER, en el que dos desnaturalizados sustratos PrP C derivadas de homogeneizados cerebrales normales se utilizan en las principales reacciones de conversión del prión de banco (Figura 1) 13. PrP C en el sustrato desnaturalizado a pH 7,4 sólo se puede convertir en PrPres por PrP TSE se sembraron en la reacción en ausencia de una barrera de las especies 14. En contraste, la desnaturalización de PrP C en el otro sustrato a pH 3,5 permite que se convierte en PrP res después de la incubacióncon PrP TSE de cualquier especie y sirve como un control para la conversión. La relación de conversión de PrP C a PrP res en pH 7.4 sustrato con relación a la del sustrato pH 3.5 proporciona una medida de la barrera de especies. Hemos encontrado que el ensayo CER predice conoce barreras entre especies de ratones de laboratorio a diferentes EET y han utilizado el ensayo en los esfuerzos para predecir la barrera de las especies de numerosas especies de mamíferos, entre ellos el borrego cimarrón, a la caquexia crónica (CWD) y otras EET 14, 15. Los investigadores interesados ​​en una herramienta que permite la detección rápida de la EET barreras entre especies o la evaluación de la conversión de PrP C -a-PrP res encontrarán esta metodología útil.

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Protocolo

Trabajo Animal realizado en el Centro Nacional de Salud de la fauna de USGS fue realizado de acuerdo con la Oficina de NIH de directrices Laboratorio Animal Welfare y bajo cuidado de los animales institucional y el empleo protocolo # EP080716. Los tejidos de animales cazadores-cosechada fueron regalos de la Wisconsin o Michigan Departamentos de Recursos Naturales.

1. Preparación de la solución

NOTA: Las soluciones que se indican a continuación son necesarios para la preparación del sustrato de ensayo CER en la Sección 2 a continuación. Preparar cada una de estas soluciones de soluciones de concentración de valores más altos; concentraciones recomendadas para las soluciones madre se dan entre paréntesis después de cada nombre químico respectivo incluido. Preparar todas las soluciones frescas sobre la preparación del sustrato y se almacena a 4 ° C hasta su uso.

  1. Para tampón de lisis, preparar una solución de la siguiente en 10 mM Tris, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solución valores recomendados): 100 mM scloruro de odio (NaCl, 1 M de solución madre), ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0 solución stock), 0,5% NP-40 (solución madre 10%), 0,5% de desoxicolato (DOC, solución madre 10% ).
  2. Para tampón de conversión, preparar una solución de sulfato de 0,05% de dodecil de sodio (SDS, 10% de solución de stock) y 0,5% de Triton X-100 (solución al 10% de stock) en 1 salina tamponada con fosfato (PBS, 10, pH 7,4 solución madre).
  3. Para soluciones caotrópicas, preparar dos 3 M soluciones de clorhidrato de guanidina (GdnHCl, 8 M de valores) en 1x PBS (solución 10x). Ajustar el pH de una de las soluciones a 3,5 ± 0,05 con ácido clorhídrico concentrado (HCl). Comprobar que el pH de la segunda solución se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar usando HCl concentrado o hidróxido de sodio (NaOH) si es necesario.

