Artículo de método

El busulfán como agente mielosupresor para Generación estable de alto nivel de Médula Ósea quimerismo en ratones

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DOI:

10.3791/52553

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1 de abril de 2015

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1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo mediante el cual el condicionamiento de busulfano permite que la médula ósea de un ratón receptor sea reemplazada por células de médula ósea de ratones donantes que expresan de forma ubicua proteína fluorescente verde, en ausencia de irradiación. Esta técnica es útil para estudiar la acumulación de células de la médula ósea en el sistema nervioso central.

Resumen

El trasplante de médula ósea (TMO) se utiliza a menudo para reemplazar el compartimento de médula ósea (BM) de los ratones receptores con células BM que expresan un biomarcador distinto aislado de ratones donantes. Esta técnica permite la identificación de células hematopoyéticas derivadas de donantes dentro de los ratones receptores, y se puede utilizar para aislar y caracterizar células de donantes utilizando diversas técnicas bioquímicas. Por lo general, el trasplante de médula ósea se basa en el acondicionamiento mielosupresor con irradiación corporal total para generar un espacio de nicho dentro del compartimento de médula ósea de los ratones receptores para el injerto de células del donante. El protocolo que aquí describimos utiliza el condicionamiento mielosupresor con el agente quimioterapéutico busulfano. A diferencia de la irradiación, que requiere el uso de instalaciones especializadas, el acondicionamiento con busulfano se realiza mediante inyecciones intraperitoneales de 20 mg/kg de busulfán hasta que se ha administrado una dosis total de 60-100 mg/kg. Además, la irradiación mielosupresora puede tener efectos secundarios tóxicos y requiere un injerto exitoso de células donantes para la supervivencia de los ratones receptores. Por el contrario, el acondicionamiento con busulfano con estas dosis es generalmente bien tolerado y los ratones sobreviven sin el apoyo de las células del donante. Las células BM del donante se aíslan de los fémures y las tibias de ratones que expresan de forma ubicua la proteína verde fluorescente (GFP) y se inyectan en la vena lateral de la cola de los ratones receptores condicionados. El quimerismo de la médula ósea se calcula cuantificando el número de células GFP+ dentro de la sangre periférica después de la médula ósea. Los niveles de quimerismo >80%) se observan típicamente en la sangre periférica 3-4 semanas después del trasplante y permanecen establecidos durante al menos 1 año. Al igual que con la irradiación, el acondicionamiento con busulfano y BMT permite la acumulación de células derivadas de BM del donante dentro del sistema nervioso central (SNC), particularmente en modelos murinos de neurodegeneración. Esta acumulación del SNC mediada por busulfano puede ser más fisiológica que la irradiación corporal total, ya que el tratamiento con busulfano es menos tóxico y la inflamación del SNC parece ser menos extensa. Nuestra hipótesis es que estas células pueden ser modificadas genéticamente para administrar terapias al SNC.

Introducción

Recientemente, ha habido un interés considerable en el papel de la microglía y las células derivadas de la médula ósea (BMDC) en el sistema nervioso central (SNC), tanto durante la enfermedad como con el envejecimiento normal. Ahora se sabe que la microglía, las células inmunitarias residentes del SNC, se desarrollan en el SNC tras la entrada de progenitores mieloides primitivos durante la embriogénesis1. La microglía conserva aspectos de su linaje mielomonocítico hasta bien entrada la vida adulta. Si bien la evidencia sugiere que la contribución de las BMDC a la reserva microglial es mínima en animales adultos sanos1, el papel que desempeñan las BMDC en la progresión de diversas enfermedades neurodegenerativas sigue sin estar claro. Esta incertidumbre se ve agravada por el hecho de que es difícil distinguir las BMDC que se acumulan en el SNC de la microglía residente endógena, ya que no se ha identificado ningún marcador inmunohistoquímico discriminante universalmente aceptado. Con el fin de monitorizar las BMDC in vivo, empleamos un protocolo de trasplante de BM (BMT) mediante el cual las células BM endógenas de un ratón receptor se sustituyen por las de un ratón donante que expresan de forma ubicua la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor de β-actina. Este protocolo permite determinar tanto la localización como la morfología de las BMDC GFP+ en el ratón receptor mediante inmunohistoquímica, y facilita la caracterización adicional de estas células mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) seguida de ensayos bioquímicos posteriores.

