Un hidrogel Construct y fibrina enfoque basado Pegamento para ofrecer Terapéutica en un infarto de miocardio modelo murino.

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo aliviar la limitación del injerto celular deficiente para el tratamiento con células madre de infartos de miocardio mediante el uso de un sistema de hidrogel y un pegamento a base de fibrina. Con este enfoque, se puede mantener el contacto célula con tejido después del infarto, aumentando el potencial terapéutico de los agentes beneficiosos en el sitio de la lesión.

Resumen

El modelo de IM murino es ampliamente reconocido en el campo de las enfermedades cardiovasculares, y se ha utilizado sistemáticamente como primer paso para probar la eficacia de los tratamientos in vivo¹. El protocolo tradicional establecido se ha ajustado aún más para minimizar el daño al animal. En particular, las capas de músculo pectoral se separan en lugar de simplemente cortarse, y la toracotomía se aborda intercostalmente en lugar de romper las costillas en una esternotomía, preservando la integridad de la caja torácica. Con estos cambios, el estrés general del animal disminuye.

Las terapias con células madre destinadas a aliviar el daño causado por los IM se han mostrado prometedoras a lo largo de los años por sus beneficios proangiogénicos y antiapoptóticos. Los enfoques actuales de entrega de células a la superficie del corazón generalmente involucran la inyección de las células cerca del sitio dañado, dentro de una arteria coronaria o en el torrente sanguíneo periférico^2-4. Si bien se ha demostrado que las células albergan el miocardio dañado, su funcionalidad está limitada por su escaso injerto en el sitio de la lesión, lo que resulta en la difusión en^{el torrente} sanguíneo. Este manuscrito destaca un procedimiento que supera este obstáculo con el uso de un parche de hidrogel encapsulado en células. El parche se fabrica antes del procedimiento quirúrgico y se coloca en el miocardio lesionado inmediatamente después de la oclusión de la arteria coronaria izquierda. Para adherir el parche en su lugar, se coloca un pegamento de fibrina externo biocompatible directamente sobre el parche, lo que permite que se seque tanto en el parche como en la superficie del corazón. Este enfoque proporciona un nuevo método de adhesión para la aplicación de una delicada construcción terapéutica encapsulante de células.

Introducción

Un infarto de miocardio (MI) se define como la interrupción de la sangre a una región del corazón causada por la oclusión de una arteria coronaria principal. El daño resultante de un MI es debido a la remodelación del tejido cardiaco viable en el tejido de la cicatriz no funcional, lo que disminuye la capacidad del corazón o, más específicamente, el ventrículo izquierdo, a latir correctamente. Esto resulta en una disminución en el volumen de sangre que se puede entregar al cuerpo con cada latido del corazón, conocido como el volumen de carrera, y el porcentaje de sangre que se bombea fuera del corazón con cada latido del corazón, conocida como la fracción de eyección ^6. Estos, junto con otras funciones disminuido, aumenta la tensión en el resto del corazón para mantener la función adecuada. A menudo, este aumento de la tensión puede llegar a ser tan grave que provoca un segundo ataque al corazón, un fenómeno visto en aproximadamente el 10% de los individuos ^7.

Mientras que las prácticas médicas han evolucionado para tratarInmediatamente después de un infarto de miocardio, ninguna técnica ha sido desarrollada para detener, lento o revertir los efectos secundarios negativos de la remodelación de tejidos. Terapias con células madre han surgido como una posible vía para un tratamiento de este tipo, sin embargo, a pesar de su prometedor potencial, las células madre no han demostrado su eficacia en el ámbito clínico. Una teoría para sus deficiencias es la incapacidad para asegurar las células beneficiosos permanecen en el sitio de miocardio tiempo suficiente para generar resultados favorables ^5. Se ha demostrado que no más del 24% de las células que simplemente se inyecta en el lugar de miocardio sobrevivió y se mantuvo en el sitio 1 día después de la entrega dañado ^2. Una posible perspectiva para abordar este problema de la retención de células es el desarrollo de sistemas de hidrogel biocompatible que encapsulan cualquiera de las células o la terapéutica, que pueden ser entregados al sitio dañado. El hidrogel de elección en este protocolo es un poli (etilenglicol) dimetacrilato debido a su uso anterior en pr encapsulación de célulasocedures, sin embargo, cualquier hidrogel capaz de encapsulación se puede utilizar ^8. La entrega del parche directamente al sitio de la lesión asegura el contacto de célula a tejido durante un período prolongado de tiempo, el aumento de la longitud de tiempo, las células pueden proporcionar factores beneficiosos para el miocardio subyacente.