2. Prepare pares CER ensayo de sustrato

  1. Obtener el tejido cerebral sano, no-TSE-infectado de especies de interés y preparar un volumen de peso-por-10%(W / v) de homogeneizado en tampón de lisis utilizando cualquiera de los siguientes métodos: Dounce, molino de bolas, o de homogeneización mortero y mano de mortero. Además refinar resultante homogeneizados sometiéndolos a homogeneización jeringa y aguja, el uso de agujas de calibre creciente hasta que el substrato puede ser aspirado y expulsado con facilidad a través de una aguja de la jeringa 27 G.
    1. Para sustratos preparados a partir de roedores y otros pequeños mamíferos, homogeneizar todo el cerebro (s); para sustratos preparados a partir de los mamíferos más grandes, use OBEX (tronco cerebral) para preparar los homogeneizados de tejido. Al seleccionar la cantidad de homogeneizado de cerebro, prepare no más de 50% de la capacidad de la centrífuga utilizada para la precipitación de proteínas en el paso 2.6.
    2. Si la calidad del tejido cerebral adquirido es cuestionable, evaluar los niveles de PrP C por SDS-PAGE e inmunoblot 16 17 antes de sustrato preparación.
  2. Divida homogeneizado de cerebro en dos volúmenes iguales en tubos cónicos de plástico etiquetadas separadas. Añadir GdnHCl (3 M soluciones en 1 PBS) a pH 3,5 o bien 7,4 a cada tubo en una proporción de 1: 1 volumen de homogeneizado de cerebro.
  3. Compruebe los valores de pH de las dos soluciones. Ajustar el pH de la pH 3,5 sustrato a pH ± 0,05 usando HCl concentrado. Asegúrese de que el pH de la otra sustrato se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar el pH si es necesario con HCl o NaOH según sea necesario. Evitar sobrepasar valores de pH mediante la adición juiciosa de ácido o base.
  4. Girar soluciones en un mezclador extremo sobre extremo a temperatura ambiente (RT) durante 5 h.
  5. Precipitado de proteína mediante la adición de cuatro volúmenes de metanol a las soluciones de sustrato en cada tubo cónico, vórtice para mezclar bien, y se incuba a -20 ° C durante 16-18 h.
  6. Las muestras de sedimentos por centrifugación a 13000 × g durante 30 min a 4 ° C. Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante y dejar que el metanol se evapore de los pellets. Utilice bastoncillos de algodón para ayudar en la absorción de metanol aferrado a la parte interior del tubo. No permita bolitas a la sobre-dry, y una vez metanol ya no es visible, continúe con el siguiente paso.
  7. Bolitas de proteína Resuspender en tampón de conversión. Utilizar una cantidad de tampón de conversión igual a la cantidad de material de partida homogeneizado de cerebro dispensado en cada tubo en el paso 2.2.
    NOTA: Es fundamental que el búfer de conversión utilizado para volver a suspender gránulos de proteína tanto de pH 3,5 y los preparativos de sustrato 7,4 tratados con la solución está definida en el paso 1.2 anterior (que contiene bajos niveles de detergentes y un pH fisiológico).
  8. Soluciones brevemente con ultrasonidos sustrato en un aparato de ultrasonidos cuphorn (10 seg en ~ 30% de la potencia máxima), alícuota en 0,5 a 1,0 ml volúmenes de 1,5 ml tubos de microcentrífuga etiquetados. Realizar una inmunotransferencia de control de calidad (paso 2.9) en una parte alícuota de cada sustrato. Guarde otras alícuotas a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER (Sección 4).
  9. Realizar el control de calidad en los pares de sustrato CER antes de su uso (Figura 2). Estos pasos aseguran que los sustratos CER provide óptimos resultados en los estudios de conversión.
    1. Asegurar cantidades comparables de PrP C en los dos sustratos. Comparar los niveles de PrP en el 10-25 l de cada sustrato por SDS-PAGE e inmunotransferencia 16 17. Si los niveles de proteína en el pH 7,4 y 3,5 son sustratos dentro de ~ 10% uno del otro, los pares de sustrato son apropiados para su uso en estudios de CER.
      NOTA: Los inmunoblots PrP no deben mostrar evidencia de una extensa degradación PrP C. La inmunorreactividad de PrP debe ser principalmente> 20 kDa. Bandas de menos de esta masa molecular pueden ser productos de degradación. Patrones de bandas deben ser más o menos equivalente entre pares de sustrato.
    2. A medida que la PrP C en ambos sustratos debe ser sensible PK, tratar 10-25 l de cada sustrato con PK a una concentración final de 100 mg / ml y digerir las muestras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador. Evaluar cualquier señal PrP restante por SDS-PAGE 16 y 17 de inmunotransferencia.Sustratos con PrP res no son apropiados para su uso en estudios de CER.

3. Preparar Agente TSE Semillas

  1. Obtener el tejido cerebral infectado por el TSE a partir de especies de interés y preparar un 10% (w / v) de homogeneizado en 1X PBS pH 7,4 usando los métodos enumerados en el paso 2.1.
    NOTA: Las semillas también podrían producirse a partir de otros tejidos infectados por el TSE fuera del sistema nervioso central, sin embargo, la eficiencia de la conversión de sustratos derivado del cerebro por semillas derivadas de tejidos periféricos infectadas por el TSE aún no se ha evaluado experimentalmente en la literatura publicada.
  2. Alícuota resultante homogeneizado (s) en 100 a 300 volúmenes mu l en 0,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER.

Ensayo 4. CER

NOTA: El ensayo CER implica la adición de una cantidad relativamente pequeña de PrP TSE (siempre en la "semilla") de una especieen un exceso relativo de PrP C (proporcionado en el cerebro no infectada "sustrato") de otra especie que ha sido parcialmente desnaturalizadas, ya sea en pH 3,5 o 7,4. Tras un período de incubación prolongada agitación, la conversión basado en plantillas de PrP C en PrP TSE en cada reacción se evalúa la señal densitométrico de PrP res que queda después de la digestión PK y detección inmunoblot. La comparación de los niveles de PrP res en los sustratos previamente desnaturalizado a pH 3,5 vs. 7,4 proporciona una medida de la barrera de especies. Una visión general experimental de este procedimiento de ensayo se proporciona en la Figura 1.