Para un trasplante de médula ósea, las células receptoras de BM necesitan ser ablacionadas (denominadas mieloablación) para generar un espacio de nicho dentro de la médula receptora para permitir el injerto de células del donante. A menudo, la mieloablación se logra utilizando irradiación gamma corporal total que induce roturas de doble cadena en el ADN que conducen a la muerte celular, particularmente en células en división activa, como las células progenitoras hematopoyéticas2,3. Los protocolos de irradiación se realizan para inducir una muerte suficiente de las células BM, de modo que se produzca letalidad animal si el animal receptor no logra un injerto adecuado de células donantes a partir de BMT (lo que se denomina "irradiación letal"). Sin embargo, la irradiación requiere una instalación y equipo especializados, junto con recursos veterinarios y de cría de animales que no están disponibles para los investigadores en todas las instituciones. Además, la irradiación mielosupresora puede causar daños potencialmente letales a otros tejidos y, debido a la inmunosupresión, los animales irradiados son más susceptibles a infecciones secundarias3. Por ello, se han desarrollado regímenes de acondicionamiento de intensidad reducida (los llamados protocolos 'RIC') destinados a minimizar los efectos secundarios potencialmente tóxicos del protocolo de acondicionamiento en los pacientes, especialmente para su uso en poblaciones de riesgo como los niños y los ancianos4.

Algunos protocolos RIC se basan en quimioterapéuticos como el busulfano para acondicionar el compartimento de la BM. El busulfán es un agente alquilante bifuncional del ADN, a menudo utilizado clínicamente como alternativa a la irradiación5,6. En particular, el busulfano puede administrarse de forma segura a ratones mediante inyección intraperitoneal (IP) y no requiere las instalaciones y el equipo especializados necesarios para irradiar ratones. El condicionamiento con busulfano se ha utilizado ampliamente en nuestro laboratorio7, así como en varias otras publicaciones recientes 8-11. Cuando se emplean dosis de 60-100 mg/kg, se pueden establecer altos grados de quimerismo estable (>80% de células GFP+) en la sangre periférica y BM7. Es importante destacar que, a estas dosis, la mieloablación no es completa y, como tal, los ratones pueden sobrevivir sin recibir células BM de apoyo (K. Peake, J. Manning, C. Lewis y C. Krieger, observaciones no publicadas). Además, con el condicionamiento mielospresor de busulfano se produce una rápida reconstitución de las células mielomonocíticas de sangre periférica por parte de las células donantes. Sin embargo, la sustitución de los linfocitos de sangre periférica por células de donantes es más lenta, lo que pone de manifiesto la falta de inmunosupresión que se produce con dosis de 60-100 mg/kg de busulfán en comparación con la irradiación corporal total7.

Hemos utilizado con éxito el quimerismo inducido por busulfano para investigar BMDC en ratones de tipo salvaje, así como en modelos de ratón de los trastornos neurodegenerativos esclerosis lateral amiotrófica (ELA)7 y enfermedad de Alzheimer. Se ha observado que, bajo ciertas condiciones, se acumulan cantidades significativas de BMDC GFP+ dentro del SNC7,12. Es importante destacar que, al igual que el acondicionamiento mielosupresor con irradiación, el acondicionamiento con busulfano seguido de BMT es suficiente para permitir la acumulación de GFP+ BMDC dentro del SNC tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones con trastornos neurológicos 7-11. Dado que un obstáculo importante en el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos es la capacidad de hacer que las moléculas terapéuticas pasen de la circulación al SNC, donde pueden ejercer efectos beneficiosos, lo que plantea la posibilidad de que las BMDC puedan diseñarse para expresar moléculas terapéuticas y, posteriormente, utilizarse como vehículo para administrar terapias al SNC de los receptores condicionados por busulfano. un mecanismo que estamos investigando activamente. Aunque hemos encontrado que el condicionamiento mielosupresor con irradiación conduce a una mayor acumulación de GFP+ BMDC en el SNC en comparación con el condicionamiento con busulfano7, la irradiación puede tener una toxicidad considerable en pacientes con trastornos neurodegenerativos y en modelos murinos de enfermedad del SNC.

