La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

La capacidad de un organismo para orquestar procesos de reparación de tejidos después de una lesión es crucial para su supervivencia ¹. Si bien todos los animales tienen la capacidad de curar sus heridas, el grado en que los tejidos se regeneran difiere mucho entre las especies. Las especies de vertebras como el pez cebra, las salamandras y los renacuajos ranas tienen la notable capacidad de regenerar los tejidos perdidos, incluidos sus apéndices, partes de sus ojos, corazón y sistema nervioso central ^2-4. Las especies de mamíferos, como el ratón espinoso africano y los conejos, son capaces de regenerar agujeros en sus pinnas ^5-7, y los humanos y ratones regeneran partes de su hígado, así como las puntas de sus dedos durante las etapas fetal y juvenil ^8-12. Aunque aún no se comprende bien por qué y cómo ciertas especies regeneran los tejidos de manera más efectiva que otras, la presencia de vías genéticas similares sugiere que estos mecanismos pueden permanecer latentes en especies sin gran potencial de regeneración ^13,14. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos de reparación y regeneración de tejidos en especies con resultados de regeneración satisfactorios beneficiará la regeneración en humanos.

Hemos elegido la aleta de la cola del pez cebra larvaria como paradigma para demostrar su regeneración con estereoscopía de campo claro time-lapse. La aleta caudal de la larva de pez cebra es anatómicamente simple en comparación con las estructuras adultas más complejas, que consisten en un epitelio plegado de dos capas con axones somatosensoriales que inervan la piel que rodea las células mesenquimales ubicadas medialmente ¹⁵. A pesar de las diferencias anatómicas, la regeneración de la aleta caudal de las larvas es comparable a la regeneración de las aletas adultas en términos de las firmas moleculares y las respuestas de excrecencia ^16,17. En comparación con la aleta adulta, la imagen de la regeneración de la aleta caudal de las larvas tiene, sin embargo, varias ventajas: 1) la regeneración de la aleta larvaria se completa en solo 2-3 días ¹⁶, 2) las larvas se pueden montar en agarosa de bajo punto de fusión, y 3) las larvas no requieren alimentación hasta ~ 5 días después de la fertilización (dpf) debido a la presencia del saco vitelino. Esto hace que las larvas de pez cebra sean ideales para observar la dinámica de reparación de tejidos in vivo.

El método presentado permite capturar la dinámica detallada que subyace a los procesos tempranos de regeneración de aletas. Muchos estudios han utilizado la microscopía confocal basada en fluorescencia para estudiar los procesos biológicos celulares y subcelulares en embriones y larvas de pez cebra. Sin embargo, las sofisticadas configuraciones de imágenes confocales a menudo no son accesibles para todos y son muy costosas en comparación con otras técnicas de imagen. En contraste, la metodología presentada utiliza un microscopio estereoscópico Discovery V12 equipado con el software Axiovision y un módulo de lapso de tiempo, proporcionando así una alternativa más asequible a los costosos equipos de imagen para examinar el comportamiento de los tejidos. Demostramos que este método se puede utilizar para obtener imágenes de la regeneración de tejidos con alta resolución temporal a un costo mínimo. Las implicaciones de este método podrían extenderse más allá de la biología básica para avanzar en los estudios de regeneración de mamíferos utilizando cultivos de órganos, para el desarrollo terapéutico a través de cribados farmacológicos y genéticos, y puede servir como herramienta didáctica en el aula.

El pez cebra (cepa nácar) fueron criados y se crió según los protocolos establecidos. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento, utilizando 0,4 mM tricaína para la anestesia y 1 tricaína mM para la eutanasia. Embriones de pez cebra y larvas fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales según lo aprobado por la comisión competente (Laboratorio Biológico MDI animales núcleo CICUAL número 13-20). Este estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación del Genoma Humano Cuidado de Animales y el empleo Comisión Nacional, MDIBL Aseguramiento Institucional # A-3562-01 bajo el protocolo # 14-09.

Nota: El procedimiento de imagen que captura la regeneración de la aleta en larvas de pez cebra se resume en los siguientes pasos:

1. Aumento de pez cebra a fases larvarias

1. Recoger los huevos y coloque aproximadamente 50 huevos en una placa de Petri de 100 x 25 mm que contiene 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada suplementado con 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N en una incubadora a 28,5 °.
<li> A la mañana siguiente a eliminar los embriones muertos con una pipeta de vidrio y enjuague los huevos en un colador con un 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada (medio embrión llamado).
Nota: Medium, como timbres ^18, Hanks ^{18, 19} E2, E3 ^20, y Danieau ²¹ puede ser preferible.
2. sup> Añadir medio de embriones frescos al plato. Si la utilización de cepas pigmentadas, añadir opcionalmente 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), como PTU evitará la melanogénesis y por lo tanto la pigmentación de las larvas. Deje que los embriones se desarrollan más en la incubadora hasta 2 días después de la fecundación o cualquier otra etapa larval deseado.