  1. Lentamente se descongele pares de sustrato CER no infectadas (ensayo requiere volúmenes iguales de sustratos previamente desnaturalizado a ambos pH 3.5 y 7.4) y soluciones de semillas TSE-infectados por su inclusión en la parte superior de un lecho de hielo (aproximadamente 1 hr tiempo de descongelación).
  2. Una vez descongelado completamente, aspirado y luego expulsar a cada solución de sustrato a través de una27 G aguja de la jeringa varias veces para volver a homogeneizar. Tratar brevemente con ultrasonidos cada solución semilla infectada con TSE durante 10 segundos a ~ 30% de la potencia máxima. Mantenga todas las soluciones en hielo mientras se prepara reacciones de conversión.
  3. Label 5 tubos individuales bajos vinculantes, de paredes finas de PCR por agente de la EET están probando.
  4. Preparar reacciones de conversión en estos tubos mediante la adición de 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a 95 l de (a) sustrato CER preparados a pH 7,4 y (b) CER sustrato preparado a pH 3,5.
    1. Para cada muestra experimental, preparar reacciones paralelas en pares sustrato CER previamente desnaturalizado tanto a pH 3,5 y 7,4.
    2. Optimizar proporciones de semillas agente de la EET sustrato cerebral no infectada a través de la determinación empírica. Semilla común: relaciones de sustrato empleado mantener un volumen total de reacción de 100 l y l incluyen 1:99, 2:98 y 5:95 l l. Para la mayoría de aplicaciones, la semilla 5:95 l: relación de volumen de sustrato es apropiado y es lo que se presenta en ºes el protocolo.
  5. Preparar tres muestras de control por agente EET se ensayaron como sigue: (a) añadir 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a tampón de conversión de 95 l como control para la entrada de PrP res; añadir tampón de conversión de 5 l a 95 l de sustrato preparado en (b) pH 3,5 y (c) pH 7,4 como controles para la conversión no específica, no moldeado.
  6. En resumen vórtice cada muestra en su tubo de PCR cerrado para mezclar semillas y sustrato bien. Siga con un pulso momentáneo en una baja velocidad de banco mini-centrífuga para eliminar cualquier volumen de la mezcla de reacción atrapado en el tubo de la tapa PCR.
  7. Cargar las muestras en tubos de PCR individualmente etiquetados en un banco superior termo-agitador equipado para aceptar tubos de PCR. Agitar las muestras a 1.000 rpm a 37 ° C durante 24 horas.
  8. Después de agitación, añadir sarcosilo a una concentración final de 2% (w / v) y PK a una concentración final de 100 mg / ml. Muestras Digest en 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador.
    NOTA: La adición de sarcosilo a muestras ayudas post-conversión en PK digestión de PrP C. Señales de falsos positivos en muestras no cabezas de serie (Paso 4.5) son virtualmente eliminados por adición de sarcosilo.
  9. Añadir tampón de muestra de SDS-PAGE, las muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos y resolver restantes PrP res en cada muestra por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia 16 17.
    NOTA: Después de la adición de tampón de muestra y calefacción, muestras podrá inmediatamente procesada o muestras se pueden almacenar a -20 ° C o -80 ° C antes de la inmunotransferencia. Todos los datos aquí presentados fueron generados usando los sistemas de gel y transferencia Novex NuPAGE. Las muestras individuales del ensayo de CER se trataron con tampón de muestra y el agente reductor de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras se calentaron a continuación a 95 ° C durante 5 min y 30 l de cada muestra se cargó en un 12% de bis-tris geles prefabricados.
  10. Calcular el ratio de eficiencia de conversión (CER) como una medidade barrera de las especies. Medir los niveles de PrP res por densitometría 17 y dividen la densidad total de la muestra de pH 7,4 por la del pH 3.5 muestra. Multiplicar por 100 para producir un porcentaje.
  11. Recopilar datos de réplicas experimentales independientes para generar una media CER ± desviación estándar para una especie con un agente de la EET dado.

