Un modelo murino de irreversible y reversible obstrucción ureteral unilateral

Resumen

El modelo murino de obstrucción ureteral unilateral irreversible (UUO) se presenta junto con el modelo de UUO reversible en el que la obstrucción ureteral se alivia mediante la anastomosis del uréter cortado en la vejiga. Estos modelos permiten el estudio de la inflamación y la cicatrización renal, así como la remodelación de los tejidos.

Resumen

La obstrucción del riñón puede afectar a los riñones nativos o trasplantados y provocar lesiones renales y cicatrices. Se presenta un modelo de nefropatía obstructiva inducida por obstrucción ureteral unilateral (UUO), que puede ser irreversible (UUO) o reversible (R-UUO). En el modelo UUO irreversible, el uréter puede estar obstruido durante períodos de tiempo variables con el fin de inducir una inflamación renal cada vez más severa y cicatrices fibróticas intersticiales. En el modelo R-UUO reversible, el uréter se obstruye para inducir hidronefrosis, dilatación tubular e inflamación. Después de un período de tiempo adecuado, la obstrucción ureteral se revierte quirúrgicamente mediante la anastomosis del uréter cortado previamente obstruido a la vejiga para permitir la descompresión completa del riñón y el restablecimiento del flujo urinario a la vejiga. El modelo UUO irreversible se ha utilizado para investigar varios aspectos de la inflamación renal y la cicatrización, incluida la patogénesis de la enfermedad y las pruebas de posibles terapias antiinflamatorias o antifibróticas. El modelo más desafiante de R-UUO ha sido utilizado por algunos investigadores y ofrece un potencial de investigación significativo, ya que permite el estudio de los procesos inflamatorios e inmunológicos y la remodelación del tejido en un riñón lesionado y cicatrizado después de la eliminación del estímulo perjudicial. Como resultado, el modelo R-UUO ofrece a los investigadores la oportunidad de explorar la resolución de la inflamación renal junto con aspectos clave de la reparación de tejidos. Estos modelos experimentales son relevantes para las enfermedades humanas, ya que los pacientes a menudo presentan una obstrucción del tracto renal que requiere descompresión y, por lo general, quedan con una insuficiencia renal residual significativa que no tiene opciones de tratamiento actuales y puede conducir a una eventual insuficiencia renal en etapa terminal.

Introducción

El objetivo general del modelo experimental descrito aquí es inducir nefropatía obstructiva por obstrucción ureteral unilateral (UUO), que puede ser irreversible (UUO) o reversible (R-UUO). Se presenta un modelo simple e irreversible de UUO en el que el uréter izquierdo está obstruido permanentemente por ligadura con una sutura o por la aplicación de una pinza ligadura. Esto da lugar a una dilatación marcada del uréter junto con una reducción del flujo sanguíneo renal y de la filtración glomerular. La histología renal muestra dilatación tubular e inflamación y fibrosis renal intersticial cada vez más severas. La UUO irreversible es un modelo útil y ha sido adoptado por muchos investigadores en el estudio tanto de la inflamación renal como de la fibrosis. ^1-4 Aunque el modelo irreversible de UUO requiere cierta experiencia quirúrgica, es relativamente sencillo y a menudo se utiliza para buscar información sobre la patogénesis de la lesión renal intersticial y la fibrosis subsiguiente. También se presenta un modelo R-UUO menos utilizado utilizando una modificación del método descrito originalmente por Tapmeier et al. ⁵ El modelo R-UUO tiene mucho potencial futuro para el estudio de los procesos inflamatorios e inmunológicos, la regeneración celular y tisular, así como la posterior remodelación tisular después de la eliminación de un estímulo perjudicial.

