Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

Resumen

La piel alberga una compleja red de células inmunitarias. Describimos una metodología eficiente para la digestión de piel de ratón, procedente de diferentes partes del cuerpo del animal, con el fin de obtener una suspensión unicelular y analizar las diferentes poblaciones de leucocitos residentes en la piel mediante citometría de flujo.

Resumen

La piel es un órgano barrera que interactúa con el entorno externo. Al estar continuamente expuestas a una posible invasión microbiana, la dermis y la epidermis albergan una variedad de células inmunitarias tanto en condiciones homeostáticas como inflamatorias. Por lo tanto, las herramientas para obtener la liberación de células de la piel para los análisis citofluorimétricos son muy útiles para estudiar la compleja red de células inmunitarias que residen en la piel y su respuesta a los estímulos microbianos. En este trabajo describimos una metodología eficiente para la digestión de la piel de ratón con el fin de obtener suspensiones unicelulares de forma rápida y eficiente. Este protocolo permite mantener la máxima viabilidad celular sin comprometer la expresión de antígenos de superficie. También describimos cómo tomar y digerir muestras de piel de diferentes lugares anatómicas, como la oreja, el tronco, la cola y la almohadilla de la pata. A continuación, las suspensiones obtenidas se tiñen y se analizan mediante citometría de flujo para discriminar entre diferentes poblaciones de leucocitos.

Introducción

La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo y su gran superficie está continuamente expuesta al entorno externo. Por lo tanto, la piel tiene que proteger al organismo de posibles amenazas para mantener la homeostasis, tanto por medios físicos como proporcionando una protección activa contra la posible entrada de patógenos. De manera similar a la mucosa intestinal y pulmonar, la piel alberga una variedad de células inmunitarias que interactúan continuamente con el epitelio para mantener la vigilancia inmunitaria. Este complejo sistema que involucra tanto a las células inmunitarias como a las no inmunitarias de la piel ha sido reconocido desde los primeros días de la inmunología, cuando en 1978 se acuñó por primera vez el término "tejido linfoide asociado a la piel" (SALT) ¹ para describir dicha complejidad.

El gran número de células inmunitarias que residen en la piel ayuda al organismo no solo a combatir posibles invasiones, sino también a orquestar la cicatrización de heridas y a mantener la tolerancia hacia los autoantígenos y la microbiota cutánea ^2,3.

Entre las células inmunitarias residentes en la piel, las células dendríticas (CD) tienen un papel crucial en la formación de las respuestas inmunitarias y en el mantenimiento de la homeostasis ⁴. Las células dérmicas DC y las células de Langerhans responden fácilmente a las invasiones de patógenos y, al migrar a los ganglios linfáticos, activan las células T e inducen la expresión de receptores de localización de la piel en las células T efectoras recién generadas ⁵. Las CD también tienen un papel fundamental en la regulación de la homeostasis de la piel. Las CD que migran de la dermis a los ganglios linfáticos en condiciones homeostáticas transportan antígenos secuestrados de la piel con el propósito de inducir tolerancia a las células T, principalmente a través de la diferenciación de células T reguladoras (Tregs) específicas para los antígenos de la piel ^6-8.

'jove_content representan la población más abundante de células inmunitarias en la piel. No solo se infiltran en la piel durante una infección, sino que también representan una población estable entre los linfocitos residentes en la piel ^9,10. Tanto las células T de memoria (rm) residentes CD8⁺ como las CD4⁺ residen en la piel y, después de una infección, pueden responder mucho antes de que las células T efectoras se recluten de la sangre. En la piel, también reside una población de Tregs residentes en el tejido capaces de mantener la tolerancia hacia los antígenos de la piel y la homeostasis de los tejidos. Estas células se activan rápida y potentemente después de la exposición a su antígeno afín y, por lo tanto, se han definido como Tregs de memoria ^11,12.

Junto con las DC y las células T, muchas células inmunitarias innatas, como las células NK, las células T gamma delta, las ILC del grupo 2 ¹³, los mastocitos y los macrófagos, pueblan la piel y contribuyen a la protección del huésped. Para analizar un entorno tan complejo, es obligatorio obtener suspensiones unicelulares a partir de muestras de piel con alta eficiencia y, al mismo tiempo, preservar la expresión de marcadores de superficie para el análisis o clasificación por citoferimetría de flujo.

