Artículo de método

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

12.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/52654

⸱

31 de enero de 2015

 ,  , 
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para capturar la dinámica de la regeneración de la aleta caudal de las larvas de pez cebra a escala de tejido completo utilizando estereomicroscopía basada en campo claro. Esta técnica permite capturar la dinámica de regeneración con resolución de una sola célula. Esta metodología se puede adaptar a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software de lapso de tiempo.

Resumen

La aleta caudal de la larva del pez cebra es ideal para estudiar la regeneración de tejidos debido a la arquitectura simple del pliegue de la aleta larvaria, que se compone de dos capas de piel que encierran un mesénquima indiferenciado, y porque la aleta caudal de la larva se regenera rápidamente en 2-3 días. Usando este sistema, demostramos un método para capturar la dinámica de reparación de la aleta caudal amputada con microscopía estereoscópica de campo claro de video de lapso de tiempo. Demostramos que la amputación de aletas desencadena una contracción de la herida de amputación y la extrusión de células alrededor del margen de la herida, lo que lleva a su posterior eliminación. La regeneración de las aletas procede de la dirección proximal a la distal después de un breve retraso. Además, se puede observar el crecimiento del desarrollo de la larva durante todas las etapas. El método presentado brinda la oportunidad de observar y analizar comportamientos a escala de tejido completo, como el desarrollo y crecimiento de aletas, en un entorno de microscopio simple, que es fácilmente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico con capacidades de lapso de tiempo.

Introducción

La capacidad de un organismo para orquestar procesos de reparación de tejidos después de una lesión es crucial para su supervivencia 1. Si bien todos los animales tienen la capacidad de curar sus heridas, el grado en que los tejidos se regeneran difiere mucho entre las especies. Las especies de vertebras como el pez cebra, las salamandras y los renacuajos ranas tienen la notable capacidad de regenerar los tejidos perdidos, incluidos sus apéndices, partes de sus ojos, corazón y sistema nervioso central 2-4. Las especies de mamíferos, como el ratón espinoso africano y los conejos, son capaces de regenerar agujeros en sus pinnas 5-7, y los humanos y ratones regeneran partes de su hígado, así como las puntas de sus dedos durante las etapas fetal y juvenil 8-12. Aunque aún no se comprende bien por qué y cómo ciertas especies regeneran los tejidos de manera más efectiva que otras, la presencia de vías genéticas similares sugiere que estos mecanismos pueden permanecer latentes en especies sin gran potencial de regeneración 13,14. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos de reparación y regeneración de tejidos en especies con resultados de regeneración satisfactorios beneficiará la regeneración en humanos.

Hemos elegido la aleta de la cola del pez cebra larvaria como paradigma para demostrar su regeneración con estereoscopía de campo claro time-lapse. La aleta caudal de la larva de pez cebra es anatómicamente simple en comparación con las estructuras adultas más complejas, que consisten en un epitelio plegado de dos capas con axones somatosensoriales que inervan la piel que rodea las células mesenquimales ubicadas medialmente 15. A pesar de las diferencias anatómicas, la regeneración de la aleta caudal de las larvas es comparable a la regeneración de las aletas adultas en términos de las firmas moleculares y las respuestas de excrecencia 16,17. En comparación con la aleta adulta, la imagen de la regeneración de la aleta caudal de las larvas tiene, sin embargo, varias ventajas: 1) la regeneración de la aleta larvaria se completa en solo 2-3 días 16, 2) las larvas se pueden montar en agarosa de bajo punto de fusión, y 3) las larvas no requieren alimentación hasta ~ 5 días después de la fertilización (dpf) debido a la presencia del saco vitelino. Esto hace que las larvas de pez cebra sean ideales para observar la dinámica de reparación de tejidos in vivo.

El método presentado permite capturar la dinámica detallada que subyace a los procesos tempranos de regeneración de aletas. Muchos estudios han utilizado la microscopía confocal basada en fluorescencia para estudiar los procesos biológicos celulares y subcelulares en embriones y larvas de pez cebra. Sin embargo, las sofisticadas configuraciones de imágenes confocales a menudo no son accesibles para todos y son muy costosas en comparación con otras técnicas de imagen. En contraste, la metodología presentada utiliza un microscopio estereoscópico Discovery V12 equipado con el software Axiovision y un módulo de lapso de tiempo, proporcionando así una alternativa más asequible a los costosos equipos de imagen para examinar el comportamiento de los tejidos. Demostramos que este método se puede utilizar para obtener imágenes de la regeneración de tejidos con alta resolución temporal a un costo mínimo. Las implicaciones de este método podrían extenderse más allá de la biología básica para avanzar en los estudios de regeneración de mamíferos utilizando cultivos de órganos, para el desarrollo terapéutico a través de cribados farmacológicos y genéticos, y puede servir como herramienta didáctica en el aula.