Aunque nosotros, y muchos otros, hemos utilizado modelos de BMT para estudiar los BMDC en trastornos neurodegenerativos, la capacidad de reemplazar en gran medida el compartimento BM de un ratón receptor con una población claramente identificable de células BM es una herramienta invaluable para estudiar varios aspectos del sistema hematopoyético. Esto incluye una amplia gama de temas de investigación, como el desarrollo del linaje hematopoyético, la leucemia, el trasplante de órganos, la enfermedad de injerto contra huésped y la inmunobiología.

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Protocolo

NOTA: Ética Declaración: Este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser (UACC; permitir números 1037K-12 y 1060K-03) y está en conformidad con el Consejo Canadiense de los Animales, la Guía del NIH para la la Directiva CEE Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y.

1. Consideraciones especiales

NOTA: El busulfán es citotóxica. Manipule y deseche de acuerdo a la hoja de datos de seguridad de materiales y directrices institucionales.

  1. Realice todas las técnicas asépticamente en una campana de flujo laminar.
  2. Esterilizar los instrumentos antes de su uso envolviendo en un material de envasado apropiado, tal como un paquete de la cáscara, y tratamiento en autoclave.
  3. Mientras que el riesgo de infección es menor con busulfán acondicionado en comparación con la irradiación, manejar animales sólo en una campana de flujo laminar para las primeras 2 semanas después del trasplante.

2. Acondicionamiento deLos ratones receptores

  1. Diluir busulfán a 3 mg / ml con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: Es importante hacer una dilución fresca de busulfán justo antes de su uso cada día de la inyección.
  2. Administrar 20 mg / kg de busulfan diluida a ratones receptores mediante inyección IP diaria.
  3. Repetir las inyecciones IP diarias de 20 mg / kg busulfán hasta una dosis total de 60-100 mg / kg ha sido entregado (es decir, para un / kg dosis total de 80 mg, administrar 20 mg / kg de busulfan durante 4 días consecutivos).

3. Aislamiento de células de médula ósea de donantes

NOTA: Este protocolo ha sido utilizado con éxito para aislar y preparar células BM de hasta 5 ratones donantes. Típicamente, el rendimiento de células por ratón es de aproximadamente 30-40 million BMDCs, lo cual es suficiente para trasplantar 12-16 ratones receptores. Si se necesitan más ratones donantes puede ser necesario ajustar en consecuencia el protocolo.