Un cuello de botella para el enfoque de parche es la dificultad de adherir el parche a la superficie del corazón. Muchos grupos han superado este a través de una variedad de técnicas, la más prevalente ser una sutura simple de atar el constructo a la superficie del corazón ^9,10. Esto ha demostrado ser exitosa en una serie de casos en los que el constructo está hecha de un material más rígido, pero falla cuando intento en un sistema de hidrogel, debido a la alta concentración de agua y delicada naturaleza de la construcción de parche. Para superar esto, hemos utilizado un sistema de adhesivo externa pegamento de fibrina que imita la química de la formación de coágulos. El pegamento de fibrina se ha utilizado en numerosas cirugías Medical, IncLuding lágrimas Dura, fístulas bronquiales, y trasplante de córnea, destacando la biocompatibilidad del producto como un sellador herida ^11-13. Además, la fibrina se ha utilizado para una variedad de propósitos cardíacas, incluyendo el tratamiento quirúrgico de las rupturas del ventrículo izquierdo y cirugías de bypass de arteria coronaria, sin embargo, su uso como un pegamento de adherencia para un parche cardíaco no se usa comúnmente ^14-17. Una formulación sencilla de trombina y fibrinógeno resultados en una cola biocompatible que se puede colocar directamente en el exterior de un parche cardíaco externo, proporcionando un sistema de adhesión viable para asegurar el parche a la interacción corazón.

Protocolo

Procedimiento está en plena compatibilidad con número de protocolo IACUC 13.302 y ha sido aprobado por la división de los recursos animales.

1. Preparación de instrumentos

1. Autoclave todos los instrumentos no desechables utilizados antes del procedimiento quirúrgico para garantizar la esterilidad.
2. Esterilizar los instrumentos utilizados varias veces en una sesión con un esterilizador de cuentas de cristal entre usos.

2. Preparación de hidrogel

1. Descongele y células madre placa al menos 24 horas antes de la creación de la construcción de hidrogel.
2. Preparar parches un día antes de la intervención quirúrgica utilizando un aparato de estereolitografía (o instrumento similar) que se ha descrito con todo detalle en publicaciones anteriores ^8,18.
3. Para crear el hidrogel, primero generar un modelo de diseño asistido por ordenador (CAD) del parche deseado y exportar el diseño a formato estereolitográfico (STL).
4. Crear una solución de pre-gel mediante dissolving poli (etilenglicol) dimetacrilato (PEGDMA) en 1X PBS estéril para obtener un 20% w solución / v. Al mismo tiempo, disolver el fotoiniciador 1- [4- (2-hidroxi-etoxi) -fenil] -2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-ona en DMSO. Añadir el fotoiniciador a la solución PEGDMA en una final w / v de 0,5%. Directamente antes de la reticulación, añadir 100 ml de la densidad deseada de las células. Nota: Una densidad celular entre 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ células se recomienda / ml.
5. Pipetear la solución de pre-gel en un plato en el centro de la plataforma de SLA y ejecutar el software SLA con el diseño STL formateado previamente cargado.
6. Retire los parches desde el aparato e incubar los hidrogeles O / N en medio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina para permitir células para ajustar al medio ambiente dentro del parche.

