Introduction
Filamentøse svampe er fremragende modelsystemer til studiet af udviklingsprocesser. De tilbyder flere eksperimentelle fordele som billig dyrkning, høje antal afkom og genetisk tilgængelighed. Det sidste punkt er især relevant for opførelsen af transformanter, der tillader undersøger betydningen af såkaldte langt ukarakteriserede gener for forskellige cellulære mekanismer. Trådsvampe har været medvirkende til belysning af flere elementer og mekanismer i cellulære kvalitetskontrol veje som protease aktivitet for nedbrydning af afvigende proteiner, mitokondrie dynamik for opretholdelse mitokondrie integritet og autophagy til fjernelse af overskud og / eller dårligt fungerende celle komponenter, og for at opretholde celle levedygtighed i tider med sult 1,2,3.
Der er flere eksperimentelle teknikker til rådighed for studiet af autophagy i trådsvampe 2: (i) undersøgelse af vakuoler if de indeholder tætte autophagic organer, når proteaser inhiberes af transmissionselektronmikroskopi 4, (ii) visualisering af autophagosomes ved at overvåge GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi 5,6 og (iii) påvisning af syrnede autophagosomal strukturer ved hjælp af fluorescerende farvestof monodansyl cadaverin 7.
Her er en hidtil ukendt fremgangsmåde til dyrkning af Penicillium chrysogenum for autophagy undersøgelser præsenteres. Det vigtigste element er den "sult pad", som blot består af 1% agarose opløst i steriliseret vand fra hanen. Yderligere forbindelser (f.eks stressfaktorer, scavengers, autophagy modulatorer) kan tilsættes til puden, så længe de ikke udviser auto-fluorescens. Puden er placeret i mikroskopobjektglas, der indeholder en lavvandet centralt hulrum. Denne pude i podet enten med en sporesuspension eller med små mycelium fragmenter. Sidstnævnte er tilrådeligt, hvis stamme af interesse ikke sporulate effektivt (f.eks Δ atg1 stammer 8). Objektglassene anbringes i våde kamre (disse kan let konstrueres ved anvendelse af tomme pipette tip bokse) for at forhindre udtørring af prøven og inkuberes ved stuetemperatur. P. chrysogenum er i stand til at vokse i et par dage under disse betingelser. Autophagy kan observeres mikroskopisk ved vakuolær udvidelse, som er en positiv markør for svampe autophagy. I dette bidrag en P. chrysogenum stamme (Wisconsin 54-1255) anvendes der danner grønt fluorescerende protein, der er målrettet til peroxisomer ved sin C-terminale "SKL 'sekvens 9. Derfor er det muligt at overvåge nedbrydningen af peroxisomer. Det er muligt også at mærke andre rum i cellen (f.eks mitochondrier) ved anvendelse af passende lokaliseringssignaler og analysere deres nedbrydning. Selvom data fra P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) præsenteres her, det er bestemt muligttil også at bruge den "sult pad 'metode til andre trådsvampe (fx Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af P. chrysogenum for sult Eksperimenter
- Hvis P. chrysogenum stamme af renter holdes på ris (»grønne ris«), placere 2-3 riskorn dækket med sporulerende mycelium i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fyld den med 500 pi Ygg (10 g / l KCl, 20 g / l glucose, 10 g / l gærnitrogenbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gærekstrakt).
- Vortex røret i 30 sek, således at sporerne kan løsnes fra ris effektivt.
- Inkubér rør i 1 dag ved stuetemperatur (f.eks, mellem 20 og 25 ° C).
- Forbered en 1/50 fortynding denne sporesuspension i sterilt vand fra hanen af, bland godt.
- Hvis P. chrysogenum stamme af interesse holdes på en agarplade (f.eks Ygg agarplade), overføre små stykker af myceliet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 400 pi sterilt postevand og ca. 100 mg glass perler ved hjælp af en steril tandstikker eller pipettespids.
- Vortex røret i 2 min, så myceliet bliver fragmenteret. Bruge indholdet af røret straks.
2. forberedelser til Dyrkning af P. chrysogenum på Sult Pads
- Tænd et varmeplade og sæt den til ca. 60 ° C.
- 2 g agarose opløses i 100 ml ledningsvand ved kogning af opløsningen i en mikrobølgeovn. Sørg for, at denne opløsning er fuldstændig klar efter opvarmning. Hvis det ikke er, koge det igen, før agarose opløses fuldstændigt. Lad agaroseopløsning afkøle til ca. 60 ° C før brug.
- Fyld 1,5 ml mikrocentrifugerør (2-4, afhængigt af antallet af prøver) med 400 ul sterilt postevand hver (ingen yderligere forbindelser tilsat) eller 400-x pi (tilføjelse af x pi af forbindelse opløsning i trin 2.5) og placere dem på varmepladen i mindst 1 min, så watER inde bliver varmt.
- Placer objektglas, som indeholder et centralt hulrum på varmepladen i mindst 1 min.
- Tilsæt 400 pi 2% agarose til opløsningen i de 1,5 ml mikrocentrifugerør og vortex kortvarigt. Efter dette trin, hvis det ønskes, tilsættes yderligere forbindelser (dvs. 1 uM rapamycin). Hvis dette gøres, vortex kort efter hver yderligere stof pipetteres til røret. Sæt rørene tilbage på opvarmning tabellen at forhindre for tidlig størkning.
BEMÆRK: Den samlede volumen i mikrocentrifugerør bør være 800 pi.
3. Fremstilling af Mikroskopdias indeholdende Sult Pads
- Pipette 140 pi af agaroseopløsning i hulrummet af objektglasset (som stadig er placeret på varmepladen). Prøv at undgå at gøre bobler, hvis muligt.
- Umiddelbart placere et dækglas på agaroseopløsning.
BEMÆRK: Dette vil resultere i en flad overflade. - Sæt mikroanvendelsesområde glide på laboratoriebordet i ca. 4 min for at tillade agarose pad at størkne.
- Fjern forsigtigt dækglasset fra agarose pad ved at skubbe det ud med hjælp fra en tommelfinger eller pegefinger (brug handsker for at undgå kontaminering!).
- Placer objektglas med puden til en våd kammer for at forhindre udtørring. Anbefaling: Brug en tom tip boks, der stadig har indsatsen for at holde pipettespidser. Tilføj sterilt vand til kassen, således at bunden er dækket. Placer mikroskopobjektglas på indsatsen og lukke kassen.
4. pode sult Pads med P. chrysogenum og Inkubation
- Afpipetteres 5 pi af 1/50 spore fortynding (hvis kulturerne blev dyrket på ris) eller 5 pi af den ufortyndede opløsning indeholdende mycelium fragmenter (hvis de blev dyrket på en agarplade) på midten af sult pad.
- Luk våde kammer og pak det i en plasticpose (dette fungerer somyderligere beskyttelse mod udtørring af sult puder). Pas på ikke at flytte kassen for meget, fordi ellers podningen dråber vil blive forstyrret.
- Opbevar indpakket æske ved stuetemperatur i mindst 20 timer før analyse af prøverne.
5. Mikroskopisk analyse af prøverne
- Efter 20 timer inkubation prøverne er klar til mikroskopisk analyse; sætte objektglas på tørt tissuepapir (bunden tendens til at blive våd).
- Pipette en lille mængde vand (ca. 50 pl) på sult pad. Læg et dækglas på puden og pres overskydende vand. Fjern overskydende vand med et filtrerpapir.
- Sæt objektglas på observation tabel fluorescensmikroskop. For at få et overblik over mycelium vækst, brug en 20X mål. Brug 63x eller 100X mål for at studere lokaliseringen af GFP i hyferne. For at forhindre en gradvis udtørring af stikprøven ikke analysere prøver tillængere end 15 minutter, før du sætter dem tilbage i den våde kammer.
- Gentag 5.3 med jævne mellemrum (f.eks, efter 40 timer og 60 timer af vækst).
BEMÆRK: Prøven kan sættes tilbage i den våde kammer. Det er ikke nødvendigt at fjerne dækglasset som det ikke påvirker mycelievækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere anvendeligheden af protokollen beskrevet ovenfor peroxisome nedbrydning i P. chrysogenum stamme Ws54-1255 (GFP-SKL) blev analyseret. I denne stamme GFP-SKL normalt importeres til peroxisomer 9. Dette resulterer i forekomsten af flere sfæriske former, når prøven analyseres via fluorescensmikroskopi. Hvis autophagy sker, vakuoler forstørre. GFP-SKL bliver inkorporeret i vakuoler ved autophagy (pexophagy). På grund af det faktum, at GFP er resistent over for nedbrydning af vacuole proteaser det etiketter disse organeller 10. Derfor de to parametre for at observere autophagy (pexophagy) i denne stamme, vakuolen udvidelse og lokalisering af GFP-SKL til vakuoler, er bekvemt overvåges ved fluorescens mikroskopi.
Ved 20 timers inkubation er GFP aldrig observeret i vakuoler (figur 1). Desuden er vakuole udvidelse ikke finder sted. Men ved 40 timer af vækst- GFP-mærkede vakuolerbliver synlige i nogle af hyfer, indikerer autophagy (pexophagy) at blive aktiv (figur 1). Ved 60 timer vækst mængden af GFP-mærkede vakuoler er steget yderligere. Som en negativ kontrol en Δ atg1 mutant af P. chrysogenum blev anvendt (Δ atg1 (GFP-SKL)) (figur 2). Hverken forstørrede eller GFP-mærkede vakuoler kan observeres i denne stamme. Som en positiv kontrol, er autophagy-stimulerende lægemiddel rapamycin anvendes (figur 3). Efter 40 timers vækst GFP-mærkede vakuoler bliver synlige. Ved 60 timer, er det hyfer helt fyldt med enorme GFP-holdige vakuoler (figur 3). Dette fund viser, som forventet, massiv autophagy foregår her. Tilsammen viser disse resultater gyldigheden af den eksperimentelle opsætning.