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Resultados

El uso exitoso del ensayo CER es dependiente en gran medida de la calidad de los pares de sustrato utilizado en reacciones de conversión. Por esta razón, siguiendo los procedimientos para preparar pares sustrato CER, un inmunoblot de control de calidad debe llevarse a cabo (Figura 2). Para ambos sustratos, ensayo de 10-25 l por inmunotransferencia. PrP C debe ser fácilmente detectable en cada sustrato y los niveles de PrP C debe ser aproximadamente la misma entre los dos. Inmunorea...

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Discusión

Para completar con éxito de este protocolo, se debe prestar atención a los niveles de PrP C en el tejido cerebral infectado utilizado para la preparación del sustrato (paso 2.1.2) y la semilla al sustrato ratio para reacciones de conversión (paso 4.4.2). En nuestra experiencia, los cerebros pueden ser extraídos para su uso como sustrato CER luego de un período sustancial post-mortem, siempre que la PrP C está presente por inmunotransferencia (Figura 4). De hecho, algunos autolisis ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien y Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturales de Michigan) y al Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Salud de la Vida Silvestre del USGS) por su ayuda con la adquisición de tejidos. También agradecemos al Laboratorio Estatal de Higiene de Wisconsin por los servicios de pruebas diagnósticas, y a la Dra. Tonie Rocke y su personal (Centro Nacional de Salud de Vida Silvestre del USGS) por el uso del equipo. Cualquier uso de nombres comerciales, de productos o de empresas es solo para fines descriptivos y no implica la aprobación por parte del Gobierno de los EE. UU.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
12% Bis-Tris Geles SDS-PAGELife TechnologiesNP0342
0,5 mm Perlas de óxido de circonioSiguiente AvanceZROB05Otras variedades de perlas también son efectivas
Anticuerposvarios proveedoresSeleccione los anticuerpos primarios y secundarios apropiados para la detección de inmunotransferencia de PrPres de especies de interés
Homogeneizadorde perlasSiguiente AvanceCentrífuga BBY24M
BeckmanCoulter369434Alta velocidad con control
de temperatura Tubos cónicosde cualquier marca
Aplicador con punta de algodónUlineS-18991
Sonicator CuphornSistemas de calor-UltrasonidosW-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. ahora es Qsonica, LLC
Densitometría programa de softwareUVPVision Works LS Software de adquisición y análisis de imágenesOtros programas, como NIH ImageJ, también funcionarán
Homogeneizador de onzasKimble Chase885300
Mezclador de extremo a extremoLabnet InternationalH5600
Ácido etilendiaminotetra acéticoBoston BioproductsP-770Producto químico peligroso: irritación ocular
Clorhidrato de guanidina, 8 MThermo Fisher Scientific24115Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos
Bloque calefactorFisher Scientific11-718
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich435570Producto químico peligroso: ácido fuerte
Tampón de muestra de dodecilo sulfato de litio, 4xLife TechnologiesNP0008Producto químico peligroso: piel & irritación respiratoria, daño ocular grave, sólido inflamable
MetanolFisher ScientificA454-4Producto químico peligroso: toxicidad aguda, líquido inflamable
Tubos de microcentrífugacualquier marca
MinicentrífugaLabnet InternationalC1301
N-laurol-sarcosina (sarkosyl)Sigma-Aldrich L-5125Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular
Nonidet P-40AmrescoM158Producto químico peligroso: irritación de la piel, daño ocular
Sistema de gel SDS-PAGESistemaelectroforesis LifeNuPAGE Otros sistemas SDS-PAGE también funcionarán
Tubos de PCR (de baja fijación)AxygenPCR-02-L-C
Homogeneizadorde morteroFisher Scientific03-392-106
Medidor de pHSentronSI600
Membrana de polivinildifluoruroMilliporeIPVH00010
Proteinasa KPromegaV3021Producto químico peligroso: irritación de la piel y los ojos, sensibilización respiratoria, toxicidad orgánica
Agente reductor para muestras SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Cloruro de sodioFisher Scientific7647-14-5
Desoxicolato de sodioSigma-Aldrich D6750Producto químico peligroso: toxicidad aguda
Dodecil sulfato de sodioThermo Fisher Scientific28364Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación de la piel, daño ocular, sólido inflamable
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS5881Producto químico peligroso; base fuerte
JeringaBD BiosciencesVariosUso Tamaño de jeringa adecuado a los volúmenes de sustrato a homogeneizar
Agujas de jeringaBD Biosciencesvarios
Thermoshaker (agitador de tubos de PCR)Hangzhou All Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Producto químico peligroso: irritación de la piel, los ojos, las vías respiratorias
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Producto químico peligroso: toxicidad aguda, irritación ocular
VórticeFisher Científico12-812
de Technologies

Referencias

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722(2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32(2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157(2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753(2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623(2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).

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