  1. Tras el último día de busulfán acondicionado euthanize un ratón donante GFP (uno a seis meses de edad) con CO 2 (o por otro procedimiento de eutanasia aceptado en la institución). Para evitar complicaciones injerto utilizan donantes singénicos que son del mismo sexo que los destinatarios.
  2. Pulverizar ratón con etanol al 70%. La piel de elevación con las tijeras quirúrgicas abdomen y utilizando hacer una incisión a través de la piel de la cavidad abdominal arriba de la pierna hacia el tobillo. Sosteniendo el pie, tire firmemente la piel desde el tobillo hacia la cadera exponiendo el tejido de la pierna.
  3. Recorte el tejido muscular y grasa del fémur para exponer la articulación de la cadera.
  4. Mientras tira suavemente con el pie para extender la pierna, pulse la tijera contra la articulación de la cadera. Cortar justo por encima de la cabeza del fémur con cuidado de no cortar el propio fémur.
  5. Para ayudar a mantener la esterilidad, mantenga la pierna con el pie y limpiar cualquier resto de tejido de los huesos por el roce de la superficie del hueso con tejidos tratados en autoclave.
  6. Separar el fémur y la tibia mediante el corte a través de la articulación de la rodilla ycolocar el fémur en una placa de cultivo que contiene PBS estéril. Incubar en hielo.
  7. Retire y deseche el peroné por el corte en los puntos donde el peroné se conecta a la tibia. Coloque la tibia en la placa de cultivo con el fémur y se incuba en hielo.
  8. Repita los pasos 3.2 a 3.7 de la otra pierna, y si es necesario, ratones donantes adicionales. Después de la eliminación de los huesos, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de cuentas caliente o utilizar un nuevo conjunto de herramientas estériles para las etapas ulteriores.
  9. Para los fémures, mantenga el fémur con pinzas y con unas tijeras quirúrgicas cuidadosamente 'afeitado' los extremos distales de los huesos. Retire tan poco del hueso como sea necesario para exponer la cavidad BM.
  10. Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 23. Taladro con cuidado la aguja en la cavidad BM y lave el BM en una placa de cultivo estéril. Asegúrese de raspar la cavidad medular con la punta de la aguja para asegurar la eliminación de todas las células deseadas. Después de la extracción,asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco.
  11. Repita los pasos 3.9 a 3.10 para fémures posteriores, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo.
  12. Para las tibias, mantenga la tibia con unas pinzas y con cuidado 'afeitado' el final, donde la tibia se adjuntó a la rodilla para exponer la cavidad BM. Haga un segundo corte a lo largo del hueso donde termina el BM roja visible.
  13. Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 25. Suavemente inserte la aguja en la cavidad BM (desde el extremo que se adjuntó a la rodilla) y enjuagar el BM en la placa de cultivo que contiene el BM de los fémures. Raspe las paredes de la cavidad BM con la aguja para eliminar todas las células. Después de la extracción, asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco.
  14. Repita los pasos 3.12 a 3.13 para la posterior tibias, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo.
  15. Tritura suavemente el BM con una punta de pipeta de 1 ml para disociar el cells.
  16. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de cesta 40 mM en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Enjuague el plato con PBS para obtener las células restantes y transferir este a través del filtro en el tubo de centrífuga.
  17. Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante.
  18. Vuelva a suspender el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  19. Añadir ~ 30 ml de PBS estéril para saciar el buffer de lisis.
  20. Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante.
  21. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de PBS estéril. Mantener en hielo.
  22. Tomar una pequeña alícuota del homogeneizado celular y se diluye con PBS (1: 100 para ratón 1; 1: 200 para 2 ratones, etc.) para cuantificar el número de células usando un hemocitómetro.
  23. Diluir la suspensión de células a 8 x 10 6 células / ml y se incuba en hielo hasta la inyección.

4. Trasplante de Médula Ósea

  1. Fill una jeringa de 0,5 ml (con una aguja de insulina 28 G) con 300 l de suspensión celular diluida para cada ratón a inyectar. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire presentes en la jeringa.
  2. Coloque la jaula del ratón contiene los ratones receptores acondicionado en una almohadilla eléctrica y permitir que las venas de la cola se dilaten.
  3. Tome un ratón receptor y colocar en el dispositivo de retención. Limpiar la cola con una gasa quirúrgica empapada con etanol al 70%.
  4. Sostenga firmemente la cola y con el bisel hacia arriba, inserte suavemente la aguja en una de las venas de la cola laterales e inyectar la suspensión celular.
  5. Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de introducir el ratón en una nueva jaula limpia.

