El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.
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Artículo de método
3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de células T Intra-tímico requiere una malla tridimensional intrincada compuesta de diversas células del estroma, es decir, las células no-T. Timocitos atraviesan este andamio en un orden temporal y espacial altamente coordinada mientras secuencialmente pasando los puntos de control obligatorios, es decir, T compromiso de linaje celular, seguido por la generación repertorio T y la selección antes de su exportación en la periferia. Los dos tipos principales de células residentes que forman este andamio son células epiteliales del timo corticales (CTEC) y medulares (mTECs). Una característica clave de mTECs es la denominada expresión promiscua de numerosos antígenos restringida de tejido. Estos antígenos restringido de tejidos se presentan a los timocitos inmaduros directa o indirectamente por mTECs o células dendríticas tímicas, respectivamente resultante en la auto-tolerancia.
Modelos adecuados in vitro emulando las vías de desarrollo y las funciones de CTEC y mTECs Actualmente lacrey. Esta falta de modelos experimentales adecuados, por ejemplo, ha obstaculizado el análisis de la expresión génica promiscua, que todavía está poco conocida a nivel celular y molecular. Se adaptó un modelo de co-cultivo organotípico 3D a la cultura ex vivo mTECs aisladas. Este modelo fue originalmente ideado para cultivar queratinocitos de tal manera como para generar un equivalente de piel in vitro. El modelo 3D conserva características funcionales clave de MTEC biología: (i) la proliferación y la diferenciación terminal de CD80 he aquí-Aire negativa en CD80 hi, mTECs-Aire positivo, (ii) la capacidad de respuesta de RANKL, y (iii) la expresión sostenida de Foxn1, Aire y genes restringido de tejidos en CD80 hi mTECs.
Introducción
Timocitos en desarrollo constituyen aproximadamente el 98% del timo, mientras que el 2% restante consiste en una variedad de células que colectivamente componen el estroma tímico (es decir, células epiteliales, células dendríticas, macrófagos, células B, fibroblastos, células endoteliales). Las células epiteliales corticales exteriores (CTEC) procuran la inmigración de las células pro-T de la médula ósea, linaje de células T de inducción en multipotentes células pre-T y la selección positiva de la auto-MHC restringida timocitos inmaduros. Las células internas medulares del timo epiteliales (mTECs) están involucrados en la tolerancia a la inducción de los tim....
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Protocolo
Este estudio ha sido aprobado por el comité de ética de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos en el Centro Alemán de Investigación Oncológica (DKFZ). Para todos los cachorros experimentos de cultivo de ratón que van de 1 a 7 días de edad fueron utilizados.
1. Aislamiento de mTECs de timo
NOTA: Se realizaron las siguientes etapas de digestión como se describió anteriormente 1 bajo condiciones estériles con algunas modificaciones de la siguiente manera.
- Decapitar a las crías de ratón y retire el timo. Coloque el t....
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Resultados
Hemos adoptado un modelo de co-cultivo organotípico 3D (3D OTC) que había sido desarrollado originalmente para la cultura a largo plazo in vitro de queratinocitos 9. MTECs MACS enriquecidos (ver MACS enriquecimiento esquema de la figura 1) fueron sembradas en un andamio que comprende de un gel de fibrina y fibroblastos atrapadas. Los fibroblastos proporcionan la matriz extracelular esencial (ECM) que soporta mTECs in vitro. MTECs se cultivaron en OTC de 4-14 días en presenci.......
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Discusión
Junto RTOCs, la OTC 3D haber sido muy superior en términos de diferenciación TEC y PGE mantenimiento / inducción (Tabla 1) en comparación con otros (i) «culturas 3D simplificados 'usando - fibroblastos solo sin el andamio; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador co-cultivadas con TEC 10, (iii) las células 3T3-J2 en el que se desarrollan clones TEC, pero PGE se pierde, (iv) matrigel o (v) los componentes de ECM (datos no publicados). PGE se mantuvo durante un máxim.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflicto financiera o comercial de interés.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), el consorcio de la UE "Tolerage", la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) y la Landesstiftung Baden-Württemberg.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones C57BL/6 preñados | Columnas Charles River WIGA | ||
| LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Columnas MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microperlas, ratón | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Microperlas anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Microperlas de estreptavidina | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 y -biotina) | Ref. 12 | ||
| Anticuerpo CD80-PE | BD Pharmingen | 553769 | |
| Anticuerpo CD45-PerCP | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC anticuerpo | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific | Blue Ref. 15 | ||
| Anticuerpo de queratina 14 | Covance | PRB-155P Anticuerpo | |
| de Vimentina | Progen | GP58 | |
| Conjugado con Cy3 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugado AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-conejillo de indias IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 conjugado | Sondas moleculares (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de ensayo de citometría de flujo | Invitrogen | C10425 | |
| Insertos de filtro de 12 pocillos (thincerts) | Greiner bio-one | ||
| Placa de 12 pocillos | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italia | ||
| Fibrinógeno TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Trombina TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinina (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Toxina del cólera | Biomol | G117 | |
| Hidrocortisona | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß 1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R& Sistemas D | 462-TR-010 | |
| Termolisina | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compuesto | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (también conocido como Trizol. Solución desnaturalizante - Extracción ácida de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Colagenasa Tipo IV | CellSystems | LS004189 | 0,2 mg/ml y 57U/ml conc final. |
| Proteasa neutra (dispasa) | CellSystems | LS002104 | 0,2 mg/ml y 1,2 U/ml conc final. |
| DNasa I | Roche | 11 284 932 001 | 25 y micro; g/ml conc. |
Referencias
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology....
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Reimpresiones y permisos
