Artículo de método

Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

DOI:

10.3791/52589

⸱

20 de abril de 2016

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1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Boston Children's Hospital, Division of Gastroenterology, Harvard Medical School, 3Humanitas Clinical and Research Center

En este artículo

Resumen

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La piel alberga una compleja red de células inmunitarias. Describimos una metodología eficiente para la digestión de piel de ratón, procedente de diferentes partes del cuerpo del animal, con el fin de obtener una suspensión unicelular y analizar las diferentes poblaciones de leucocitos residentes en la piel mediante citometría de flujo.

Resumen

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La piel es un órgano barrera que interactúa con el entorno externo. Al estar continuamente expuestas a una posible invasión microbiana, la dermis y la epidermis albergan una variedad de células inmunitarias tanto en condiciones homeostáticas como inflamatorias. Por lo tanto, las herramientas para obtener la liberación de células de la piel para los análisis citofluorimétricos son muy útiles para estudiar la compleja red de células inmunitarias que residen en la piel y su respuesta a los estímulos microbianos. En este trabajo describimos una metodología eficiente para la digestión de la piel de ratón con el fin de obtener suspensiones unicelulares de forma rápida y eficiente. Este protocolo permite mantener la máxima viabilidad celular sin comprometer la expresión de antígenos de superficie. También describimos cómo tomar y digerir muestras de piel de diferentes lugares anatómicas, como la oreja, el tronco, la cola y la almohadilla de la pata. A continuación, las suspensiones obtenidas se tiñen y se analizan mediante citometría de flujo para discriminar entre diferentes poblaciones de leucocitos.

Introducción

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La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo y su gran superficie está continuamente expuesta al entorno externo. Por lo tanto, la piel tiene que proteger al organismo de posibles amenazas para mantener la homeostasis, tanto por medios físicos como proporcionando una protección activa contra la posible entrada de patógenos. De manera similar a la mucosa intestinal y pulmonar, la piel alberga una variedad de células inmunitarias que interactúan continuamente con el epitelio para mantener la vigilancia inmunitaria. Este complejo sistema que involucra tanto a las células inmunitarias como a las no inmunitarias de la piel ha sido reconocido desde los primeros día....

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Protocolo

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de aprobación del estudio: Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano (Roma, Italia) de acuerdo con el Decreto Legislativo 27 de Enero de 1992, n. 116 "attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini sperimentali o ad altri Fini scientifici."

1. Obtención de las muestras de piel

  1. La eutanasia el ratón por dislocación cervical.
  2. Oreja:
    1. Cortar la parte sin pelo de las orejas del ratón.
    2. dorsal separada y parte ventral mediante tracción con fórceps. Eliminar cualquier resto de cartílagos, raspando suavemente la ....

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Resultados

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La piel de diferente región del cuerpo se digirió de acuerdo con el protocolo descrito y se tiñeron con los anticuerpos indicados. La estrategia gating se representa en la Figura 1. En primer lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), entonces la puerta en singletes (FSC-A vs. FSC-W) y en células con morfología de linfocitos (FSC frente a SSC-A-A). Cuando esté indicado, se seleccionan las células CD45 + de origen hematopoyético.

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Discusión

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Hemos descrito un método para la preparación de suspensiones de una sola célula a partir de diferentes regiones de la piel del ratón. El método de la digestión hemos adoptado, no sólo da altos rendimientos sino que también conserva la expresión de marcadores de superficie, que es fundamental para el posterior análisis de FACS.

El uso de un cóctel de colagenasa I y II y termolisina, garantiza lote mínimo a las diferencias de lote en la actividad enzimática haciendo de este método altamente re.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), la Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 y NANOVAC) y la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
Suplementado RPMI 1640 medio RPMI1640 suplementado con L-glu, pen-strep sin beta mercapto etanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)Roche5401119001resuspender [2.5  mg/ml] en dH2O; almacenar alícuotas a -20  ° C
Dnase ISigma D4263-1VLresuspender en RPMI 1640 sin suero [1,000  U/ml]
Materiales
Tijeras quirúrgicas Pinzas
quirúrgicas
Bisturí
35 mm Placas
Petri de 66 mm Placas
70 y micro; m Filtros de celdasBD352350
Cóctel de digestiónDiluido en RPMI 5% FBS
LIberase TM300 y micro; g/ml
DNAse150 U/ml
Anticuerpos
NombreEmpresa>ClonEtiqueta
aCD45.2104PE-Cy5.5
aCD11cN418PE-Cy7
CD11bM1/70FITC
F4/80A 3-1APC-Cy7
aCD4Gk1.5APC-Cy7
aCD853-6.7PE
aCD64X54-5/7.1PE-Cy7
aCD2074C7APC
quirúrgico de de Petri de 100 mm

Referencias

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  1. Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
  2. Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatol....

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Etiquetas

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