5. Estimación de la Extensión de la BM quimerismo

NOTA: Los niveles de quimerismo suelen ser variable en la sangre periférica en 1 semana post-trasplante de médula ósea, y como tal, los niveles de quimerismo normalmente se estiman al menos 2 semanas post-TMO. Los niveles de chimerism debe alcanzar> 80% GFP + células en la sangre periférica dentro de 3-4 semanas después del trasplante de médula ósea.

  1. Preparar tampón FACS (mM EDTA suero bovino fetal al 2 + 2% en PBS).
    NOTA: tampón FACS se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  2. Coloca el ratón en un tubo de restricción y afeitar el pelo de la pierna posterior para exponer la vena safena lateral.
  3. Capa finamente la pierna con vaselina y perforar la vena safena con una aguja de 25 G.
  4. Recoger aproximadamente 50 l de sangre con un tubo capilar recubierto con heparina. Añadir la sangre a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de tampón FACS. Mezclar el tubo por inversión y almacenar en hielo.
  5. Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de volver ratón de nuevo a la jaula.
  6. Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  7. Vuelva a suspender el sedimento en 500 l de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  8. Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis.
  9. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  10. Realizar una segunda etapa de lisis en 500 l de tampón de lisis de eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  11. Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis.
  12. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. Compruebe que la pastilla es ahora blanco.
    NOTA: Si el pellet todavía aparece rojo, puede ser necesaria una etapa de lisis adicional antes de proceder al siguiente paso.
  13. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de tampón FACS. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  14. Vuelva a suspender el sedimento en 300 l de tampón FACS y cuantificar células GFP + mediante citometría de flujo (NOTA: En este punto cualquier inmunotinción deseada de las células se puede realizar, utilizando técnicas estándar, antes del análisis de citometría de flujo).

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Resultados

La administración de 60-100 mg / kg de busulfan es generalmente bien tolerada por los ratones. Sin embargo, los animales suelen perder peso durante la fase de acondicionamiento (~ 10.5%) y por lo tanto la dieta puede ser necesario complementar con golosinas como las semillas de girasol irradiadas para promover la alimentación. Los niveles de quimerismo de> 80% GFP + células en la sangre periférica y BM deben ser sistemáticamente alcanzable utilizando 60-100 mg / kg busulfán 7. Nuestro laboratorio ha utiliz...

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Discusión

Acondicionado Busulfan permite la generación de alto nivel de quimerismo BM en ratones con células hematopoyéticas que son fácilmente detectable. Este acondicionamiento se puede realizar sin la necesidad de instalaciones de irradiación. Además, la mielosupresión con las dosis de busulfán se describe en este protocolo es bien tolerada, se minimizan los efectos secundarios tóxicos provocados por dosis mieloablativos de la irradiación, y por lo tanto puede ser una técnica más adecuada para generar BM quimerismo en ratones ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Beca Conmemorativa Ronald Peter Griggs en Investigación de ELA (a KP) y una subvención del Programa de Asociación de Investigación Neuromuscular del CIHR, la Sociedad de ELA de Canadá y Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) a CK y FMR. La ALS Society of America (57969) también proporcionó apoyo adicional. Nos gustaría agradecer al Dr. R. Keith Humphries del Laboratorio Terry Fox / Departamento de Patología de la Agencia del Cáncer de Columbia Británica, Vancouver, Canadá y al personal de la Unidad de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BusulfexOtsuka Canada Pharmaceutical Inc.DIN 02240602Diluya el busulfán a 3 mg/ml con PBS estéril justo antes de usar. El busulfano es citotóxico. Manipule y deseche de acuerdo con la MSDS y las pautas institucionales.
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01podría sustituir por otro tampón de lisis, pero es posible que sea necesario ajustar los tiempos de incubación en consecuencia
: Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020
Se

Referencias

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Acondicionamiento con busulf nTrasplante de m dula seaAn lisis por citometr a de flujoC lulas GFP positivasAislamiento de m dula seaInyecci n en la vena caudalAn lisis de sangre perif ricaAcumulaci n en el sistema nervioso central

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