Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones. Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.
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Artículo de método
Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares
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Resumen
Resumen
De manera similar a los tejidos sanos, muchos de sangre y tumores malignos sólidos están ahora cree que están organizados jerárquicamente, con un subconjunto de células de cáncer de tallo como la auto-renovarse mientras que da lugar a la progenie diferenciada. La comprensión y la orientación de estas células madre del cáncer en el cáncer de mama, que pueden poseer mejorado quimio y radio-resistencia en comparación con el volumen del tumor no tallo, se ha convertido en un área de investigación importante. Marcadores incluyendo CD44, CD24, y la actividad de ALDH se pueden evaluar usando células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar de forma prospectiva células que muestran una mayor tumorigenicidad cuando se implantan en ratones inmunodeficientes: el ensayo mammosphere también se ha convertido en ampliamente utilizado por su capacidad para identificar de forma retrospectiva esfera- formación de células que se desarrollan a partir de clones de células madre similares sola. Aquí resumimos los enfoques para el cultivo apropiado de mammospheres partir de líneas celulares o muestras de pacientes primarios, su pases, y los cálculos para estimar esfera feficiencia orming (SFE). En primer lugar se discuten consideraciones clave y las trampas en la planificación y la interpretación de los experimentos mammosphere apropiado.
Introducción
La existencia de linajes de células tumorales encabezadas por las células madre del cáncer de tallo como ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la heterogeneidad del tumor. Mientras que algunos diversidad fenotípica en los tumores no surgen de la excrecencia clonal de clones genéticamente distintas, un componente sustancial parece resultar de diferencias epigenéticas: las células cancerosas pueden transición (a veces de forma reversible) entre el vástago, progenitor, y los estados diferenciados través de la activación o represión de genes específicos programas de expresión 1-3. Esto puede reflejar celulares factores intrínsecos o extrínsecos, que refleja la expresión génica programa que actualmente se expresa en una célula con su señalización autocrina resultante en conjunción con la señalización paracrina de la vecina cáncer, del estroma o células inmunes entrega de factores moduladores, y las condiciones microenviromental tales como el grado de hipoxia 2,4,5.
Aunque innovadores enfoques linaje de rastreoavanzan nuestra capacidad para estudiar las células madre del cáncer putativos en su in vivo nicho 6-8, los ensayos de formación de esferas siguen siendo un método popular y conveniente para estimar el potencial de las células de cáncer de mama de comportarse como células madre, al menos en las condiciones de ensayo utilizados. A menudo se utiliza junto con los métodos retrospectivos de las células madre del cáncer de purificación, por su expresión de marcadores de membrana CD44 y CD24 9, y los niveles de actividad de la enzima ALDH (aldehído deshidrogenasa) 10, los marcadores que se han propuesto para corresponder a más mesenchymal- y epitelial Las células madre del cáncer -como respectivamente 11. El enfoque de formación de esferas fue desarrollado primero como el ensayo neurosphere, lo que permite el crecimiento de las células madre putativas de clones individuales en condiciones libres no adherentes, de suero con la adición de factor de crecimiento epitelial (EGF) 12, después de ser útil aplicar a normal y canceroso tejidos de la mama.
La identidad de la célula fundadora de formación de esferas, y los tipos de células mixtas que integran la masa esfera, son relevantes para las inferencias que se pueden hacer desde mamográfica, o ensayos de formación de otra esfera. Células óseas quiescente fide madre a largo plazo, que se cree que descansan en fase G0, no experimentará la combinación precisa de factores que favorecerían la activación in vivo. El ensayo mammosphere vez permite el crecimiento de células o bien preparada para la división mitótica o ya divisorias 13. Estos progenitores, aunque no realmente una célula quiescente, pueden ser la etapa de célula que prolifera con los mitógenos de EGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados en el ensayo. Sin embargo, contienen una serie de señalización asociada a las células madre activado vías 14. Además, la tasa de su formación se refiere a la tumorigenicidad del tejido que se tomaron de, cuando se mide por su potencia en ensayos de dilución limitada en xenoinjertos de ratón 2,15,16 </ Sup>.
Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar células individuales y generar mammospheres primarias de ambas líneas celulares de cáncer de mama humano y muestras clínicas de los tumores de mama. También describe cómo realizar pases seriados de mammospheres primarios para evaluar la auto-renovación, y la forma de calcular la eficiencia esfera que permite la comparación entre diferentes densidades de siembra (véase el esquema de la figura 1) que forma.
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Protocolo
Los procedimientos a continuación han sido éticamente aprobado por el Imperial College de Londres.