3. Animal Preparación y intubati Oralen

1. Evaluar cada ratón antes del procedimiento para asegurarse de que el animal se encuentra en buen estado de salud, según se determina a partir de sus hábitos de aseo e interacciones con sus compañeros de jaula. Nota: Mujer 8-10 semanas de edad C57BL / 6J se utilizaron para este procedimiento, sin embargo, cualquier edad ratón o tipo pueden ser utilizados.
2. Coloque los animales en una cámara anestésica y exponer a 5% isofluorano con un soporte 1 L / min O _2. Vigilar el nivel de anestesia por reflejo pizca dedo del pie.
3. Una vez que el animal está anestesiado adecuadamente, pesar y colocarlos en el stand de la intubación.
4. Dirigir una fuente de luz hacia la cavidad del pecho del animal y el uso de fórceps para retraer la superficie de laringe y exponer las cuerdas vocales. Guiar con cuidado un G angiocath 20 entre las cuerdas vocales, y suavemente inserte en la tráquea. Detectar la inserción apropiada por un movimiento mecánico de la cavidad del pecho una vez que el catéter se conecta a la pequeña ventilador animal.
5. Ajustar la configuración de ventilación a the peso del animal en base a las instrucciones del fabricante.
6. Una vez intubado, coloque el animal en posición supina sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Asegúrese de que la almohadilla térmica no exceda los 40 ° C. Si es necesario, colocar una barrera entre el animal y la almohadilla de calefacción para minimizar la posibilidad de quemaduras.
7. Retire el cabello del sitio quirúrgico a través del uso de una crema depilatoria. Esterilizar el sitio por 3 matorrales alternas de betadine y etanol al 75% para asegurar una correcta esterilización. Coloque un paño para exponer sólo el lugar de la cirugía, y coloque un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento.

4. Procedimiento Quirúrgico

1. La toracotomía se realiza en el lado izquierdo del animal, por lo tanto, hacer una incisión en la piel de aproximadamente 1 cm a la izquierda del esternón, que corre a lo largo del esternón.
2. El uso de fórceps para separar la capa muscular de la caja torácica subyacente en dos pasos. Observar un delineCIONES línea que representa el pectoral mayor músculos del animal. Levante este músculo ligeramente, separarla del músculo oblicuo externo subyacente y retraer medialmente. A continuación, liberar el músculo oblicuo externo de la caja torácica subyacente de la misma manera, y retraer lateralmente, proporcionando una vista despejada de las segunda, tercera y cuarta costillas.
3. Realice la toracotomía entre las tercera y cuarta costillas. Levantar suavemente la cuarta costilla y utilizar un cauterizador para abrir la cavidad torácica entre las costillas tercera y cuarta. Coloque retractores para abrir aún más la cavidad y exponer el corazón.
4. El uso de fórceps para romper la delgada pericardio del corazón.
5. Ligar la arteria coronaria izquierda con una sutura de nylon monofilamento 8-0. Coloque la sutura aproximadamente 4 mm desde el vértice del corazón, directamente debajo de la punta inferior de la aurícula izquierda. Determinar la colocación de sutura adecuada por un blanqueo del miocardio ventricular y un aumento en el tamaño de la aurícula izquierda después de la suture se ha atado.

5. Colocación de parches y pegamento

1. Mantenga los parches a 37 ° C y 5% de CO ₂ condiciones hasta su uso.
2. Levante suavemente el parche usando una espátula de extremo plano y suavemente colocarlo en la superficie del corazón, en el sitio de miocardio.
   Nota: Para evitar que se salga el ventrículo izquierdo, el parche puede ser mantenido en su lugar por el mantenimiento de la ligera contacto utilizando la espátula o la punta de un par de pinzas.
3. Preparar el pegamento mezclando una proporción de 4: 1 de fibrinógeno a trombina. Mezclar la solución mediante pipeteo repetido hasta que empiece a espesar, generalmente dentro de 1 min después del comienzo de la preparación.
4. Una vez que la viscosidad de la solución alcanza el nivel deseado, transferir rápidamente aproximadamente 10 ml a la superficie del parche. Nota: El tiempo de coagulación de la cola de fibrina es rápida, proporcionando una pequeña ventana de oportunidad para la transferencia eficiente de la cola.