La piel murina presenta una capa epidérmica externa, constituida principalmente por queratinocitos, células de Langerhans y células T epidérmicas dendríticas; y la capa dérmica inferior. La dermis alberga la mayoría de las células inmunitarias y está formada por una matriz extracelular en la que las fibras de colágeno son las más abundantes, especialmente el colágeno-I y el colágeno-IV. A diferencia de la piel humana, la piel del ratón está cubierta de pelo y, por lo tanto, está más poblada de folículos pilosos. Es, además, mucho más delgada que la piel humana y contiene una capa muscular, el panículo carnoso, que ayuda a la cicatrización de heridas ¹⁴. Estas características hacen que sea más difícil interrumpir de manera eficiente la red de colágeno de la dermis para extraer las células inmunitarias.

En este artículo proporcionamos un método adecuado para digerir la matriz extracelular que se basa en un cóctel de colagenasa 1 y 2 de alta pureza y termolisina. Además, dado que el análisis de la piel de diferentes regiones requiere diferentes procedimientos experimentales, mostraremos diferentes métodos para obtener de manera eficiente muestras de piel de la almohadilla del pie, la cola, la oreja y el tronco. A continuación, etiquetaremos las muestras para evaluar la presencia de DC (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), macrófagos (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), linfocitos T CD8⁺ y CD4⁺.

Protocolo

de aprobación del estudio: Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano (Roma, Italia) de acuerdo con el Decreto Legislativo 27 de Enero de 1992, n. 116 "attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini sperimentali o ad altri Fini scientifici."

1. Obtención de las muestras de piel

1. La eutanasia el ratón por dislocación cervical.
2. Oreja:
   1. Cortar la parte sin pelo de las orejas del ratón.
   2. dorsal separada y parte ventral mediante tracción con fórceps. Eliminar cualquier resto de cartílagos, raspando suavemente la parte interna de las orejas con fórceps.
3. la piel del tronco:
   1. Afeitarse toda la piel del animal, tanto con una máquina de afeitar eléctrica y con la loción depilatoria delicada.
   2. Cortar la muestra de piel deseado (de 2 cm ² hasta toda la piel de los animales).
      1. Si cortando todo el dorsal y nclusotral de la piel del ratón, haga un corte vertical en el medio del ratón de nuevo y luego se corta a lo largo de las fronteras de las áreas afeitadas de todo el cuerpo del ratón.
      2. separar suavemente la piel del peritoneo y músculos de la espalda, manteniendo la muestra de piel todavía con el fórceps, mientras que la separación de la muestra de piel con la punta de bordes redondeados cerrado de un tijeras quirúrgicas o un bisturí.
   3. Preparar una placa de cultivo de 100 mm que contiene 10 ml de PBS frío.
   4. Eliminar la grasa subcutánea sumergiendo la muestra de piel en PBS en la placa preparada en el paso 1.3.3 y raspando la muestra de piel con pinzas.
4. Cola:
   1. Cortar la cola del ratón.
   2. Hacer un corte vertical en la cola con unas tijeras quirúrgicas o bisturí quirúrgico, a partir de la base de la cola y que llegan hasta la punta de la cola.
   3. El uso de fórceps para separar la piel de la cola. Agarrar el borde del corte en la base de la cola y tire suavemente hacia la punta, mientras que la celebración de lacuerpo de la cola con unas pinzas.
   4. Eliminar cualquier exceso de grasa, raspando suavemente la muestra de piel.
5. Alfombra de pies
   1. Cortar todo el pie ratón con tijeras quirúrgicas. Evitar cortar cualquier piel con pelo.
   2. Cortar la piel del pie longitudinalmente desde el tobillo hasta el comienzo de los dígitos.
   3. Mantenga los huesos del tobillo con unas pinzas o con la mano, mientras que agarrar la piel con pinzas y tire de la piel hacia los dígitos como si quitándose un guante.

2. Digestión

1. Preparar el cóctel de la digestión de la solución madre (preparado como en la Lista de Materiales) con la siguiente receta: Mezcla de Enzimas (ver Lista de Materiales para las especificaciones) 300 g / ml, Dnase1 50 U / ml. Diluir en RPMI 5% de FBS.
2. Picar las muestras de piel con tijeras en trozos pequeños en una placa de Petri de 35 mm con 2 ml de digestión de cóctel (Para la piel del tronco: 2 ml de cóctel Digestión cada 2 ^cm2 de piel, hasta 3 ml en total).
3. Se incuba a 37 ° C durante 90 minutos. Agitar suavemente la placa de Petri 1-2 veces durante la incubación.
4. Verter muestras de piel digeridos en un colador de 70 micras de células en 66 mm plato de Petri que contiene 1 ml de RPMI1640 5% de FBS.
5. Lavar el filtro con 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS.
6. Exprimir la muestra a través del filtro de células con un émbolo de la jeringa.
7. émbolo de color, placa de Petri y el filtro con 20 ml de RPMI1640 FBS al 5%, la transferencia en un tubo de 50 ml.