El modelo R-UUO más desafiante ha sido utilizado por un número limitado de investigadores, con algunos grupos empleando una técnica quirúrgica significativamente diferente a la descrita aquí^6,7, aunque con resultados interesantes. En el modelo R-UUO presentado, el uréter se liga para inducir una obstrucción ureteral completa durante un período de tiempo suficiente para inducir el nivel de lesión y fibrosis deseado: se eligieron 7 días de UUO en el método descrito aquí. La obstrucción ureteral se revierte y se permite que el riñón se descomprima durante un período de tiempo determinado por el investigador antes de que los ratones sean sacrificados y se extraiga el riñón para su análisis: se eligieron 7 días de descompresión en el método descrito aquí, aunque se elegiría un período más largo si se estaba estudiando la resolución de la inflamación y la fibrosis. Aunque el método descrito aquí requiere una experiencia quirúrgica significativa, ofrece varias ventajas sobre otros modelos R-UUO. La aplicación de un tubo de plástico de paredes blandas sobre el uréter obstruido evita la dilatación ureteral excesiva y esto facilita la posterior manipulación y anastomosis del uréter. Además, en el modelo R-UUO descrito, el uréter se divide, lo que permite la eliminación de cualquier sedimento urinario residual y desechos. Esto confirma que la luz restante del uréter está desobstruida y permeable antes de la anastomosis a la vejiga.

Los experimentos que incorporan tanto los modelos UUO irreversibles como los reversibles pueden proporcionar a los investigadores una poderosa visión de los mecanismos moleculares y celulares tanto de la lesión como de la posterior resolución y regeneración. Por lo tanto, el modelo de R-UUO descrito aquí sería muy relevante para los investigadores interesados en la remodelación del tejido postinflamatorio y cómo se puede modular.

Protocolo

Guía General: Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos y regulaciones impuestas por los Animales (Procedimientos Científicos) Ley de 1986. Este protocolo y el protocolo de vídeo que acompaña son tanto para una OUU estándar y un R-OUU, que se puede realizar en muchos cepas de ratón. En el video que acompaña, ambos procedimientos se llevan a cabo en ratones machos C57BL / 6 ratones de 8 semanas. Los datos presentados en la sección de resultados representativos se obtuvieron de machos FVB / n ratones.

NOTA: Este protocolo y acompañando detalles del video de cómo realizar una OUU estándar y R-OUU utilizando el uréter izquierdo, sin embargo las mismas técnicas pueden ser fácilmente aplicadas al uréter derecho.

1. Preparación de los animales y laparotomía

1. Realice todos los procedimientos con instrumentos estériles (en autoclave) y consumibles.
2. Inyectar clorhidrato de ketamina (70 mg / kg) y clorhidrato de medetomidina (1 mg / kg) por vía intraperitoneal para anestesiarel ratón. Nota: La duración del plano anestésico resultante es de 4 horas y no se requiere anestesia suplementaria.
3. Confirme la profundidad de la anestesia por la pérdida de los reflejos por ejemplo, pizca dedo del pie.
4. Eliminar todo el pelo que rodea el área de la incisión y preparar la piel para la cirugía abdominal a través de la aplicación de una solución de clorhexidina diluido.
5. Coloque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica climatizada en posición supina y fijar las extremidades a la almohadilla con cinta adhesiva de baja adherencia.
6. Durante el procedimiento, supervisar el ratón para detectar signos de quemaduras térmicas como resultado de la almohadilla quirúrgica calentada. Si es posible utilizar una fuente de calor no eléctrico.
7. Administrar analgésico mediante una inyección subcutánea de hidrocloruro de buprenorfina (0.06mg / kg) y aplicar lubricante ocular para evitar el secado de la córnea.
8. Hacer una laparotomía media y una incisión de la línea alba avascular utilizando tejido que separa las tijeras para obtener acceso a la cavidad peritoneal.
9. Coloque el ratón e inserte un colibriretractor en la incisión.

