Evaluación funcional y morfológica de Diafragma Inervación por frénico neuronas motoras

Resumen

El registro del potencial de acción muscular compuesto evalúa cuantitativamente la inervación funcional del diafragma por las neuronas motoras frénicas. La inmunohistoquímica del diafragma de montaje completo evalúa la inervación morfológica en las uniones neuromusculares individuales. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo se pueden utilizar estas dos poderosas metodologías en varios modelos de roedores de enfermedad de la médula espinal.

Resumen

Este protocolo se centra específicamente en las herramientas para evaluar la inervación de la neurona motora frénica (PhMN) del diafragma tanto a nivel electrofisiológico como morfológico. El registro del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) después de la estimulación del nervio frénico se puede utilizar para evaluar cuantitativamente la inervación funcional del diafragma por PhMN de la médula espinal cervical in vivo en ratas y ratones anestesiados. Debido a que los CMAP representan el registro simultáneo de todas las miofibras de todo el hemidiafragma, es útil examinar también los fenotipos de los axones motores individuales y las miofibras en el diafragma NMJ para rastrear los cambios morfológicos relevantes para la enfermedad y la terapia, como la denervación parcial y completa, la brotación regenerativa y la reinervación. Esto se puede lograr a través de la inmunohistoquímica (IHC) de montaje completo del diafragma, seguida de una evaluación morfológica detallada de las NMJ individuales en todo el músculo. La combinación de CMAPs y análisis de NMJ proporciona un enfoque poderoso para estudiar cuantitativamente la inervación diafragmática en modelos de roedores de enfermedad del SNC y el SNP.

Introducción

Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad de la motoneurona debilitante asociada con la pérdida de las neuronas motoras superiores e inferiores y la consiguiente parálisis muscular. Tras el diagnóstico, la supervivencia del paciente es en promedio de sólo 2.5 años ^1. Pérdida frénico motoneurona (PhMN) es un componente crítico de la patogénesis de la ELA. Los pacientes mueren en última instancia debido a la pérdida de PhMN inervación del diafragma, el músculo principal de inspiración ^2,3. Lesión medular traumática (SCI) es también un problema serio con dificultades respiratorias asociadas. Aproximadamente 12.000 nuevos casos de SCI s....

Protocolo

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de la Universidad Thomas Jefferson cuidado de los animales institucional y el uso y llevaron a cabo en cumplimiento de la Directiva Comunidades Europeas (2010/63 / UE, 86/609 / CEE y 87 a 848 / CEE), la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y la Sociedad para las Políticas de Neurociencia en el uso de animales en Investigación de Neurociencia.

1. Potenciales de Acción Compuesto musculares (CMAPs)

1. Preparación del animal:
   1. Anestesiar la rata utilizando un inhalante (isoflurano) a 2.1% entregado al efecto o por inyección (ketamina, xi....

Resultados

Adultos ratas Sprague-Dawley recibieron o bien laminectomía solamente (control no lesionado) o unilateral hemi-contusión SCI a nivel de la médula espinal C4 ^10-12. A las 5 semanas después de la cirugía, el pico CMAP amplitud registrada de la hemi-diafragma ipsilateral al sitio laminectomía / lesión se redujo significativamente en ratas SCI (Figura 2C) en comparación con el control-laminectomía solamente (Figura 2B). Todos NMJs en el hemi-diafragma estaban completamente intact.......

Discusión

Como la función respiratoria se ve comprometida en tanto SCI traumático y la ELA, el desarrollo de terapias que se dirigen a la respiración y, específicamente, la inervación del diafragma son clínicamente relevantes ^5,6. Con el fin de estudiar exhaustivamente la función respiratoria, se debe utilizar un método de enfoque combinado. CMAPs miden el grado de inervación funcional de la membrana a través de la estimulación del nervio frénico externa, pero el impulso respiratorio bulboespinal no endógena ^8.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Paraformaldehído	Fisher	T353-500	Prepare primero la solución al 10% en agua destilada desionizada; haga el 4% con 1x PBS, ajuste el pH a 7.4
1x Solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4	Invitrogen	10010049
2% Albúmina sérica bovina (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Disolver 2 g de BSA en 100 ml de 1x PBS
0.2% Triton X100 en 2% BSA/PBS (tampón de bloqueo)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Disolver 0,2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0,1 M Glicina	Sigma-Aldrich	G-7126	Añadir 0,185 g a 25 ml de BSA/PBS
α-bungarotoxina	Invitrogen	T1175	Concentración 1:400
SMI-312	Monoclonales de Sternberger	SMI312	Concentración 1:1.000
SV2	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	SV2-Sobrenadante	Concentración 1:10
FITC cabra anti-ratón IgG1	Roche	3117731001	Concentración 1:100
Caucho de silicona	Sylgard, Dow Corning	Parte # 184	Siga las instrucciones que vienen con el kit: Puede usar un plato de cultivo de varios tamaños (30 mm, 60 mm, 100 mm) según las necesidades
Medio de montaje fluorescente Vectashield Laboratorios vectoriales		H-1000	Este no es un medio rígido. Tendrás que asegurar el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
Tijeras de muelle pequeñas	Fine Science Tools	15002-08
Pinzas de disección	Fine Science Tools	11295-51
Software para registros CMAP	Alcance 3.5.6; Electrodos de superficie de disco ADI
	Natus neurology	019-409000
Electrodos de aguja subdérmica	Natus neurology	019-453100
Gel conductor	Aquasonic	122-73720
Estimulador/sistema de grabación para grabaciones CMAP	Estimulador
Amplificador para grabaciones	CMAPBioAMP