1. Generación de mammospheres primarias de Mama Humano líneas celulares de cáncer
NOTA: Realice los siguientes pasos debajo de una campana de cultivo estéril.
- Prepare mammosphere los medios de comunicación que contiene DMEM / F12 suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Preparar medio completo inmediatamente antes del uso mediante la adición de 20 factor de ng / ml recombinante de crecimiento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml de factor recombinante humano de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF; R & D Systems) y suplemento 1x B27.
- Aspirar los medios de frasco que contiene las células MCF-7 o MDA-MB-231 células adherentes (o una línea celular de cáncer de mama de su elección; 70-80% de confluencia), se lavan dos veces en PBS 1x y trypsinize células.
- Centrifugar las células a 200 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Sobrenadante y volver a suspender las células de decantación en 1-5 ml de medio mammosphere. Pipetaarriba y abajo y si es necesario, utilice un filtro de tapa filtro de células de 40 micras para obtener la suspensión de una sola célula. Utilice un hemocitómetro para asegurar una suspensión de células se ha formado (si no, utilizar una aguja de 25 G a la jeringa de la suspensión celular hasta 3 veces).
- Si CD44 + CD24- aislado necesario subconjunto celular a través de FACS usando anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticuerpos monoclonales anti-CD44 9-fluoresceína. Alternativamente, aislar dicha población usando una célula magnético activadas por la clasificación del sistema (MACS) con anti-CD44 y anti-combinados microperlas CD24-biotina según las instrucciones del fabricante. Realice la selección positiva utilizando LS columnas, y la selección negativa utilizando columnas de LD y confirmar los fenotipos de todas las células aisladas por citometría de flujo 17.
- Calcular el número de células viables por ml utilizando azul de tripano.
NOTA: La viabilidad celular se calcula como el número de células viables dividido por el número total de células dentro de las rejillas en el hemocyfotómetro. Las células que ocupan azul tripán se consideran no viables. El siguiente procedimiento se utiliza para determinar con precisión la proporción de células viables.- Preparar una solución de 0,4% de azul de tripano en PBS. Añadir 0,1 ml de solución madre de azul de tripano a 1 ml de las células. Cargar un hemocitómetro y examinar inmediatamente bajo un microscopio a bajo aumento. Contar el número de células totales y el número de células de tinción con azul.
Las células viables = [1,00 - (Número de células azules ÷ Número de células totales)] × 100. - Para calcular el número de células viables por ml de cultivo, utilizar la siguiente fórmula. Recuerde que debe corregir el factor de dilución.
Número de células viables × 10 × 1,1 = 4 células / ml de cultivo
- Preparar una solución de 0,4% de azul de tripano en PBS. Añadir 0,1 ml de solución madre de azul de tripano a 1 ml de las células. Cargar un hemocitómetro y examinar inmediatamente bajo un microscopio a bajo aumento. Contar el número de células totales y el número de células de tinción con azul.
- Resuspender una cantidad predeterminada de células en 2 ml de medio mammosphere completos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos adherente ultra-bajo. La densidad de siembra es normalmente 500-4.000 células / cm 2 células por pocillo. Uso Opcionalmente low de fijación placas de 24 pocillos, mientras que la siembra de células a la misma densidad en 0,5 ml de medios de comunicación.
Nota: Se recomienda la optimización de la densidad y la hora de la cultura de siembra para cada líneas celulares de interés. - Incubar bajo fijación 6 y placas de ultra a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 5-10 días (dependiendo de la línea celular y el tamaño de mammospheres) sin molestar a las placas, en particular durante la fase de crecimiento de los primeros 5 días .
2. Generación de mammospheres primarias de muestras clínicas de cáncer de mama humano
NOTA: el tejido de cáncer de mama humano puede obtenerse de pacientes sometidos a cirugía para la eliminación de tumores de mama. Tejido de la tienda en hielo durante hasta 24 horas en tubos de 50 ml estériles en medios de cultivo que contiene 100 U / ml de penicilina y 100 U / ml de estreptomicina. Lleve a cabo los siguientes pasos bajo una campana de cultivo estéril.
- Transferir la muestra en un plato de 100 mm de tejido de Petri con un pequeño volumen de medios de comunicación. Remove el tejido adiposo con unas tijeras estériles, bisturí y pinzas.
- Añadir 2-3 ml de DMEM / F12 y picar la muestra en 1 mm 3 piezas con un escalpelo estéril u hoja de afeitar hasta que no haya piezas grandes se mantienen.