Protocolo

El pez cebra (cepa nácar) fueron criados y se crió según los protocolos establecidos. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento, utilizando 0,4 mM tricaína para la anestesia y 1 tricaína mM para la eutanasia. Embriones de pez cebra y larvas fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales según lo aprobado por la comisión competente (Laboratorio Biológico MDI animales núcleo CICUAL número 13-20). Este estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación del Genoma Humano Cuidado de Animales y el empleo Comisión Nacional, MDIBL Aseguramiento Institucional # A-3562-01 bajo el protocolo # 14-09.

Nota: El procedimiento de imagen que captura la regeneración de la aleta en larvas de pez cebra se resume en los siguientes pasos:

1. Aumento de pez cebra a fases larvarias

  1. Recoger los huevos y coloque aproximadamente 50 huevos en una placa de Petri de 100 x 25 mm que contiene 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada suplementado con 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N en una incubadora a 28,5 °.
  2. A la mañana siguiente a eliminar los embriones muertos con una pipeta de vidrio y enjuague los huevos en un colador con un 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada (medio embrión llamado).
    Nota: Medium, como timbres 18, Hanks 18, 19 E2, E3 20, y Danieau 21 puede ser preferible.
  3. sup> Añadir medio de embriones frescos al plato. Si la utilización de cepas pigmentadas, añadir opcionalmente 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), como PTU evitará la melanogénesis y por lo tanto la pigmentación de las larvas. Deje que los embriones se desarrollan más en la incubadora hasta 2 días después de la fecundación o cualquier otra etapa larval deseado.

2. Preparación de la cámara de imágenes

  1. Método 1: Imaging cámaras hechas de PVC o tubo de teflón (Figura 1)
    Nota: Este método es similar a la Concha y Adams (1998) 22.
    1. Adquirir plástico de calidad del agua de consumo o tubos de teflón en una ferretería con un exterior 25 mmda 20 mm de diámetro interior. Cortar el tubo para hacer anillos de aproximadamente 10 mm de espesor con una superficie uniforme en cada lado. Utilice> 200 papel de lija para suavizar los bordes.
    2. Limpie los anillos con agua tibia y etanol al 70% y dejar secar al aire.
    3. Con una punta de pipeta, aplicar grasa de silicona a la mitad de un anillo y conecte el anillo a un 75 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio. También puede utilizar una jeringa de 3 ml lleno de grasa de silicona en lugar de una punta de pipeta.
      Nota: Debido a que es difícil insertar la grasa de silicona en la jeringa 3 ml, añadir la grasa de silicona a una jeringa de 30 ml primero y utilizar este para el llenado de la jeringa 3 ml.
  2. Método 2: Preparación de un plato Petri como una cámara de imágenes.
    1. Adquirir 35 o 60 mm de diámetro placas de Petri con un cubreobjetos de vidrio unido a la tapa (Figura 2A). Alternativamente, como se muestra en la Figura 3 de Distel y Koester (2007) 23, perforar una abertura lo suficientemente pequeño para hviejo un cubreobjetos en la tapa de una pequeña placa de Petri y aplicar grasa de silicona al exterior con una jeringa de 3 ml. Utilizando una punta de pipeta limpia, con cuidado colocar un cubreobjetos redondo o cuadrado de espesor deseado hacia el exterior (Figura 2B).
  3. Para asegurarse de que la agarosa se utiliza para estancias firmemente unidos durante la elaboración de montaje, coloque una malla de plástico fino en el interior del anillo. En primer lugar, cortar la malla hecha de pantalla de la ventana obtenido a partir de una ferretería, en el tamaño del diámetro del anillo interior con unas tijeras finas con un ángulo. A continuación, cortar un pequeño rectángulo> dos veces el tamaño de la larva en el centro de la malla (Figura 1, 2).
  4. Aplicar cuatro pequeños puntos de grasa de silicona no tóxico para la interfaz entre la hoja de la cubierta y el anillo de la cámara (Figura 1A).
  5. El uso de fórceps para sujetar firmemente la malla a la parte inferior de la cubreobjetos de vidrio.

