Aquí, documentamos el uso del ensayo de formación de colonias de agar blando para probar los efectos de un inhibidor de la enzima peptidilarginina deiminasa (PADI), BB-Cl-amidina, sobre la tumorigénesis del cáncer de mama in vitro.
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Artículo de método
Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama
En este artículo
Resumen
Resumen
Dadas las dificultades inherentes a la investigación de los mecanismos de progresión tumoral in vivo, los ensayos basados en células, como el ensayo de formación de colonias de agar blando (en lo sucesivo denominado ensayo de agar blando), que mide la capacidad de las células para proliferar en matrices semisólidas, siguen siendo un sello distintivo de la investigación del cáncer. Una ventaja clave de esta técnica sobre los ensayos convencionales de cultivo de células esferoides en 3D o monocapa en 3D es la imitación cercana del entorno celular 3D a la observada in vivo. Es importante destacar que el ensayo de agar blando también proporciona una herramienta ideal para probar rigurosamente los efectos de nuevos compuestos o condiciones de tratamiento sobre la proliferación y migración celular. Además, este ensayo permite la evaluación cuantitativa del potencial de transformación celular en el contexto de las perturbaciones genéticas. Recientemente identificamos la peptidilarginina deiminasa 2 (PADI2) como un potencial biomarcador y diana terapéutica del cáncer de mama. En este trabajo destacamos la utilidad del ensayo de agar blando para estudios preclínicos contra el cáncer al probar los efectos del inhibidor de PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), sobre la tumorigénesis de las células de carcinoma ductal humano in situ (MCF10DCIS).
Introducción
Tanto las células no transformadas (normales) como las transformadas pueden proliferar fácilmente en un cultivo monocapa 2D. Esta forma de crecimiento celular adherente es bastante diferente de la que ocurre in vivo donde, en ausencia de estimulación mitogénica, las células no suelen dividirse rápidamente dentro de su microambiente. Por otro lado, el ensayo de agar blando se distingue de los sistemas de cultivo 2D porque cuantifica la tumorigénesis midiendo la capacidad de una célula para proliferar y formar colonias en suspensión dentro de un gel de agarosa semisólido1. En este contexto, las células no transformadas no pueden propagarse rápidament....
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Protocolo
1. Preparación de 3% 2-hidroxietil agarosa
- En un frasco de vidrio de 100 ml limpio y seco, añadir 0,9 g de 2-hidroxietilo agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada.
- Microondas la mezcla durante 15 segundos y suavemente remolino. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelve totalmente.
- Autoclave la botella que contiene solución durante 15 min.
- Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Guarde la solución a temperatura ambiente.
2. Preparación de la capa inferior: 0,6% en gel de agarosa
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Resultados
El ensayo de formación de colonias en agar blando se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones que documentan la tumorigenicidad de las células cancerosas. Una ventaja principal de esta técnica es que la matriz semi-sólido favorece selectivamente el crecimiento de células que pueden proliferar en una manera independiente de anclaje. Este rasgo se exhibe principalmente por las células cancerosas, pero no por las células normales. Utilizamos principalmente esta técnica para probar la eficacia de inhibición del c.......
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Discusión
La tasa de formación de colonias en agar blando varía dependiendo del tipo de célula 9. Por lo tanto, el número de células para iniciar con debe ser optimizado y ajustado en consecuencia. Una gama de partida sugerido es de entre 5 x 10 02 al 01 x 10 4 células por pocillo utilizando una placa de 6 pocillos. Además, tamaño de las colonias varía en función de la tasa de crecimiento de cada célula. Por lo tanto, se necesita un predefinido un punto de corte para el tamaño de colonia para anot.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos al Dr. Richard Cerione, al Dr. Marc Antonyak y Kelly Sullivan, de la Universidad de Cornell, por proporcionar asesoramiento técnico, y a la Dra. Gerlinde Van de Walle, de la Universidad de Cornell, por compartir su microscopio invertido Olympus CKX41.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Zeiss Axiopot | Carl Microscopía Zeiss Microscopio | 1021859251 | |
| invertido | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donante Suero equino | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hidroxietilagirasa: Tipo VII, baja temperatura de gelificación | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Referencias
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A.....
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Reimpresiones y permisos