- Resuspender las piezas de tejido en pre-calentado 10 ml de DMEM que contiene enzimas proteolíticas (3000 U / ml de colagenasa y 1.000 U / ml de hialuronidasa) y se incuba a 37 ° C en un agitador rotatorio hasta que se digieren todos los fragmentos de tejido. Por lo general, la digestión completa tarda 1-3 horas. Ajuste el tiempo de digestión de acuerdo con caracteres patológicos de los tumores. (Por ejemplo adenocarcinoma de mama es generalmente más difícil de digerir en comparación con carcinoma mucinoso, que es más frágil y necesita más corto tiempo de digestión). Evaluar el grado de digestión cada media hora observando 20 l suspensión bajo hemocitómetro.
- Permitir que los fragmentos sedimentar durante 5 min, luego transferir el sobrenadante en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 10 min a tem habitaciónambiente. Decantar con cuidado las células sobrenadante y resuspender en 1 - 5 ml de medios mammosphere.
- Siga los pasos 1.1 a 1.4 descritas anteriormente para las líneas celulares para la obtención y la placa de suspensiones de células individuales. Pasan células a través de la jeringuilla 25 G un máximo de 2 veces si es necesario para limitar las células perjudiciales.
3. La formación de mammosphere Eficiencia (%) Cálculo
- Después de que el período de cultivo, contar los mammospheres (mayor que 40 m) de diámetro bajo un microscopio a 40 aumentos. Imagen digitalmente 5 campos aleatorios utilizando una cámara digital en un microscopio de luz y determinan el tamaño mammospheres utilizando el software de adquisición. Utilice cualquiera de Análisis de Imágenes Software.
- Calcular mammosphere eficacia de formación (MFE%) usando la siguiente ecuación:
MFE (%) = (# de mammospheres por pocillo) / (# de células sembradas por pocillo) x 100
4. pasada en serie de mammospheres para la Evaluación de la auto-renovación
- Pipeta los medios de comunicación que contiene las mammospheres de cada pocillo a un tubo de 15 ml. Lavar los pocillos con PBS y añadir a los medios de comunicación recogidos. Centrifugar a 115 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l de 0,5% de tripsina / 0.2% EDTA pre-calentado. Incubar durante 2-3 minutos.
- Añadir 500 l de FCS para neutralizar la tripsina. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y pellet se resuspende en 100 l de mammospheres medios de comunicación, la pipeta hacia arriba y hacia abajo para desagregar las esferas.
- Contar las células con un hemocitómetro y determinar si las células están en suspensión de células individuales. Si no pasa a través de una jeringa 25 G hasta 3 veces para obtener células individuales. Sembrar las células en un nuevo mínimo apego placa de 6 pocillos de ultra a la misma densidad utilizado en la generación primaria.
- Después de 5-10 días, contar esferas> 40 micras y calcular la eficiencia de formación de esferas mediante la fórmula informado antes.
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Resultados
Diferentes muestras o los sometidos a diferentes tratamientos pueden variar en el número de mammospheres> 40 micras que se forman después de la normalización para las células iniciales sembradas. Calcular formando mammosphere eficiencia (MFE) para cada tratamiento crecido por triplicado. Esto permite experimentos con diferentes densidades de siembra que deben compararse. Los datos se muestra mejor en un gráfico de barras, idealmente con controles positivos y negativos, y la visualización de la desviación estándar a t...
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Discusión
Evaluación exitosa de mammospheres primaria y secundaria se basa en las células se sembraron a densidades suficientemente bajas que mammospheres forma de clones individuales, con un mínimo de agregación esfera. Sin embargo a densidades que son demasiado bajo, demasiado pocos mammospheres pueden formar para distinguir los efectos de los tratamientos estadísticamente. Densidad de siembra debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que pueden variar considerablemente en sus formando esfera eficiencia (los que...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses que pueda percibirse como un perjuicio para la imparcialidad de este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por el BRC Imperial, el Instituto Nacional de Investigación en Salud y Acción Contra el Cáncer con mención especial a Hilary Artesanía y Sir Douglas Myers.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamina | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicilina & Estreptomicina | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Factor de crecimiento básico recombinante de fibroblastos humanos (bFGF) | R& D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 suplemento | Invitrogen | 17504-044 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0,5% tripsina/0,2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Suero fetal para terneros | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Placas de 6 pocillos de baja fijación | Corning | CLS3814 | |
| Colagenasa tipo 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hialuronidasa | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Hojas de afeitar estériles | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Bisturí estéril | Fisher Scientific 11758353 | ||
| Microdisección estéril tijeras | Sigma Aldrich | S3146 |
Referencias
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