3. Montaje e Imagen de la Pre-injured Larva (este paso es opcional)

Nota: Este paso es adecuado para las comparaciones entre la longitud de la aleta amputada y regenerada, como el plano de amputación después de la regeneración de la aleta no es reconocible en larvas de pez cebra.

  1. Preparar una solución de agarosa al 0,5-1,2% bajo punto de fusión en medio de embrión para la inmovilización de la muestra.
  2. Calentar la agarosa en un microondas y transferir la agarosa líquido en tubos de 1,5 ml que se pre-calienta a 42 ° C en un calentador.
  3. Deje que la agarosa caliente, déjelo enfriar a 42 ° C, que puede mantenerse durante varias semanas a esta temperatura. Trate de evitar pipetear las larvas en agarosa encima 42 ° C, ya que esto será perjudicial para los animales.
  4. Anestesiar a varias larvas usando 10 ml de 0,4 mM tricaína (pH 7) en medio de embrión en una placa de Petri de diámetro 60 mm. Prepare el tricaína según el Libro Recetas de pez cebra 18.
    1. Alternativamente, utilizar 10 ml de una dilución 1: 1000 de 99% 2-fenoxietanol en una placa Petri de diámetro de 60 mm. Meter las larvas con una punta de pipeta microloader nevadas para evaluar su respuesta al tacto antes de proceder. Utilice sólo las larvas no responde.
  5. Transferir una larva en la solución de gelosa a 42 ° utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. No transfiera líquido excesivo en la agarosa, de lo contrario la agarosa será demasiado diluida y se solidifica.
  6. Deseche el líquido restante de la pipeta y transferir la larva con una gota de agarosa en una pequeña placa de Petri (35 o 60 mm de diámetro). Coloque la larva en su lado de la imagen de la aleta caudal.
  7. Deje que la agarosa se solidifique. Evaluar la agarosa con una punta de pipeta de plástico; la punta se sumerja en la agarosa si es demasiado líquido. Una vez que la agarosa se ha solidificado, una pequeña hendidura será visible al tocar con la punta de la pipeta. Después de la solidificación, añadir solución tricaína y proceder al microscopio estereoscópico que se utilizará más tarde para time-lapse.
    Nota: Este paso también se puede realizar mediante la colocación de la larva anestesiado en un plato Petri revestido con 1,5% de agarosa en medio de embrión.
  8. Utilice un microscopio estereoscópico con el software de lapso de tiempo. Seleccione un objetivo y ampliación apropiado, que se utilizará más tarde para time-lapse. En este caso, utilice un 3,5 x 16 mm, distancia de trabajo de la lente objetivo en un microscopio estereoscópico. Según se desee, utilizar microscopios alternativos y lentes de objetivos, sino elegir un aumento adecuado para tener en cuenta el potencial xy de la deriva y el crecimiento de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes.
  9. Seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio.
  10. En el software, seleccione el modo "en vivo" para ver la larva en la pantalla.
  11. Abra la ventana "Propiedades" para detectar automáticamente el brillo.
  12. Para ajustar manualmente el contraste en la base trans-iluminación microscopio.
  13. Mueva la larva del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado para minimizar fondo noise.
  14. Coloque la larva de nuevo en el campo de visión y tomar una instantánea. Guarda la imagen.
  15. Retire la agarosa de la larva por primera raspando la agarosa de la cabeza. De esta forma la larva puede deslizarse fuera de la agarosa tirando suavemente la cabeza lejos de la agarosa restante con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos.
  16. Con una pipeta Pasteur de vidrio transferir la larva en una solución tricaína fresco.

4. Amputación Ensayo

  1. Preparar una solución de agarosa al 1,5% usando medio de embrión y se vierte una capa delgada en una placa de Petri. Deje que la agarosa se solidifique.
  2. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque el lateral larva en la agarosa solidificada y amputar la aleta de la cola con una G aguja de la jeringa 23 con una ligera presión (Figura 3A).