2. Preparación de la cámara de imágenes

1. Método 1: Imaging cámaras hechas de PVC o tubo de teflón (Figura 1)
   Nota: Este método es similar a la Concha y Adams (1998) ^22.
   1. Adquirir plástico de calidad del agua de consumo o tubos de teflón en una ferretería con un exterior 25 mmda 20 mm de diámetro interior. Cortar el tubo para hacer anillos de aproximadamente 10 mm de espesor con una superficie uniforme en cada lado. Utilice> 200 papel de lija para suavizar los bordes.
   2. Limpie los anillos con agua tibia y etanol al 70% y dejar secar al aire.
   3. Con una punta de pipeta, aplicar grasa de silicona a la mitad de un anillo y conecte el anillo a un 75 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio. También puede utilizar una jeringa de 3 ml lleno de grasa de silicona en lugar de una punta de pipeta.
      Nota: Debido a que es difícil insertar la grasa de silicona en la jeringa 3 ml, añadir la grasa de silicona a una jeringa de 30 ml primero y utilizar este para el llenado de la jeringa 3 ml.
2. Método 2: Preparación de un plato Petri como una cámara de imágenes.
   1. Adquirir 35 o 60 mm de diámetro placas de Petri con un cubreobjetos de vidrio unido a la tapa (Figura 2A). Alternativamente, como se muestra en la Figura 3 de Distel y Koester (2007) ^23, perforar una abertura lo suficientemente pequeño para hviejo un cubreobjetos en la tapa de una pequeña placa de Petri y aplicar grasa de silicona al exterior con una jeringa de 3 ml. Utilizando una punta de pipeta limpia, con cuidado colocar un cubreobjetos redondo o cuadrado de espesor deseado hacia el exterior (Figura 2B).
3. Para asegurarse de que la agarosa se utiliza para estancias firmemente unidos durante la elaboración de montaje, coloque una malla de plástico fino en el interior del anillo. En primer lugar, cortar la malla hecha de pantalla de la ventana obtenido a partir de una ferretería, en el tamaño del diámetro del anillo interior con unas tijeras finas con un ángulo. A continuación, cortar un pequeño rectángulo> dos veces el tamaño de la larva en el centro de la malla (Figura 1, 2).
4. Aplicar cuatro pequeños puntos de grasa de silicona no tóxico para la interfaz entre la hoja de la cubierta y el anillo de la cámara (Figura 1A).
5. El uso de fórceps para sujetar firmemente la malla a la parte inferior de la cubreobjetos de vidrio.

3. Montaje e Imagen de la Pre-injured Larva (este paso es opcional)

Nota: Este paso es adecuado para las comparaciones entre la longitud de la aleta amputada y regenerada, como el plano de amputación después de la regeneración de la aleta no es reconocible en larvas de pez cebra.

1. Preparar una solución de agarosa al 0,5-1,2% bajo punto de fusión en medio de embrión para la inmovilización de la muestra.
2. Calentar la agarosa en un microondas y transferir la agarosa líquido en tubos de 1,5 ml que se pre-calienta a 42 ° C en un calentador.
3. Deje que la agarosa caliente, déjelo enfriar a 42 ° C, que puede mantenerse durante varias semanas a esta temperatura. Trate de evitar pipetear las larvas en agarosa encima 42 ° C, ya que esto será perjudicial para los animales.
4. Anestesiar a varias larvas usando 10 ml de 0,4 mM tricaína (pH 7) en medio de embrión en una placa de Petri de diámetro 60 mm. Prepare el tricaína según el Libro Recetas de pez cebra ^18.
   1. Alternativamente, utilizar 10 ml de una dilución 1: 1000 de 99% 2-fenoxietanol en una placa Petri de diámetro de 60 mm. Meter las larvas con una punta de pipeta microloader nevadas para evaluar su respuesta al tacto antes de proceder. Utilice sólo las larvas no responde.
5. Transferir una larva en la solución de gelosa a 42 ° utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. No transfiera líquido excesivo en la agarosa, de lo contrario la agarosa será demasiado diluida y se solidifica.
6. Deseche el líquido restante de la pipeta y transferir la larva con una gota de agarosa en una pequeña placa de Petri (35 o 60 mm de diámetro). Coloque la larva en su lado de la imagen de la aleta caudal.
7. Deje que la agarosa se solidifique. Evaluar la agarosa con una punta de pipeta de plástico; la punta se sumerja en la agarosa si es demasiado líquido. Una vez que la agarosa se ha solidificado, una pequeña hendidura será visible al tocar con la punta de la pipeta. Después de la solidificación, añadir solución tricaína y proceder al microscopio estereoscópico que se utilizará más tarde para time-lapse.
   
8. Utilice un microscopio estereoscópico con el software de lapso de tiempo. Seleccione un objetivo y ampliación apropiado, que se utilizará más tarde para time-lapse. En este caso, utilice un 3,5 x 16 mm, distancia de trabajo de la lente objetivo en un microscopio estereoscópico. Según se desee, utilizar microscopios alternativos y lentes de objetivos, sino elegir un aumento adecuado para tener en cuenta el potencial xy de la deriva y el crecimiento de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes.
9. Seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio.
10. En el software, seleccione el modo "en vivo" para ver la larva en la pantalla.
11. Abra la ventana "Propiedades" para detectar automáticamente el brillo.
12. Para ajustar manualmente el contraste en la base trans-iluminación microscopio.
13. Mueva la larva del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado para minimizar fondo noise.
14. Coloque la larva de nuevo en el campo de visión y tomar una instantánea. Guarda la imagen.
15. Retire la agarosa de la larva por primera raspando la agarosa de la cabeza. De esta forma la larva puede deslizarse fuera de la agarosa tirando suavemente la cabeza lejos de la agarosa restante con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos.
16. Con una pipeta Pasteur de vidrio transferir la larva en una solución tricaína fresco.

4. Amputación Ensayo

1. Preparar una solución de agarosa al 1,5% usando medio de embrión y se vierte una capa delgada en una placa de Petri. Deje que la agarosa se solidifique.
2. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque el lateral larva en la agarosa solidificada y amputar la aleta de la cola con una G aguja de la jeringa 23 con una ligera presión (Figura 3A).

5. Montaje de la Larva de time-lapse

1. Proceda como se describe en los pasos 3.1 a 3.5 (Figura 3B).
2. Para permitir la cicatrización de las heridas o la regeneración de tejidos que se produzca, raspar con cuidado la agarosa que rodea la aleta de la cola distal con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. Trate de no lesionar la aleta repetidamente (Figura 3C).
3. Decantar la solución tricaína contiene el eliminado de agarosa y llenar el anillo de la cámara con solución tricaína fresco.
4. Aplicar grasa de silicona a la parte superior del anillo y adjuntar una cámara de 75 mm x 25 mm portaobjetos de vidrio. Trate de evitar las bolsas de aire en la cámara, ya que interferirán con las imágenes de campo claro y desecar la larva en el tiempo.
5. Si se utiliza una placa de Petri comouna cámara de formación de imágenes, se aplica grasa de silicona para el borde superior de la cámara inferior y llenar la cámara inferior con la solución de tricaína. Decantar cuidadosamente la solución tricaína en la tapa y gire la tapa sobre sumergir la larva en la solución tricaína de la cámara inferior en un ligero ángulo para evitar bolsas de aire. La cámara será sellado debido a la grasa de silicona.

Imagen 6. Time-lapse

1. Montar una cámara de incubación se calienta como se describe en ^23,24 (Figura 4) .Colocar la cámara de incubación alrededor del microscopio y encender la calefacción. Ajustar la temperatura a 28 ° C durante aproximadamente 10 a 20 minutos o hasta que la temperatura se ha estabilizado.
2. Abra la parte delantera de la cámara de incubación climatizada y colocar la cámara de imágenes en el soporte microscopio con el cubreobjetos hacia arriba hacia el objetivo.
3. Coloque la aleta larval de una manera que 2/3 de la campo de visión permanece desocupado. Esto asegura la captura de lacrecimiento y la regeneración de la aleta en el transcurso del procedimiento de formación de imágenes sin tener que cambiar la posición de la larva.
   1. Ajuste la larva montado a 28 ° C durante ~ 30 minutos antes de iniciar la grabación a intervalos regulares para evitar cambios en la intensidad de campo claro o posibles cambios de la agarosa. Alternativamente, utilizar tampón de pre-calentado para comenzar de formación de imágenes después de corto tiempo de ajuste.
4. Para configurar la grabación de lapso de tiempo, abra la ventana 6D Multidimensional Adquisición en el software Axiovision y seleccione la opción z-stack y time-lapse.
5. Opcional) En la pestaña z-pila y Modo Loncha, seleccione el grosor de corte y luego seleccionar el modo de inicio / parada.
6. Definir la posición superior e inferior de la pila.
7. En la pestaña de lapso de tiempo, seleccione el intervalo y la duración de la película y luego comenzar la película pulsando el botón de inicio. Encontramos que intervalos de 30 minutos son suficientes y este intervalo no genera datos excesivos; Sin embargo shorteintervalos R pueden ser utilizados.
8. Compruebe las dimensiones de posición y z-stack durante la primera hora si la larva no fue pre-ajustado. Si es necesario, vuelva a colocar la larva de nuevo después de un día, como la larva puede haber cambiado.
9. Guarde el archivo al final de la grabación a intervalos regulares y proceder con el post-procesamiento y cuantificaciones utilizando el software de análisis de imágenes disponibles, como Imaris ²⁵ o el código abierto paquetes de software Image J ²⁶ y ^{27 de} Fiji.

Análisis 7. Datos

1. La determinación de la longitud de la aleta.
   1. Abre la película de lapso de tiempo en el software de imagen y guardar los archivos en el formato de archivo propietario para mejorar el rendimiento del software.
   2. Seleccione la vista ortogonal a mostrar secciones individuales como pilas proyectadas. Para la corrección de la deriva, en el menú de Fiji, seleccione Complementos y Registro, y 'deriva 3D correcta'. Esto abrirá una ventana de Fiji y realizar las correcciones de deriva. Correctoderiva de rotación en la función Spots Imaris. Alternativamente, instalar los plugins StackReg y TurboReg en la imagen J e importar a Fiji. Elija el algoritmo de transformación deseada en el plugin StackReg.
   3. Para medir distancias (por ejemplo, diámetro de la herida o la longitud de la aleta), seleccione la opción "agregar nuevos puntos de medición" en la barra de herramientas de la izquierda superior.
      1. En 'lista Configurar de Estadísticas visibles Valores' en el menú inferior izquierda, seleccione los valores de los estadísticos que se mostrarán.
      2. En el "Modo de línea" bajo la pestaña Configuración, seleccione 'pares (AB, CD ...).
      3. En 'Labels Propiedades' select 'Nombre' y 'Distancia', para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición.
      4. Cambie al modo "Editar" y mantenga presionado el botón de desplazamiento para seleccionar el primer punto al final de la notocorda. A continuación, utilice la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el margen distal de la aleta.
      5. En la pestaña "Estadísticas", seleccione el botón de disco (Exportar todo) en la parte inferior derecha para mostrar y exportar la distancia en la imagen.
      6. Repita las mediciones a la hora seleccionada moviendo el deslizador por debajo de la imagen de la derecha. En lugar de crear nuevos puntos de medición, los anteriores se pueden reposicionar primero seleccionando el punto con el botón izquierdo del ratón, a continuación, al mismo tiempo presionando el desplazamiento y el botón izquierdo del ratón en la nueva posición.
   4. Como alternativa a la opción Puntos de Medición, utilizar el espectador rebanada para medir distancias. En el modo de vista de la rebanada, desplácese hasta la posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón. Se mostrará la distancia. Esta opción sin embargo no permite la exportación de datos.
2. La determinación de longitud de la aleta y el área en ImageJ.
   1. Abre la película de lapso de tiempo en ImageJ usando un plugin que reconoce el formato de archivo .zvi. Como alternativa, cargue en un Quarchivo ickTime o secuencia tiff.
      Nota: Si utiliza un formato de archivo TIFF sin comprimir, las dimensiones de la imagen no es necesario que se determine.
   2. Si la apertura de un formato de archivo diferente sin la información del archivo, seleccione "Escala de Ajuste" en el menú "Analizar" para definir primero la distancia de la imagen y la unidad. En el 'menú Escala Set', escriba el 'Distancia en píxeles ", a continuación el tipo de la" distancia Conocido' para el valor de píxel (esto se puede obtener midiendo el número de píxeles en una barra de escala que se ha añadido a la imagen , a continuación, haga clic en Medir para obtener el resultado), y la "Unidad de longitud '(normalmente' m '). Luego haga clic en Aceptar.
   3. Para mediciones de área de aleta seleccionar la herramienta "Selección a mano alzada" en la barra de herramientas y describen el área de la aleta manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras dibuja a lo largo del contorno de la aleta. Para mediciones de la longitud de la aleta, seleccione la herramienta de línea de 'Straight "y trazar una línea entre los puntos deseados para sermedido.
   4. Haga clic en la opción "Medir" en "Analizar" para visualizar el área y la longitud de la aleta. Repita este paso tantas veces como sea necesario para múltiples puntos de tiempo de la película.
3. Utilizando las estadísticas de software, los datos pueden visualizarse gráficamente.

La técnica presentada es adecuada para dilucidar la dinámica de reparación de tejidos en respuesta a la amputación. La película demuestra que la amputación de la aleta provoca inicialmente un efecto en bolsa de tabaco, que se caracteriza por contracciones a través de cables de actina-miosina que están presentes en la aleta 28 veces (Figura 5 A, B). Al mismo tiempo, las células se extruyen de la herida (véase la película). La contracción puede ser por tanto un medio para expulsar las células que probablemente están destinados a someterse a la muerte celular. Nuestros resultados muestran además que el crecimiento del desarrollo de la larva se produce independientemente de la regeneración (película), mientras que la regeneración de la aleta no inicia hasta la amputación poste sobre 14 horas, medido por longitud de la aleta y el área en el transcurso de tiempo de 36 horas después de la amputación (Figura 5C , D). El crecimiento de la aleta regenerativo total después de 1,5 días era aproximadamente el 60% de la longitud de la aleta original (Figura 5E). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que tr amputación Iggers contracción aleta, extrusión de las células de la herida, y una respuesta regenerativa temporalmente retardada. Mientras que las células extruidos se probablemente destinados a experimentar la muerte celular, la naturaleza de estas células necesita una mayor aclaración.

Figura 1. Imagen de montaje anillo de la cámara

(A) Se muestra un anillo de plástico que está unida a un cubreobjetos con grasa de silicona. Una malla de plástico está fijada en el interior de la cámara con cuatro pequeños puntos de grasa de silicona. (B) La cámara que contiene la larva montada se llena con una solución de tricaína y un portaobjetos de vidrio está unido a la parte superior. (C) Un montado de 2 días de edad larva (flecha) se muestra a mayor aumento para representar su tamaño en relación a la malla."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. cámara Imaging asamblea hecha de placas de Petri. (A) Se muestra una tapa de cristal placa de Petri con fondo de cristal comercial con una malla de plástico unido a la cubreobjetos de vidrio. (B) Se muestra una cámara de Petri plato de auto-construida con un agujero perforado en la tapa y un cubreobjetos adjunto desde el exterior con grasa de silicona. La malla y la larva se montan dentro de la cámara que contiene la solución tricaína. Para sellar la cámara, grasa de silicona se aplica en el borde superior externo de la cámara inferior y la tapa superior adjunto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Esquema de la amputación y el montaje de una larva para la imagen. (A) Para la amputación, coloque una larva anestesiado sobre una placa de Petri de agarosa-revestido y amputar la aleta de la cola con una aguja de jeringa. (B) Para el montaje, la transferencia de la larva con una pipeta de transferencia en un tubo de 1,5 ml lleno con 42 ° C de agarosa líquida y la pipeta una gota que contiene la larva en la cámara de formación de imágenes, orientar el pescado y cubrir el solidificado de agarosa con medio de embrión. (C) Raspe la agarosa de la aleta de la cola con una punta de pipeta microloader tapado o herramienta similar y sustituir medio de embriones con medio fresco. (D) La imagen de la aleta de la cola bajo un microscopio estereoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. dinámica de regeneración de aleta. (A) Esquema del método de ensayo de la amputación y la cuantificación aleta caudal utilizado para determinar la longitud de la aleta (flecha roja) y el área (contorno rojo de la aleta). (B) de la cola de la aleta amputación activa inicialmente la contracción de la aleta, seguido de Regeconsecuencia tejido nerative. La aleta también experimenta crecimiento del desarrollo, como lo demuestra el aumento de tamaño lateral. (C) se muestra la longitud de la aleta como una función del tiempo, revelando un crecimiento regenerativo de partida lineal a ~ 14 hPa. (D) La cuantificación del área de la aleta revela un descenso inicialmente en tamaño, lo que puede atribuirse a la contracción de la aleta. Después de ~ 14 horas, que aumenta el tamaño de las aletas a una velocidad lineal. (E) La comparación de la longitud de la aleta antes de la amputación y después de 36 horas muestra ~ 60% de crecimiento. Barra de escala: 100 micras Abreviaturas: pre-amplificador, pre-amputación; horas después de la amputación, hpa; regeneración, la regeneración; amplificador, la amputación Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película . Fin de regeneración en el transcurso de tiempo de 36h. Se muestra una aleta de la cola de un viejo larva 2,5-día durante el curso de la regeneración. A partir de post amputación 30 min crecimiento regenerativo se forma la imagen en intervalos de 30 minutos en un microscopio estereoscópico utilizando una lente objetivo 3.5x.

Los autores no tienen nada que revelar.