3. Los anticuerpos y Etiquetado

1. Se lava la suspensión obtenida dos veces con 5 ml de PBS 1% de SFB (o BSA).
2. Etiqueta de la suspensión celular obtenida con los anticuerpos deseados.
   1. Resuspender las muestras en 100 l / muestra de una mezcla que contiene 2 mg / ml de aCD16 / CD32 (clon 2.4G2) diluido en PBS 1% de FBS.
   2. Incubar durante 15 min a 4 ° C con el fin de bloquear la unión no específica de los anticuerpos deseados a través de receptores de Fc.
   3. Añadir los anticuerpos indicados en la tabla1.
      1. Preparar una mezcla de diluir los anticuerpos deseados en 100 l / muestra de PBS 1% de FBS a una concentración de 4 mg / ml.
      2. Añadir 100 ml de la mezcla preparada en la etapa 3.2.3.1 a cada muestra de manera que en el tubo, habrá un volumen de 200 l de mezcla de anticuerpos a una concentración final de 2 mg / ml.
   4. Incubar durante 30 minutos a 4 ° C y la cubierta de la luz.
3. Lavar con 1 ml de PBS 1% de FBS, de centrifugación durante 5 min a 400 xg, descartar el sobrenadante y resuspender en 300 l de PBS 1% de FBS.
4. Añadir DAPI a una concentración final de 2 mg / ml y se incuba a 4 ° C, protegido de la luz durante 10 minutos.
5. Analizar las muestras obtenidas por FACS.
   1. Con el fin de aislar los leucocitos, utilizar la siguiente estrategia gating:
      1. En primer lugar eliminar las células muertas, colocando puertas en la población DAPI-.
      2. Seleccione singletes en el FSC-A vs. parcela FSC W como se indica en la Figura 1 .
      3. Puerta de las células en función del tamaño y la granularidad típico de los leucocitos de interés.
      4. Seleccionar CD45 + células en el FSC-A parcela CD45 como se indica en la Figura 1.
   2. Distinguir las diferentes poblaciones de leucocitos por la expresión de marcadores de superficie como sigue:
      1. Identificar los países en desarrollo como células CD11c ⁺ II ⁺ MHC. Estos pueden ser analizados después para la expresión de CD207 para distinguir las células de Langerhans y CD207 + dérmica DCs de CD207- dérmica DCs.
      2. Identificar los macrófagos como células CD64 + F4 / 80 +.
      3. Identificar las células B como las células CD19 + MHCII +.
      4. Identificar las células T como CD8 + o células CD4 +.

Resultados

La piel de diferente región del cuerpo se digirió de acuerdo con el protocolo descrito y se tiñeron con los anticuerpos indicados. La estrategia gating se representa en la Figura 1. En primer lugar seleccionar células vivas (células DAPI-), entonces la puerta en singletes (FSC-A vs. FSC-W) y en células con morfología de linfocitos (FSC frente a SSC-A-A). Cuando esté indicado, se seleccionan las células CD45 ⁺ de origen hematopoyético.

Discusión

Hemos descrito un método para la preparación de suspensiones de una sola célula a partir de diferentes regiones de la piel del ratón. El método de la digestión hemos adoptado, no sólo da altos rendimientos sino que también conserva la expresión de marcadores de superficie, que es fundamental para el posterior análisis de FACS.

El uso de un cóctel de colagenasa I y II y termolisina, garantiza lote mínimo a las diferencias de lote en la actividad enzimática haciendo de este método altamente re...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Suplementado RPMI 1640 medio			RPMI1640 suplementado con L-glu, pen-strep sin beta mercapto etanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	resuspender [2.5  mg/ml] en dH2O; almacenar alícuotas a -20  ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	resuspender en RPMI 1640 sin suero [1,000  U/ml]
Materiales
Tijeras quirúrgicas Pinzas
			quirúrgicas
Bisturí
35 mm Placas
Petri de 66 mm Placas
70 y micro; m Filtros de celdas	BD	352350
Cóctel de digestión			Diluido en RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 y micro; g/ml
DNAse1			50 U/ml
Anticuerpos
Nombre	Empresa	>Clon	Etiqueta
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC