Introduction
Filamenteuze schimmels zijn uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen. Ze bieden verschillende experimentele voordelen zoals goedkope teelt, de hoge aantallen van de nakomelingen en genetische toegankelijkheid. Het laatste punt is van bijzonder belang voor de bouw van transformanten die het mogelijk maken het onderzoek naar het belang van zo-ver uncharacterized genen voor verschillende cellulaire mechanismen. Schimmels zijn voor het ophelderen van verschillende elementen en mechanismen van cellulaire kwaliteitscontrole trajecten protease activiteit voor de afbraak van afwijkende eiwitten, mitochondriale dynamiek lid voor het handhaven mitochondriale integriteit en autophagy voor het verwijderen van overtollige en / of disfunctionele celbestanddelen en onderhouden levensvatbaarheid van de cellen in tijden van hongersnood 1,2,3.
Er zijn verschillende experimentele technieken beschikbaar voor de studie van autofagie in draadschimmels 2: (i) onderzoek vacuolen if zij dichte autofagocytische lichamen vertonen wanneer proteasen worden geremd door transmissie elektronenmicroscopie 4, (ii) visualisatie van autofagosomen door toezicht GFP-Atg8 foci via fluorescentiemicroscopie 5,6 en (iii) detectie van aangezuurde autophagosomal structuren met de fluorescerende kleurstof monodansylcadaverine 7.
Hier wordt een nieuwe kweekmethode Penicillium chrysogenum voor autophagy studies gepresenteerd. Het belangrijkste element is de 'honger pad' die gewoon bestaat uit 1% agarose opgelost in gesteriliseerd kraanwater. Extra verbindingen (bijv stressoren, scavengers, autophagy modulatoren) worden aan de pad toegevoegd zolang zij niet automatisch fluorescentie geven. Het pad ligt in de microscoop dia's die een ondiepe centrale holte bevatten. Deze pad in geënt ofwel met een sporesuspensie of met kleine mycelium fragmenten. Dit laatste is geboden als de stam van belang niet sporulate efficiënt (bijv Δ atg1 stammen 8). Monsters worden geplaatst in vochtige kamers (deze kunnen gemakkelijk worden geconstrueerd met behulp lege pipetpunt dozen) verdroging voorkomen dat het monster en geïncubeerd bij kamertemperatuur. P. chrysogenum kan groeien enkele dagen onder deze omstandigheden. Autofagie kan microscopisch worden waargenomen door de vacuole uitbreiding, die een positieve marker voor schimmel autofagie. In deze bijdrage, een P. chrysogenum stam (Wisconsin 54-1255) gebruikt die groen fluorescent eiwit dat is gericht naar peroxisomen door zijn C-terminale 'SKL-sequentie 9 vormt. Daarom is het mogelijk om de afbraak van peroxisomen controleren. Het is mogelijk om ook labelen andere compartimenten van de cel (bijvoorbeeld mitochondria) waarbij geschikte lokalisatie signalen en hun degradatie analyseren. Hoewel gegevens van P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) wordt hier voorgesteld, is het zeker mogelijkde "honger pad methode ook voor andere filamenteuze schimmels (bijvoorbeeld Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus species, etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van P. chrysogenum voor de Verhongering Experimenten
- Als de P. chrysogenum stam van belang wordt van rijst (groene rijst ") gehouden, plaats 2-3 rijstkorrels bedekt met sporulerende mycelium in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Vul het met 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l glucose, 10 g / l giststikstofbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gistextract).
- Vortex de buis gedurende 30 seconden zodat sporen efficiënt losmaken van de rijst.
- Incubeer de buis gedurende 1 dag bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld tussen 20 en 25 ° C).
- Bereid een 1/50 verdunning van deze sporesuspensie in steriel leidingwater, meng goed.
- Als de P. chrysogenum stam van belang wordt op een agarplaat (bijv YGG agarplaat) gehouden, maken kleine stukjes van het mycelium in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 400 ul steriel kraanwater en ongeveer 100 mg glass kralen met behulp van een steriele tandenstoker of pipettip.
- Vortex de buis gedurende 2 minuten, zodat het mycelium gefragmenteerd. Met de inhoud van de buis onmiddellijk.
2. voorbereidende stappen voor de teelt van P. chrysogenum op Verhongering Pads
- Schakelen op een verwarmingsplaat en zet deze op ongeveer 60 ° C.
- Los 2 g agarose in 100 ml leidingwater door koken van de oplossing in een magnetron. Zorg ervoor dat deze oplossing is volledig helder na verhitting. Zo niet, koken totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de agarose oplossing afkoelen tot ongeveer 60 ° C vóór gebruik.
- Vul 1,5 ml microcentrifuge buizen (2-4, afhankelijk van het aantal monsters) met 400 pl steriel leidingwater per (geen additionele verbindingen toegevoegd) of 400 x gl (toevoeging van x gl van verbinding oplossing in stap 2.5) en plaats ze op de verwarmingsplaat gedurende tenminste 1 minuut zodat het wateh binnenkant wordt warm.
- Plaats objectglaasjes die een centrale holte bevat op de verwarmingsplaat gedurende tenminste 1 minuut.
- Voeg 400 ul 2% agarose aan de oplossing in 1,5 ml microcentrifuge buizen en vortex kort. Na deze stap, indien gewenst, voeg additionele verbindingen (dwz 1 uM rapamycine). Wanneer dit gebeurt, vortex kort na elke bijkomende stof wordt gepipetteerd op de buis. Plaats de buizen weer op de verwarmings- tafel om voortijdige stolling te voorkomen.
OPMERKING: Het totale volume in de microcentrifugebuis moet 800 pi.
3. Voorbereiding van Microscope Slides bevattende Verhongering Pads
- Pipetteer 140 ul van de agarose oplossing in de holte van het microscoopglaasje (die nog steeds op de verwarmingsplaat). Probeer te voorkomen dat bellen indien mogelijk.
- Plaats onmiddellijk een dekglas op de agarose-oplossing.
Opmerking: Dit resulteert in een plat vlak. - Zet het microreikwijdte dia op het lab bank voor ongeveer 4 minuten om de agarose pad te stollen.
- Verwijder voorzichtig het dekglaasje uit de agarose pad door af te schuiven met de hulp van een duim of wijsvinger (draag handschoenen om besmetting te voorkomen!).
- Plaats de microscoop dia met de pad in een natte kamer om uitdroging te voorkomen. Aanbeveling: Gebruik een lege tip doos die nog steeds heeft het inzetstuk voor het vasthouden van de pipet tips. Voeg steriel water om de doos, zodat de bodem bedekt is. Plaats de microscoop dia's op te voeren en sluit de doos.
4. inenten van de Verhongering Pads met P. chrysogenum en Incubation
- Pipetteer 5 ul van de verdunning 1/50 spore (indien de kweken werden gekweekt op rijst) of 5 pl van de verdunde oplossing die mycelium fragmenten (indien de kweken werden gekweekt op een agar plaat) op het midden van de honger pad.
- Sluit de natte kamer en wikkel het in een plastic zak (dit dient alsextra bescherming tegen uitdrogen van de hongerdood pads). Wees voorzichtig niet om de doos te bewegen te veel, want anders wordt de inenting druppels zal worden verstoord.
- Bewaar het verpakte doos bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 uur voor analyse van de monsters.
5. Microscopische analyse van de monsters
- Na 20 uur incubatie van de monsters zijn klaar voor microscopische analyse; zet de microscoop dia op droge tissue papier (de onderkant heeft de neiging om nat is geworden).
- Pipetteer een kleine hoeveelheid water (ongeveer 50 ui) op de uithongering pad. Zet een dekglaasje op het pad en knijp het overtollige water. Verwijder het overtollige water met een tissue.
- Zet de microscoop dia op de observatie tafel van de fluorescentie microscoop. Voor een overzicht van mycelium groei te krijgen, gebruik dan een 20X objectief. Gebruik 63x of 100x voor het bestuderen van de lokalisatie van GFP in de hyfen. Om een geleidelijke uitdroging voorkomen dat het monster niet analyseren monsterslanger dan 15 minuten voordat u ze weer in de natte kamer.
- Herhaal 5.3 op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld na 40 uur en 60 uur van groei).
OPMERKING: Het monster kan worden teruggeplaatst in de natte kamer. Het is niet noodzakelijk om het dekglaasje verwijderd omdat het geen invloed myceliumgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het nut van de bovenstaande protocol peroxisoomafbraak beschreven in P. tonen chrysogenum stam Ws54-1255 (GFP-SKL) werd geanalyseerd. In deze stam GFP-SKL wordt meestal geïmporteerd in peroxisomen 9. Dit resulteert in het verschijnen van meerdere bolvormen wanneer het monster wordt geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. Als autofagie optreedt, vacuolen vergroten. GFP-SKL wordt in vacuolen opgenomen door autofagie (pexophagy). Vanwege het feit dat GFP is tegen afbraak door proteasen vacuole te labelt deze organellen 10. Daarom zijn de twee parameters voor het observeren van autofagie (pexophagy) in deze stam, vacuole uitbreiding en lokalisatie van GFP-SKL aan vacuolen, zijn gunstig gecontroleerd door fluorescentie microscopie.
Bij 20 uur incuberen, wordt GFP nooit waargenomen in vacuolen (figuur 1). Ook is vacuole uitbreiding niet plaatsvindt. Echter, 40 uur groei-GFP gemerkte vacuolenzichtbaar in sommige van de hyfen worden, aangeeft autophagy (pexophagy) actief (figuur 1) worden. Bij 60 uur van groei de hoeveelheid GFP gemerkte vacuolen verder toegenomen. Als negatieve controle een Δ atg1 mutant van P. chrysogenum werd gebruikt (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figuur 2). Noch vergrote noch GFP gemerkte vacuolen kunnen worden waargenomen in deze stam. Als positieve controle, wordt de-autofagie stimulerende drug rapamycine gebruikt (figuur 3). Na 40 uur groei-GFP gemerkte vacuolen zichtbaar. Bij 60 uur, worden de hyfen volledig gevuld met enorme GFP-bevattende vacuolen (figuur 3). Deze bevinding geeft aan dat, zoals verwacht, massieve autofagie vindt hier plaats. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan de geldigheid van de experimentele opstelling.
Figuur 2:. Lokalisatie van GFP-SKL in Δ atg1 (GFP-SKL) tijdens de teelt op uithongering pads op de aangegeven tijdstippen, cultures gekweekt op uithongering pads werden geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie. Representatieve beelden worden weergegeven voor elk tijdstip. Overeenkomstige helder veld gebieden worden hieronder elk fluorescentie getoondafbeelding kanaal. Schaalbalken: 10 pm. 
Figuur 3:. Lokalisatie van GFP-SKL in Ws54-1255 (GFP-SKL) behandeld met rapamycine voor de inductie van autofagie Op de aangegeven tijden cultures gekweekt op uithongering pads aangevuld met 1 uM rapamycine werden geanalyseerd met fluorescentiemicroscopie. Representatieve beelden worden weergegeven voor elk tijdstip. Overeenkomstige helder veld gebieden worden elk beeld fluorescentiekanaal hieronder weergegeven. White "v": GFP-SKL gelokaliseerd op vacuoles aangeeft peroxisoomafbraak. Schaalbalken: 10 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode maakt het handig en reproduceerbare studie van autofagie in P. chrysogenum. Zo kan het worden gebruikt voor het screenen van de effectiviteit van verschillende verbindingen of zij kunnen moduleren de autophagy respons van deze schimmel of niet. De resultaten met rapamycine bewijzen dat remming van TOR signaal leidt tot een uitgesproken inductie van autofagie in P. chrysogenum die is ook aangetoond voor andere organismen 11.