2. Unilateral ureteral Obstrucción

1. El uso de bastoncillos de algodón esterilizados exponer el uréter izquierdo desplazando los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal y cubre con paños humedecidos.
2. Con unas pinzas en ángulo aislar y levantan el uréter izquierdo.
3. Para crear una obstrucción de la uretra, ligar el uréter izquierdo dos veces con 6 / O trenzado negro sutura de seda en cualquier lugar entre la vejiga y pelvis renal. Para los experimentos a largo plazo, el uso de sutura absorbible para todas las cirugías abdominales. Alternativamente, un clip de ligadura se puede aplicar con el uréter.
4. Para aislar la vejiga al uréter, divida el uréter entre los dos puntos de sutura.
5. Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos a la cavidad peritoneal.
6. Siga los pasos que se indican en la Sección 4 - Recuperación Post-Operativo y Cuidado para cerrar la incisión y revertir la anestesia.

3. Preparación para Reversible unilateral ureteral Obstrucción

1. Preparar un ratón para la cirugía y aislar el uréter izquierdo tal como se detalla en los pasos 1.1 a 2.2 anteriormente.
2. Para crear una obstrucción de la uretra que puede ser revertida, ligar el uréter izquierdo dos veces con 6 / O trenzado negro sutura de seda cerca de la vejiga. Deja un extremo de la sutura superior siempre y cuando este se utiliza para anclar el tubo de plástico de pared suave en su lugar alrededor del uréter.
3. Hacer una hendidura longitudinal en una longitud de 5 mm de tubo de plástico de pared blanda, que puede ser extendió abierta para permitir que se aplique con el uréter. Cualquier tubo de plástico blando de silicona amurallada, con un diámetro interno de 1 mm y un diámetro exterior de 2 mm, se puede utilizar.
4. Coloque el tubo de plástico de paredes suaves suavemente alrededor del uréter. Asegúrese de que el largo de la sutura emerge desde el centro de la ranura en el tubo una vez que se cierra alrededor del uréter.
5. Coloque una longitud de 6 / O trenzado negro sutura de seda alrededor de la tubería de pared suave que encierra el uréter y ataruna vez. Ahora coloque el extremo largo de la sutura, emergiendo desde el centro de la ranura en el tubo, longitudinalmente a través de la tubería de manera que se sitúe en la parte superior de la sutura previamente atado.
6. Ate la sutura situado alrededor del tubo dos veces para anclar la tubería y el extremo largo de sutura en su lugar alrededor de la uretra.
   Nota: Para evitar la formación de adherencias en el uréter y el tubo de plástico de pared suave, una solución de reducción de la adhesión se puede aplicar a la zona alrededor de la tubería.
7. Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos a la cavidad peritoneal.

Recuperación y Cuidados 4. Post-Operativo

1. Cierre del peritoneo con puntada manta usando 5 / O trenzado negro sutura de seda y aproximar la piel con clips metálicos de la piel.
2. Para minimizar el riesgo de infección post-operatoria, aplicar un antiséptico tal como una solución de yodo / alcohol a la piel abdominal.
3. Parcialmente anestesia atrás con clorhidrato de atipamezol (2 mg / kg) por vía subcutánea.
4. Administrar fluidos por una inyección subcutánea de 1 ml de solución salina calentada.
5. Monitorear el ratón hasta que se haya recuperado la conciencia.
6. Deje que el ratón se recupere en una caja climatizada mantenido a 29 ° C durante 24 horas. Comida humedecida también se puede proporcionar para estimular la ingesta de líquidos y la nutrición.
7. Deje el ratón para recuperar para inducir un nivel deseado de obstrucción, típicamente de 7 días.
8. Para los experimentos de recuperación a largo plazo, proporcionar analgésicos en curso. Si el ratón se ha de recuperar por más de 7 días, retire los clips de la piel 7 días después de la cirugía.
9. Una vez que el nivel deseado de obstrucción ha sido inducida, ya sea invertir la OUU, como se describe a continuación, o la eutanasia el ratón por dislocación cervical y recoger los riñones para el análisis de la histopatología.