5. Montaje de la Larva de time-lapse

  1. Proceda como se describe en los pasos 3.1 a 3.5 (Figura 3B).
  2. Transferir una caída de 0,5 a 1,2% de agarosa líquida a 42 ° C que contiene la larva en el anillo de la cámara de imágenes (paso 2.1), oriente la larva y dejar que la agarosa se solidifique. Llene el anillo con solución tricaína. Alternativamente, si se utiliza la cámara de placa de Petri (paso 2.2), montar la larva en el cubreobjetos tapa y llenar la tapa con solución tricaína.
  3. Para permitir la cicatrización de las heridas o la regeneración de tejidos que se produzca, raspar con cuidado la agarosa que rodea la aleta de la cola distal con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. Trate de no lesionar la aleta repetidamente (Figura 3C).
  4. Decantar la solución tricaína contiene el eliminado de agarosa y llenar el anillo de la cámara con solución tricaína fresco.
  5. Aplicar grasa de silicona a la parte superior del anillo y adjuntar una cámara de 75 mm x 25 mm portaobjetos de vidrio. Trate de evitar las bolsas de aire en la cámara, ya que interferirán con las imágenes de campo claro y desecar la larva en el tiempo.
  6. Si se utiliza una placa de Petri comouna cámara de formación de imágenes, se aplica grasa de silicona para el borde superior de la cámara inferior y llenar la cámara inferior con la solución de tricaína. Decantar cuidadosamente la solución tricaína en la tapa y gire la tapa sobre sumergir la larva en la solución tricaína de la cámara inferior en un ligero ángulo para evitar bolsas de aire. La cámara será sellado debido a la grasa de silicona.

Imagen 6. Time-lapse

  1. Montar una cámara de incubación se calienta como se describe en 23,24 (Figura 4) .Colocar la cámara de incubación alrededor del microscopio y encender la calefacción. Ajustar la temperatura a 28 ° C durante aproximadamente 10 a 20 minutos o hasta que la temperatura se ha estabilizado.
  2. Abra la parte delantera de la cámara de incubación climatizada y colocar la cámara de imágenes en el soporte microscopio con el cubreobjetos hacia arriba hacia el objetivo.
  3. Coloque la aleta larval de una manera que 2/3 de la campo de visión permanece desocupado. Esto asegura la captura de lacrecimiento y la regeneración de la aleta en el transcurso del procedimiento de formación de imágenes sin tener que cambiar la posición de la larva.
    1. Ajuste la larva montado a 28 ° C durante ~ 30 minutos antes de iniciar la grabación a intervalos regulares para evitar cambios en la intensidad de campo claro o posibles cambios de la agarosa. Alternativamente, utilizar tampón de pre-calentado para comenzar de formación de imágenes después de corto tiempo de ajuste.
  4. Para configurar la grabación de lapso de tiempo, abra la ventana 6D Multidimensional Adquisición en el software Axiovision y seleccione la opción z-stack y time-lapse.
  5. Opcional) En la pestaña z-pila y Modo Loncha, seleccione el grosor de corte y luego seleccionar el modo de inicio / parada.
  6. Definir la posición superior e inferior de la pila.
  7. En la pestaña de lapso de tiempo, seleccione el intervalo y la duración de la película y luego comenzar la película pulsando el botón de inicio. Encontramos que intervalos de 30 minutos son suficientes y este intervalo no genera datos excesivos; Sin embargo shorteintervalos R pueden ser utilizados.
  8. Compruebe las dimensiones de posición y z-stack durante la primera hora si la larva no fue pre-ajustado. Si es necesario, vuelva a colocar la larva de nuevo después de un día, como la larva puede haber cambiado.
  9. Guarde el archivo al final de la grabación a intervalos regulares y proceder con el post-procesamiento y cuantificaciones utilizando el software de análisis de imágenes disponibles, como Imaris 25 o el código abierto paquetes de software Image J 26 y 27 de Fiji.

Análisis 7. Datos

  1. La determinación de la longitud de la aleta.
    1. Abre la película de lapso de tiempo en el software de imagen y guardar los archivos en el formato de archivo propietario para mejorar el rendimiento del software.
    2. Seleccione la vista ortogonal a mostrar secciones individuales como pilas proyectadas. Para la corrección de la deriva, en el menú de Fiji, seleccione Complementos y Registro, y 'deriva 3D correcta'. Esto abrirá una ventana de Fiji y realizar las correcciones de deriva. Correctoderiva de rotación en la función Spots Imaris. Alternativamente, instalar los plugins StackReg y TurboReg en la imagen J e importar a Fiji. Elija el algoritmo de transformación deseada en el plugin StackReg.
    3. Para medir distancias (por ejemplo, diámetro de la herida o la longitud de la aleta), seleccione la opción "agregar nuevos puntos de medición" en la barra de herramientas de la izquierda superior.
      1. En 'lista Configurar de Estadísticas visibles Valores' en el menú inferior izquierda, seleccione los valores de los estadísticos que se mostrarán.
      2. En el "Modo de línea" bajo la pestaña Configuración, seleccione 'pares (AB, CD ...).
      3. En 'Labels Propiedades' select 'Nombre' y 'Distancia', para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición.
      4. Cambie al modo "Editar" y mantenga presionado el botón de desplazamiento para seleccionar el primer punto al final de la notocorda. A continuación, utilice la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el margen distal de la aleta.
      5. En la pestaña "Estadísticas", seleccione el botón de disco (Exportar todo) en la parte inferior derecha para mostrar y exportar la distancia en la imagen.
      6. Repita las mediciones a la hora seleccionada moviendo el deslizador por debajo de la imagen de la derecha. En lugar de crear nuevos puntos de medición, los anteriores se pueden reposicionar primero seleccionando el punto con el botón izquierdo del ratón, a continuación, al mismo tiempo presionando el desplazamiento y el botón izquierdo del ratón en la nueva posición.
    4. Como alternativa a la opción Puntos de Medición, utilizar el espectador rebanada para medir distancias. En el modo de vista de la rebanada, desplácese hasta la posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón. Se mostrará la distancia. Esta opción sin embargo no permite la exportación de datos.
  2. La determinación de longitud de la aleta y el área en ImageJ.
    1. Abre la película de lapso de tiempo en ImageJ usando un plugin que reconoce el formato de archivo .zvi. Como alternativa, cargue en un Quarchivo ickTime o secuencia tiff.
      Nota: Si utiliza un formato de archivo TIFF sin comprimir, las dimensiones de la imagen no es necesario que se determine.
    2. Si la apertura de un formato de archivo diferente sin la información del archivo, seleccione "Escala de Ajuste" en el menú "Analizar" para definir primero la distancia de la imagen y la unidad. En el 'menú Escala Set', escriba el 'Distancia en píxeles ", a continuación el tipo de la" distancia Conocido' para el valor de píxel (esto se puede obtener midiendo el número de píxeles en una barra de escala que se ha añadido a la imagen , a continuación, haga clic en Medir para obtener el resultado), y la "Unidad de longitud '(normalmente' m '). Luego haga clic en Aceptar.
    3. Para mediciones de área de aleta seleccionar la herramienta "Selección a mano alzada" en la barra de herramientas y describen el área de la aleta manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras dibuja a lo largo del contorno de la aleta. Para mediciones de la longitud de la aleta, seleccione la herramienta de línea de 'Straight "y trazar una línea entre los puntos deseados para sermedido.
    4. Haga clic en la opción "Medir" en "Analizar" para visualizar el área y la longitud de la aleta. Repita este paso tantas veces como sea necesario para múltiples puntos de tiempo de la película.
  3. Utilizando las estadísticas de software, los datos pueden visualizarse gráficamente.

Resultados

La técnica presentada es adecuada para dilucidar la dinámica de reparación de tejidos en respuesta a la amputación. La película demuestra que la amputación de la aleta provoca inicialmente un efecto en bolsa de tabaco, que se caracteriza por contracciones a través de cables de actina-miosina que están presentes en la aleta 28 veces (Figura 5 A, B). Al mismo tiempo, las células se extruyen de la herida (véase la película). La contracción puede ser por tanto un medio para expulsar las células que probablemente están destinados a someterse a la muerte celular. Nuestros resultados muestran además que el crecimiento del desarrollo de la larva se produce independientemente de la regeneración (película), mientras que la regeneración de la aleta no inicia hasta la amputación poste sobre 14 horas, medido por longitud de la aleta y el área en el transcurso de tiempo de 36 horas después de la amputación (Figura 5C , D). El crecimiento de la aleta regenerativo total después de 1,5 días era aproximadamente el 60% de la longitud de la aleta original (Figura 5E). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que tr amputación Iggers contracción aleta, extrusión de las células de la herida, y una respuesta regenerativa temporalmente retardada. Mientras que las células extruidos se probablemente destinados a experimentar la muerte celular, la naturaleza de estas células necesita una mayor aclaración.

figure-results-1
Figura 1. Imagen de montaje anillo de la cámara

(A) Se muestra un anillo de plástico que está unida a un cubreobjetos con grasa de silicona. Una malla de plástico está fijada en el interior de la cámara con cuatro pequeños puntos de grasa de silicona. (B) La cámara que contiene la larva montada se llena con una solución de tricaína y un portaobjetos de vidrio está unido a la parte superior. (C) Un montado de 2 días de edad larva (flecha) se muestra a mayor aumento para representar su tamaño en relación a la malla."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2. cámara Imaging asamblea hecha de placas de Petri. (A) Se muestra una tapa de cristal placa de Petri con fondo de cristal comercial con una malla de plástico unido a la cubreobjetos de vidrio. (B) Se muestra una cámara de Petri plato de auto-construida con un agujero perforado en la tapa y un cubreobjetos adjunto desde el exterior con grasa de silicona. La malla y la larva se montan dentro de la cámara que contiene la solución tricaína. Para sellar la cámara, grasa de silicona se aplica en el borde superior externo de la cámara inferior y la tapa superior adjunto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3. Esquema de la amputación y el montaje de una larva para la imagen. (A) Para la amputación, coloque una larva anestesiado sobre una placa de Petri de agarosa-revestido y amputar la aleta de la cola con una aguja de jeringa. (B) Para el montaje, la transferencia de la larva con una pipeta de transferencia en un tubo de 1,5 ml lleno con 42 ° C de agarosa líquida y la pipeta una gota que contiene la larva en la cámara de formación de imágenes, orientar el pescado y cubrir el solidificado de agarosa con medio de embrión. (C) Raspe la agarosa de la aleta de la cola con una punta de pipeta microloader tapado o herramienta similar y sustituir medio de embriones con medio fresco. (D) La imagen de la aleta de la cola bajo un microscopio estereoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4. cámara de incubación climatizada construida autónomos. (AC) Se muestra una cámara de incubación climatizada hecho de cartón, plástico de burbujas y Velcro. Un calentador cúpula cable (originalmente diseñada para la incubación de huevos de pollo) está unido a la cámara usando cinta de aluminio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5. dinámica de regeneración de aleta. (A) Esquema del método de ensayo de la amputación y la cuantificación aleta caudal utilizado para determinar la longitud de la aleta (flecha roja) y el área (contorno rojo de la aleta). (B) de la cola de la aleta amputación activa inicialmente la contracción de la aleta, seguido de Regeconsecuencia tejido nerative. La aleta también experimenta crecimiento del desarrollo, como lo demuestra el aumento de tamaño lateral. (C) se muestra la longitud de la aleta como una función del tiempo, revelando un crecimiento regenerativo de partida lineal a ~ 14 hPa. (D) La cuantificación del área de la aleta revela un descenso inicialmente en tamaño, lo que puede atribuirse a la contracción de la aleta. Después de ~ 14 horas, que aumenta el tamaño de las aletas a una velocidad lineal. (E) La comparación de la longitud de la aleta antes de la amputación y después de 36 horas muestra ~ 60% de crecimiento. Barra de escala: 100 micras Abreviaturas: pre-amplificador, pre-amputación; horas después de la amputación, hpa; regeneración, la regeneración; amplificador, la amputación Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película . Fin de regeneración en el transcurso de tiempo de 36h. Se muestra una aleta de la cola de un viejo larva 2,5-día durante el curso de la regeneración. A partir de post amputación 30 min crecimiento regenerativo se forma la imagen en intervalos de 30 minutos en un microscopio estereoscópico utilizando una lente objetivo 3.5x.

Discusión

El método presentado permite la observación de la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en que viven las larvas de pez cebra con imágenes in vivo de lapso de tiempo en un microscopio estereoscópico campo claro, utilizando una relativamente sencilla configuración. Este procedimiento requiere ciertos aspectos importantes que hemos probado, que optimicen el resultado: 1) las concentraciones de agarosa de bajo (~ 0,5%) reducirá al mínimo los obstáculos de crecimiento del continuo crecimiento larvas de pez cebra, 2) Eliminación de la agarosa alrededor de la aleta es importante no a oscurecer el proceso de curación, 3) Atrapar la agarosa en una malla de plástico retiene la agarosa y animal en una posición estable durante todo el procedimiento, y 4) Un entorno de temperatura controlada adecuada, que es esencial para la viabilidad de las larvas. Hemos adaptado una cámara calentada de incubación 23,24, que utiliza plástico de burbujas que se grabó en un cartón, y un calentador de cúpula de cable para controlar la temperatura y la circulación de aire adecuada con fluctuaciones mínimas durante elprocedimiento de imagen. Esta cámara sencilla y rentable puede ser preparado para adaptarse a cualquier microscopio. Una cámara de incubación climatizada similar ha sido también utilizada para los ratones de imagen y desarrollo del polluelo 24,29.

Sugerimos que las larvas previamente amputada se montan una imagen pre-amputación para, desmontar para la amputación, y remontamos por time-lapse. Aunque es factible realizar estos pasos en un solo paso en la cámara de formación de imágenes final, en nuestra experiencia, se encontró que la amputación de la aleta de la cola en un cubreobjetos de vidrio no es óptimo, ya que desgarra el tejido y no da lugar a un corte limpio. El método basado en la amputación de agarosa utilizando una aguja de jeringa fue descrito originalmente por Kawakami y colaboradores (2004) 16 y es también, en nuestra experiencia, ideal para llevar a cabo las amputaciones. Por lo tanto, la más complicada serie de pasos que presentamos está bien justificada y garantiza un resultado óptimo regeneración.

Demostramos que larval pez cebra en 2 dpf se pueden obtener imágenes de hasta 1,5 días en agarosa y solución tricaína. Nos tricaína (pH 7) solución de pH optimizado preparado con sal Instant Ocean, que no interfiera con la salud de la muestra durante el período de formación de imágenes presentado acostumbrados. Previamente, sin embargo también demostró que el uso de tricaína en medio Danieau permite time-lapse de 2,5 dpf larvas de pez cebra en un microscopio confocal de al menos 2 días 30. Por lo tanto, condiciones de tampón óptimos pueden extender la salud de las larvas y la longitud de formación de imágenes. Por otra parte, las concentraciones más bajas tricaína se pueden utilizar para la anestesia, o 2-fenoxietanol, que encontramos es bien tolerado durante las fases de larva y adultos a 28 ° C durante al menos 60 horas.

Para evitar defectos en la regeneración de la aleta, quitamos la agarosa de la aleta de la cola antes de la imagen. Nuestros datos muestran que dentro de 1,5 días la aleta se ha regenerado a aproximadamente 60%. Esta tasa de regeneración es consistente con un estudio anterior definición de 3 días unas un tiempo promedio para la regeneración de la aleta caudal en larvas de pez cebra hasta 6 dpf 16. Métodos alternativos a la agarosa sin embargo se podrían utilizar para montar el pescado para formación de imágenes. Por ejemplo, plasma delgada coagula 31 o etileno propileno fluorado (FEP) tubos recubiertos con metilcelulosa y llenos de concentraciones muy bajas de agarosa (0,1%) han sido recomendados para la hoja de microscopía de luz 32 y puede ser adecuado para nuestro método presentado. Sin embargo, no recomendamos metilcelulosa y 0,1% de agarosa, ya que requieren que la muestra se montan en la parte inferior de la cámara debido a la falta de solidificación de estos medios. Concentraciones muy altas de metilcelulosa generarán además de bolsas de aire en base a nuestra experiencia, y éstos pueden interferir con el procedimiento de imagen. Si se prefieren estos medios con el uso de la cámara inferior, es importante que una distancia de trabajo adecuada entre la lente objetivo y la muestra está presente. Cabe señalar que mSe recomienda etilcelulosa como un medio de montaje sólo para un máximo de 1 día, ya que puede interferir con la salud larval 32.

Montaje de la muestra en la tapa puede dar lugar a una deriva hacia abajo gravitacional lento. Por lo tanto, se recomienda imagen múltiples secciones en cada punto de tiempo, que, o bien se puede proyectar en un solo plano o sólo las imágenes que se encuentran en el plano focal puede ser extraído para el montaje de la película final. Imágenes de la muestra en la cámara inferior podría ser una metodología alternativa para evitar la posibilidad de deriva hacia abajo. Coágulos de plasma podrían ser útiles para evitar la deriva, ya que el plasma se adhieren a la capa envolvente exterior (EVL, peridermis) 31 y por lo tanto puede estabilizar la muestra. Sin embargo, esto tiene que ser probado, así como cuánto tiempo larvas de pez cebra se puede mantener en coágulos de plasma sin interferir con la salud larval o regeneración de aleta.

Nuestra película fue ensamblada utilizando secciones individuales (26 micras)de un z-pila grabada, que cubría todo el espesor de la aleta (~ 10 micras) y que representó el potencial z de la deriva de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes. Con el fin de conservar la información en 3-D, también es posible z-pilas en imágenes solo proyecto. Debido a que esto puede resultar en el efecto borroso de la imagen, la deconvolución de campo claro puede ser deseable. Software, tales como deconvoluir o X3 AutoQuant podría ser utilizado para este propósito. Alternativamente, los algoritmos matemáticos (descritos en Tadrous 33) se pueden aplicar para la obtención de una función de punto-propagación de alta relación señal a ruido (SNR). La obtención de una alta SNR representa uno de los principales obstáculos en la deconvolución campo claro. Aunque este método requiere un alto contraste y espesor de la muestra fina, que sería apropiado para la imagen de la aleta de la cola debido a su anchura reducida.

Una clara ventaja del método de formación de imágenes que se presenta es que es rápidamente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico equipado con un una cámara CCDd software de lapso de tiempo y ofrece una alternativa de bajo costo a los sistemas de imagen confocal más caros. Si bien este método no utiliza la fluorescencia para la detección de células, que se puede extender para tales aplicaciones mediante la utilización de un sistema automatizado de control de persianas y post-imagen de software de deconvolución 34. Esto permitiría a los usuarios observar aún más los procesos de reparación de heridas y la regeneración con una sola célula o resolución subcelular durante períodos de tiempo más largos.

La claridad óptica y la facilidad con la que embrionario y larvas de pez cebra se pueden manejar, y la capacidad de adaptación de este método para cualquier microscopio estereoscópico hace adecuado para la enseñanza de la biología básica de vertebrados en un salón de clases. Este método puede proporcionar a los estudiantes una mejor comprensión de los procesos biológicos básicos que subyacen en la reparación y regeneración de tejidos. Otros procesos biológicos que han sido capturadas con un método similar son el desarrollo embrionario del pez cebra 23,34 y cardiacafunción (no publicado). Este método también ofrece la posibilidad de que la reparación de monitoreo de la herida y la regeneración en las larvas que han sido manipulados genéticamente y farmacológicamente.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al centro de servicio central de animales del Laboratorio Biológico MDI por el mantenimiento del pez cebra. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Premios de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de subvención P20GM104318 (para COBRE) y P20GM103423 (INBRE) y la subvención del Departamento de Defensa – USAMRAA (W81XWH-BAA-1).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reagents
>Bullseye AgaroseMidSciBE-GCA500
Agarosa de bajo punto de fusiónFisher BioReagentsBP1360-100
1-fenil-2-tioureaAlfa AesarL06690
Instant Ocean Aquarium SaltPet store
Azul de metileno (solución al 0,1%)SigmaM9140
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato)Sigma-AldrichE10505
2-FenoxietanolSigma-Aldrich77699
Placa de Petri 35 x 15 mmBD Falcon351008
Placa de Petri 60 x 15 mmBD Falcon351007
Placa de Petri 100 x 25 mmBD Falcon351013
Pipetas de vidrio boroschillate de 5,75 pulgadasFisher
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Vidrio: 0,085-0,115 mm)MatTek CorporationD35-20-0-TOP
Portaobjetos de microscopio Superfrost/PlusFisherbrand12-550-15
Cubreobjetos de vidrioServicios de Microscopía Electrónica72191-75
Cubreobjetos de vidrioWarner InstrumentsCS-18R15
Phifer Phiferglass Mosquitera Carbón - 48"Home Depot
Grasa de alto vacíoDow Corning
Microloader puntas de pipeta 20 µ lEppendorf930001007
Tijeras finas -Herramientas de ciencia fina14037-10
3 ml Luer-Lok™ jeringa desechable BD309657
60 ml Luer-Lok™ jeringa desechableBD309653
23 g jeringa agujas BD305145
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11295-00
Equipment
LabDoctor Mini Dry BathMidSci
Discovery.V12 microscopio compuesto Objetivo Zeiss
Plan Apo S 3.5XZeiss
AxioCam MRm Software Zeiss
Axiovision, versión 4.8.2SP1 (12-2011)Zeiss
con ángulo agudo

Referencias

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115(2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766(2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240(2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Regeneraci n de la aleta caudalim genes de lapso de tiempocicatrizaci n de heridasamputaci n de la aletaan lisis de im genesestereomicroscop adesarrollo larvario
La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.