Het is mogelijk om mycelium gekweekt op uithongering pads voor analyse meer geavanceerde microscopen (bijvoorbeeld, confocale laser scanning microscoop) gebruikt. Het maakt niet uit of het monster onder het doel wordt gezet boven de doelstelling (omgekeerde microscoop). Diverse fluorescente proteïnen doelgericht bepaalde compartimenten kunnen worden gebruikt om het lot van verschillende organellen tijdens autophagy (bijvoorbeeld mitochondria bewaken -> mitofagie; endoplasmatisch reticulum -> ER-phagy, etc.).. Samengevat, de hier beschreven techniek breidt het spectrum van methoden voor microscopische studie schimmels 12.
Het protocol is doorgaans eenvoudig en makkelijk te gebruiken. Het is echter belangrijk dat de honger pads niet uitdrogen omdat dit zal resulteren in artefacten en celdood. Daarom wordt sterk gesuggereerd dat (i) de microscoopglaasjes met de nog vloeibare agarose oplossing worden onmiddellijk uit de verwarmingsplaat (stap 3.3), (ii) de dekglas voor het maken van een vlak oppervlak uit de honger pad na maximaal 5 min (stappen 3.3 en 3.4), (iii) het microscoopglaasje bevindt zich altijd in de vochtige kamer bij niet geanalyseerd (stap 3.5 en 5.4) en (iv) microscopische analyse meer dan 15 minuten geen rekening (stap 5.3). Een ander belangrijk aspect is dat het basisbedrag van sporen of myceliumfragmenten gepipetteerd op de hongerdood pad niet te hoog moet zijn ofte laag. Dit kan eenvoudig worden gecontroleerd door verdunning van de voorraad met behulp van steriel leidingwater. De 1/50 verdunning in 1.1.3 beschreven werkt goed voor P. chrysogenum sporensuspensies. Het is de aanbevolen verdunning voor gebruik met onze schimmels maar kunnen enige aanpassingen.
Een beperking van de methode is dat het niet wenselijk is voor time-lapse imaging experimenten meer dan 15 min. Dit komt door de geleidelijke uitdroging van de honger pad eenmaal is verwijderd uit de vochtige kamer. Als langere observatie tijden nodig zijn is het mogelijk om kleine hoeveelheden steriel leidingwater toe te voegen aan de rand van de hongerdood pad, hoewel dit niet voorkomen dat sommige verdroging in centrale regio's van de pad. Een andere beperking is dat de methode niet strikt kwantitatief. In eencellige organismen is het mogelijk om gebeurtenissen per cel score (bijvoorbeeld aantal cellen die GFP in de vacuole). Daarentegen, blz chrysogenum een filamenteuze schimmel karaktoriseerde door een meercellige architectuur. Cellen worden gedeeld door septae die een centrale porie die de passage van cytoplasma en organellen toelaat bevatten. Daarom monsters kunnen alleen worden geanalyseerd semi kwantitatief (bijvoorbeeld aantal hyfen die GFP gelokaliseerd vacuolen). Om significantie te bereiken is het belangrijk dat het aantal geanalyseerde hyfen hoog genoeg (ten minste 80 per tijdstip en conditie maar getest definitief voorkeur).
Het gebruik van honger pads voor het bestuderen autophagy kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in andere filamenteuze schimmels. Daarom is het protocol hier gepresenteerde is niet alleen beperkt tot P. chrysogenum. Het moet ook mogelijk zijn om te passen voor met eencellige schimmels, dwz gisten. Overdracht van het protocol bij hogere organismen (bijvoorbeeld nematoden) waarschijnlijk vereist meer gespecialiseerde aanpassingen. Het zal interessant zijn om te zien of het in dit werk beschreven methode ook vindtzijn gebruik in andere gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R.
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C.
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H.
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