5. reversible unilateral ureteral Obstrucción

1. Para realizar una R-OUU preparar un ratón, que ha sido objeto de preparación para R-OUU, para la cirugía como se describe en los pasos 10,1-1,7.
2. Si está presente, quitar los clips de la piel y dividir o eliminar las suturas en el peritoneo para obtener acceso a la cavidad abdominal. Nota: Si el uréter ha sido obstruido por un largo plazo clips piel experimento debería haber sido eliminado 7 días después de la aplicación.
3. Preparar el ratón y aislar el uréter izquierdo tal como se describe en los pasos 1.8 a 2.2.
4. Con unas pinzas en ángulo, liberar el tubo de plástico de paredes blandas de cualquier tejido granulomatoso que se hayan formado.
5. Cortar la sutura sujeta el tubo de plástico alrededor del uréter obstruido con un bisturí y retire el tubo.
6. Confirme éxito OUU mediante la evaluación de la presencia de hidronefrosis en el riñón izquierdo, el riñón también debería aparecer pálido.
7. Divida el uréter entre las suturas.
8. Coloque la longitud restante del uréter, que se adjunta en el riñón, en un pequeño trozo de gasa estéril. Esto será utilizado para recoger el sedimento urinario y las células muertas que drenará desde el uréter unand pelvis renal una vez que la sutura se retira.
9. Divida el uréter por encima, pero cerca, la sutura y permitir que el riñón para drenar en la gasa. Deja la sutura inferior, más cercana a la vejiga, intacto. Esto es para asegurar que no tendrá fugas de orina desde la vejiga y en la cavidad peritoneal.
10. Una vez que el uréter y pelvis renal han sido drenados, aplicar un largo 6 / O negro sutura de seda trenzada hasta el final de la longitud restante del uréter. Esto se utiliza para ayudar el uréter a la vejiga anastomosis realizada más tarde.
11. Siga los pasos de abajo para anastomose la longitud restante de uréter en la vejiga:
    1. Girar el uréter manera que se sitúe anterior a su posición original y se encuentra sobre el riñón.
    2. Coloque un solo 9 / O monofilamento de poliamida viradas de sutura 2 mm desde el extremo del uréter tal que emerge en la dirección de la vejiga. Tener cuidado para asegurar que la sutura permanece en la capa muscular y no entra en el lumen del uréter. El wil sutura viradasl se utiliza para anclar el uréter en la vejiga.
    3. Para crear un canal a través de la vejiga, pasar una aguja 21G en diagonal a través de la vejiga, tales que sale hacia el frontal (ventral) de la pared de la vejiga.
    4. Descanse una aguja de ojos en el bisel de la aguja 21G. Utilice la aguja 21G para guiar la aguja de ojos a través de la vejiga. La aguja de ojos se utilizará para tomar el uréter a través de la vejiga.
    5. Pasar el viradas de sutura 9 / O, aplicado con el uréter en el paso 5.11.2, a través de la primera incisión en la vejiga y hacia fuera a través de la pared de la vejiga adyacente al punto de entrada. Una vez que el uréter se pasa a través de la vejiga, esto será atado para anclar el uréter a la vejiga.
    6. Coloque el largo 6 / O sutura de seda trenzada negro aplicada al extremo del uréter en el paso 5.10 través de la aguja de ojos.
    7. Retirar cuidadosamente la aguja de ojos fuera de la vejiga garantizando al mismo tiempo que el uréter también se tira a través de la vejiga.
    8. Una vez que el uréter emerge de The vejiga retire la aguja de ojos y aplicar una abrazadera a la larga de sutura en el extremo del uréter para evitar la retracción de nuevo en la vejiga.
    9. Para anclar el uréter dentro de lugar en la vejiga, atar el 9 / O de poliamida de sutura monofilamento de pegajosidad, aplicada en el paso 5.11.5.
    10. Aplicar individuales 9 / O poliamida suturas lazo monofilamento adicionales como se describe en los pasos 5.11.2 y 5.11.5 en dos localidades de todo el punto de entrada para anclar firmemente el uréter en la vejiga.
    11. Con el dorso de tijeras abiertas, empuje la pared de la vejiga hacia atrás ligeramente para exponer más del uréter emergente.
    12. Divida el uréter por encima de la sutura larga situada en el extremo del uréter. El uréter debe retraerse en el cuerpo de la vejiga. Es habitual observar orina que fluye fuera de la abertura en la vejiga, lo que confirma el lumen abiertos del uréter.
    13. Cierre el orificio de salida en la vejiga con un monofilamento de poliamida de sutura 9 / O.
12. Vuelva a colocar cuidadosamente los intestinos enla cavidad peritoneal.
13. Proporcionar cuidados postoperatorios, como se detalla en los pasos 4.1 a 4.8.
14. Deje que el ratón para recuperar hasta que se descomprime el riñón, por lo general 7 días.
15. En el punto final experimental, la eutanasia el ratón por dislocación cervical y recoger los riñones para el análisis histopatológico.