Figur 2:. Lokalisering af GFP-SKL i Δ atg1 (GFP-SKL) under dyrkning på sult pads på de angivne tidspunkter, blev kulturer dyrket på sult pads analyseret under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Repræsentative billeder er vist for hvert tidspunkt. Tilsvarende lyse felt områder er vist nedenfor hver fluorescenskanal image. Scale barer: 10 pm. 
Figur 3:. Lokalisering af GFP-SKL i Ws54-1255 (GFP-SKL) behandlet med rapamycin til fremkaldelse af autophagy på de angivne tidspunkter kulturer dyrket på sult pads suppleret med 1 uM rapamycin blev analyseret under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Repræsentative billeder er vist for hvert tidspunkt. Tilsvarende lysfelt områder er vist nedenfor hver fluorescens kanal billede. White "v": GFP-SKL lokaliseret til vakuoler angiver peroxisom nedbrydning. Scale barer: 10 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenteres her metode gør det muligt praktisk og reproducerbar undersøgelse af autophagy i P. chrysogenum. For eksempel kan den anvendes til screening af virkningen af forskellige forbindelser, om de er i stand til at modulere autophagy reaktion af denne svamp eller ej. Resultaterne med rapamycin viser, at inhibering af TOR signalering fører til en udtalt induktion af autophagy i P. chrysogenum som også er blevet påvist for andre organismer 11.
Det er muligt at anvende mycelier dyrket på sult puder til analyse i mere avancerede mikroskoper (f.eks konfokale laser scanningmikroskoper). Det er ligegyldigt, om prøven er sat under målet om over målet (omvendt mikroskop). Forskellige fluorescerende proteiner målrettet til bestemte rum kan anvendes til at overvåge skæbnen af forskellige organeller i autophagy (fx mitochondrier -> mitophagy; endoplasmatiske reticulum -> ER-phagy osv).. Sammenfattende her beskrevne teknik udvider spektret af metoder til mikroskopisk undersøgelse svampe 12.
Protokollen er generelt ligetil og let at bruge. Men det er meget vigtigt, at sult pads aldrig tørre ud, da dette vil resultere i artefakter og celledød. Derfor er det kraftigt antydet, at (i) de objektglas, der indeholder den endnu flydende agaroseopløsning straks fjernes fra varmepladen (trin 3.3), (ii) at dækglasset for at gøre en flad overflade fjernes fra sult pad efter en maksimalt 5 min (trin 3.3 og 3.4), (iii) at objektglasset altid holdes i det våde kammer, når ikke analyseret (trin 3.5 og 5.4) og (iv) at mikroskopisk analyse ikke tage mere end 15 minutter (trin 5.3). Et andet vigtigt aspekt er, at grundbeløbet for sporer eller myceliefragmenter pipetteret på sult pad bør ikke være for højt ellerfor lav. Dette kan let kontrolleres ved fortynding af bestanden ved anvendelse af sterilt postevand. Den 1/50 fortynding beskrevet i 1.1.3 fungerer godt for P. chrysogenum sporesuspensioner. Det er den anbefalede fortynding til brug sammen med vores svampe, men kan kræve nogle justeringer.
En begrænsning ved metoden er, at det ikke er tilrådeligt for time-lapse billeddannelse eksperimenter i mere end 15 min. Dette skyldes den gradvise udtørring af sult pad når den er fjernet fra det våde kammer. Hvis længere observation tider er brug for det er muligt at tilføje små mængder sterilt postevand til udkanten af sult pad selv om dette ikke forhindre nogle udtørring i de centrale områder af puden. En anden begrænsning er, at fremgangsmåden ikke er strengt kvantitative. I encellede organismer er det muligt at score events per celle (fx mængden af celler indeholdende GFP i vacuolen). I modsætning hertil P. chrysogenum som en filamentøs svamp er characterized af en flercellet arkitektur. Celler divideret med septae, der indeholder en central pore, der tillader passage af cytoplasmaet og organeller. Derfor prøver kan kun analyseres »semi kvantitativt« (f.eks antal hyfer indeholder GFP lokaliseret til vakuoler). For at opnå betydning er det meget vigtigt at antallet af hyfer analyseret er høj nok (mindst 80 tidspunkt og tilstand testet, men mere definitivt at foretrække).
Udnyttelsen af sult puder til at studere autophagy kan let tilpasses til brug i andre filamentøse fungi. Derfor protokollen fremlagt her, er ikke kun begrænset til P. chrysogenum. Det bør også være muligt at tilpasse det til med encellede svampe, dvs. gær. Overførsel af protokollen til højere organismer (fx nematoder) kræver nok mere specialiserede tilpasninger. Det bliver interessant at se, om der er beskrevet i denne arbejdsmetode også finderdets anvendelse i andre områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R.
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C.
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H.
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
