Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.
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Artículo de método
De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de dos fotones (2P) se utiliza para revelar la dinámica celular y las interacciones en lo profundo de los tejidos vivos e intactos. Aquí, presentamos un método para obtener imágenes de células vivas en la médula espinal murina. Esta técnica es especialmente adecuada para analizar la dinámica de las células precursoras neurales (NPC) después del trasplante en la médula espinal que sufre trastornos desmielinizantes neuroinflamatorios. Los NPC migran a sitios de daño axonal, proliferan, se diferencian en oligodendrocitos y participan en la remielinización directa. Por lo tanto, las NPC son un tratamiento terapéutico prometedor para mejorar las enfermedades desmielinizantes crónicas. Debido a que las NPC trasplantadas migran a las áreas dañadas en el lado ventral de la médula espinal, las imágenes 2P intravitales tradicionales son imposibles, y anteriormente solo se disponía de información sobre las interacciones estáticas mediante enfoques de tinción histoquímica. Aunque este método se generó para obtener imágenes de NPC trasplantadas en la médula espinal ventral, se puede aplicar a numerosos estudios de células trasplantadas y endógenas en toda la médula espinal. En este artículo, demostramos la preparación y la obtención de imágenes de una médula espinal con axones fluorescentes mejorados que expresan proteínas fluorescentes amarillas y NPC trasplantadas que expresan proteínas fluorescentes verdes mejoradas.
Introducción
Los modelos de ratón de desmielinización, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la infección intracraneal con virus de la hepatitis del ratón neuroadapted (MHV), son excelentes herramientas para estudiar las vías moleculares y las interacciones celulares asociados con la enfermedad. Han liderado y apoyado la eficacia de las terapias farmacéuticas aprobado por la FDA, destinado principalmente a la cesación de la autoinmunidad y la inflamación 1. Sin embargo, una vez que la remielinización endógena ha fracasado, las terapias aprobadas actualmente no reparan efectivamente lesiones de desmielinización en el sistema nervioso central. Por ....
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Protocolo
Declaración de Ética: NOTA: El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, Irvine, protocolo # 2010-2943.
1. La eliminación de la médula espinal
- Coloque toallas de papel humedecidas con isoflurano líquido ~ 100%, USP en cámara de la eutanasia y colocar toallas de papel secas en la parte superior. Coloque el ratón en la cámara encima de las toallas de papel secas así ratón no está tocando el isoflurano y asegúrese de que la cámara se cubre. Espere al menos un minuto después de la interrupción de la respiración para asegurarse de ....
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Resultados
Aunque el protocolo de formación de imágenes de la médula espinal explantado se puede utilizar para visualizar cualquier fluorescencia dentro de la médula espinal, nuestros resultados representativos demuestran interacciones eGFP-NPC con EYFP-axones. En primer lugar, se muestra la preparación de la médula espinal ventral incrustado en la Figura 1A. A continuación, se muestra la configuración 2P microscopio y componentes clave en la Figura 1B. La Figura 2 demuestra eGFP y eYFP fluo.......
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Discusión
En tiempo real se requiere 2P imágenes de tejido intacto para investigar la cinética de la APN y las interacciones tras el trasplante en el ratón desmielinizada médula espinal. Intravital de imágenes 2P se utiliza comúnmente para determinar la dinámica celular en el lado dorsal de la médula espinal en ratones vivos, y ha sido utilizado para estudiar la desmielinización dorsal en enfermedad desmielinizante 17-19. Sin embargo, debido NPC trasplantados migran a la materia blanca ventral, que se encuentra demasia.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 GM-41514 (a M.D.C.), R39 GM-048071 (a I.P.) y R01 NS-074987 (a T.E.L.) y el Premio de Investigación del Centro Colaborativo de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (NMSS) CA1058-A-8 (a C.M.W., T.E.L. y M.D.C.), subvención NMSS RG4925, Beca de capacitación de NIH T32-AI-060573 (a M.L.G.), Beca postdoctoral NMSS FG 1960-A-1 (a J.G.W.), y financiación de la Fundación George E. Hewitt para la Investigación Médica (M.P.M.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Isoflurano, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A Tijeras | |
| finas | Fine Science Tools | 14060-09 hoja de | afilada |
| #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| mango de bisturí | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe pinzas | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Tijeras Vannas | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| bisturí #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarosa, baja temperatura de gelificación | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (adhesivo para tejidos) | 3M | 1469SB | |
| Cubreobjetos cuadrados de 22 mm | Fisher Scientific | 12-547 | |
| Objetivo de inmersión 25X, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Calentador de solución en línea simple | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Divisor de haz dicroico de un solo filo de 520 nm | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm divisor de haz dicroico de un solo borde | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | |
| Tubos fotomultiplicadores | Hamamatsu | R928 | |
| C/L bomba de tubos de velocidad variable | Masterflex | 77122-22 | |
| termómetro digital | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Láser de zafiro | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
Referencias
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G.
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Reimpresiones y permisos