6. La sutura

1. Realizar todas las suturas de cierre utilizando una sutura de nylon monofilamento 6-0.
2. Cierre la capa de costilla con tres y cincuenta y siete suturas interrumpidas individuales.
3. Antes del cierre completo de la capa intercostal, insertar una cánula PE-10 en la incisión para evacuar la cavidad del pecho después del cierre es completo y restablecer la presión intrapleural adecuada.
4. Cierre los músculos pectorales con tres y cincuenta y siete suturas interrumpidas individuales.
5. Sellar la capa de la piel con una sutura continua.
6. Tras el cierre completo, adjunte una jeringa 1,0 ml hasta el final de la cánula y utilizarla para evacuar la cavidad torácica.
7. Aplicar un adhesivo de tejido para el sitio de la incisión para reforzar el sitio de sutura.

Tratamiento 7. Post-quirúrgica

1. Dé ratones una inyección de buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) y carprofeno (2,2 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la ligadura coronaria y menos 20 min antes de la reactivación. Administrar ambos fármacos 6-8 hr después de la cirugía, Y luego dar dos veces al día durante un máximo de tres días para controlar el dolor y la angustia.
2. Continuamente monitorear los animales hasta consciente y cada hora durante la primera después de la cirugía de 4 horas. Realizar un segundo chequeo de la noche de la cirugía (2-4 horas más tarde) para administrar una segunda dosis de analgésico.
3. Monitorear los animales todos los días después de que el segundo día después del procedimiento, hasta que los animales parecen estables.

8. Análisis de la función del corazón y de Histología

1. Realizar ecocardiografías en los ratones 4 semanas siguiendo el procedimiento para determinar la extensión del daño después de la MI.
2. Anestesiar ratones con 4-5% isoflurano dentro de una cámara de anestesia para la inducción de la anestesia de inhalación, y luego 2% de isoflurano a través de mascarilla para el mantenimiento de la anestesia.
3. Despeje el área de imagen con una crema depilatoria y utilizar un pequeño animal de ultrasonido para obtener una exploración ecocardiografía en modo M 2D del corazón que late y registrar los parámetros asso funcionalciados con él.
4. La eutanasia a los ratones en una cámara de dióxido de carbono, a continuación, recoger los corazones de los animales y el lugar en una solución de formalina al 10% durante 24 horas. Después de 24 horas, la transferencia de los corazones de etanol al 70% y mantener a 4 ° C hasta el procesamiento de tejidos.
5. Procesar los corazones y les incrustar en bloques de parafina.
6. Cortar 5 mm secciones a través de la región ventricular del corazón, comenzando en el vértice y que termina en el atrio.
7. Manchas seccionó rebanadas con tanto tricrómico de Masson y hematoxilina y eosina utilizando protocolos estándar.

Resultados

Durante el procedimiento quirúrgico, la ligadura de la arteria coronaria izquierda se puede identificar por un marcado blanqueo de aguas abajo de la arteria ocluida. Como una prueba antes de atar el nudo, la sutura se puede apretar brevemente para comprobar si está en el lugar apropiado. Adicionalmente, puesto que la oclusión de los resultados de la arteria en disminución casi instantánea en la capacidad de la aurícula izquierda a latir correctamente, la aurícula izquierda se agrandará en respuesta a un reflujo de sangr...

Discusión

Con este enfoque para el modelo murino MI, hemos desarrollado un sistema que minimiza el daño a las áreas no miocardio que se asocian con otras técnicas de MI murinos. Estas áreas incluyen los daños causados ​​por una traqueotomía, el corte de la capa muscular, y la rotura de costillas para exponer la cavidad torácica. Creemos que estos cambios mejoran el resultado global gracias quirúrgicos para el cuidado de mantener la mayor cantidad de las principales estructur...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ventilador de ratón modelo 687 de Harvard	Aparato de Harvard	55-0001
Inintech Biosciences LLC Esterilizador de perlas de vidrio seco
Leica MZ6 Kit
	Gemini	GEM 5917
Pinzas delicadas - Puntas de 0,4 mm Herramientas		de ciencia fina en ángulo11063-07
Retractor Agrícola - 3,5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Tijeras de muelle - 2,5 mm Hojas rectas	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Portaagujas - con cerradura de carburo de tungsteno 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Tijeras Iris - Delicadas Rectas 10,5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 sutura monofilamento	Ethicon	8730P
6-0 Sutura de seda	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Adhesivo para tejidos	3M	1469SB

Microscopio quirúrgico Fisher Scientific NC9531961 de cauterización Leica