Resultados

La aparición de los cambios renales notablemente tras obstrucción ureteral y se convierte en más pálido y tenso a la palpación con el tiempo (Figura 1). Hay una creciente dilatación del uréter proximal a la obstrucción y la pelvis renal. El riñón se vuelve cada vez atrófica como la duración de los aumentos de nefropatía obstructiva con obstrucción prolongada que resulta en una marcada adelgazamiento de la corteza renal y médula. A raíz de la inversión de la obstrucción de la uretra, el color del riñón s...

Discusión

La obstrucción del riñón puede afectar los riñones nativos o trasplantados y resulta en lesión renal y cicatrización. El modelo R-UUO es relevante para la enfermedad humana, ya que los pacientes a menudo presentan obstrucción del tracto renal secundaria a hipertrofia prostática, válvulas uretrales posteriores, etc., que requiere descompresión con pacientes que comúnmente quedan con insuficiencia renal residual significativa que no tiene opciones de tratamiento actuales y eventualmente puede conducir a una enfermedad rena...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijeras de disección romas	Fine Science Tools	14072-10
Tijeras de resorte – rectas	Fine Science Tools	15000-10
Pinzas dentadas	Fine Science Tools	11021-12
Pinzas en ángulo x 2	Fine Science Tools	00649-11
Pinzas rectas	Fine Science Tools	00632-11
Retractor de alambre Colibri 3 cm	Fine Science Tools	17000-03
Portaagujas Castroviejo con cerradura	Fine Science Tools	12565-14
Aplicador de pinzas para heridas	Fine Science Tools	12031-07
Pinzas para bobinar de 7 mm	Fine Science Tools	12032-07
Castroviejo micro portaagujas con cerradura	Fine Science Tools	12060-01
Picomicroscopio OPMI	Carl Zeiss	S100
Almohadilla electrónica	térmica Cozee Comfort	n/a
6/O sutura trenzada de seda	Harvard Apparatus	72-3287
9/O Sutura de Dafilon (poliamida)	B-Braun G1111434
5/O sutura de seda trenzada	Harvard Apparatus	51-7680
Aguja biselada normal, 1 pulgada, 21 G	Becton, Dickinson and Company	305175
1 ml de punta deslizante de jeringa	Becton, Dickinson and Company	300184
Hisopos de papel Wypall	Kimberley-Clark	L40	Esterilizado (Autoclave)
Bastoncillos de algodón	Johnson and Johnson	n/a	Esterilizados (Autoclave)
Cortinas lisas	Guardian	CB03	Esterilizado (autoclave)
Tubo de caucho de			Tubo de silicona: diámetro interno 1,0 mm; diámetro externo 2,0 mm; espesor de pared 0,6 mm
(Lacri-Lube) Parafina blanda blanca 57,3%, aceite mineral 42,5% y alcoholes de lanolina 0,2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidona yodada 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
Vetalar V) Clorhidrato de ketamina	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solución
(Domitor) Clorhidrato de mesetomidina	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml
(Vetergesic) Clorhidrato de bupernorfina	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3 mg/ml
(Antisedán) Hidrochorro de atipamezol	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml
(Adept) 4% Icodextrina	Baxter		Solución de reducción de adherencia
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323

silicona de pared blanda (