Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

Resumen

Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones. Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.

Resumen

De manera similar a los tejidos sanos, muchos de sangre y tumores malignos sólidos están ahora cree que están organizados jerárquicamente, con un subconjunto de células de cáncer de tallo como la auto-renovarse mientras que da lugar a la progenie diferenciada. La comprensión y la orientación de estas células madre del cáncer en el cáncer de mama, que pueden poseer mejorado quimio y radio-resistencia en comparación con el volumen del tumor no tallo, se ha convertido en un área de investigación importante. Marcadores incluyendo CD44, CD24, y la actividad de ALDH se pueden evaluar usando células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar de forma prospectiva células que muestran una mayor tumorigenicidad cuando se implantan en ratones inmunodeficientes: el ensayo mammosphere también se ha convertido en ampliamente utilizado por su capacidad para identificar de forma retrospectiva esfera- formación de células que se desarrollan a partir de clones de células madre similares sola. Aquí resumimos los enfoques para el cultivo apropiado de mammospheres partir de líneas celulares o muestras de pacientes primarios, su pases, y los cálculos para estimar esfera feficiencia orming (SFE). En primer lugar se discuten consideraciones clave y las trampas en la planificación y la interpretación de los experimentos mammosphere apropiado.

Introducción

La existencia de linajes de células tumorales encabezadas por las células madre del cáncer de tallo como ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la heterogeneidad del tumor. Mientras que algunos diversidad fenotípica en los tumores no surgen de la excrecencia clonal de clones genéticamente distintas, un componente sustancial parece resultar de diferencias epigenéticas: las células cancerosas pueden transición (a veces de forma reversible) entre el vástago, progenitor, y los estados diferenciados través de la activación o represión de genes específicos programas de expresión ^1-3. Esto puede reflejar celulares factores intrínsecos o extrínseco....

Protocolo

Los procedimientos a continuación han sido éticamente aprobado por el Imperial College de Londres.

1. Generación de mammospheres primarias de Mama Humano líneas celulares de cáncer

NOTA: Realice los siguientes pasos debajo de una campana de cultivo estéril.

1. Prepare mammosphere los medios de comunicación que contiene DMEM / F12 suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Preparar medio completo inmediatamente antes del uso mediante la adición de 20 factor de ng / ml recombinante de crecimiento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml de factor recombin....

Resultados

Diferentes muestras o los sometidos a diferentes tratamientos pueden variar en el número de mammospheres> 40 micras que se forman después de la normalización para las células iniciales sembradas. Calcular formando mammosphere eficiencia (MFE) para cada tratamiento crecido por triplicado. Esto permite experimentos con diferentes densidades de siembra que deben compararse. Los datos se muestra mejor en un gráfico de barras, idealmente con controles positivos y negativos, y la visualización de la desviación estándar a t.......

Discusión

Evaluación exitosa de mammospheres primaria y secundaria se basa en las células se sembraron a densidades suficientemente bajas que mammospheres forma de clones individuales, con un mínimo de agregación esfera. Sin embargo a densidades que son demasiado bajo, demasiado pocos mammospheres pueden formar para distinguir los efectos de los tratamientos estadísticamente. Densidad de siembra debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que pueden variar considerablemente en sus formando esfera eficiencia (los que.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamina	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicilina & Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Factor de crecimiento básico recombinante de fibroblastos humanos (bFGF)	R& D systems	233-FB-025
1x B27 suplemento	Invitrogen	17504-044
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0,5% tripsina/0,2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Suero fetal para terneros	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Placas de 6 pocillos de baja fijación	Corning	CLS3814
Colagenasa tipo 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hialuronidasa	Sigma Aldrich	H3506
Hojas de afeitar estériles	Fisher Scientific	12443170
Bisturí estéril	Fisher Scientific 11758353
Microdisección estéril tijeras	Sigma Aldrich	S3146