Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Tanto las células no transformadas (normales) como las transformadas pueden proliferar fácilmente en un cultivo monocapa 2D. Esta forma de crecimiento celular adherente es bastante diferente de la que ocurre in vivo donde, en ausencia de estimulación mitogénica, las células no suelen dividirse rápidamente dentro de su microambiente. Por otro lado, el ensayo de agar blando se distingue de los sistemas de cultivo 2D porque cuantifica la tumorigénesis midiendo la capacidad de una célula para proliferar y formar colonias en suspensión dentro de un gel de agarosa semisólido¹. En este contexto, las células no transformadas no pueden propagarse rápidamente en ausencia de anclaje a la matriz extracelular (MEC) y sufren apoptosis, un proceso conocido como anoikis. Por el contrario, las células que han sufrido una transformación maligna pierden su dependencia de anclaje debido a la activación de vías de señalización como la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Akt y Rac/Cdc42/PAK. Por lo tanto, estas células son capaces de crecer y formar colonias dentro de la matriz de agar blando semisólido².

Un uso común del ensayo de agar blando es probar si compuestos específicos, como los inhibidores de PADI, son capaces de suprimir el crecimiento tumoral in vitro. En general, el recuento de colonias o el tamaño de las colonias son lecturas cuantitativas del ensayo que se pueden comparar entre los grupos de control y tratamiento para evaluar las diferencias en la tumorigénesis celular. Por lo tanto, si se encuentra que la formación de colonias está inversamente correlacionada con el aumento de la concentración del fármaco, entonces se podría llegar a la conclusión de que el fármaco es un inhibidor eficaz de la tumorigénesis in vitro. Por otro lado, si el fármaco no afecta a la formación de colonias, el fármaco no está en la dosis adecuada o no es un inhibidor tumorigénico eficaz. Además de utilizar un ensayo de agar blando para probar el efecto antitumoral de un fármaco, este ensayo también se puede utilizar para sondear la relación entre un gen específico y la tumorigénesis. Por ejemplo, el efecto de la supresión de la expresión de PADI2 sobre la tumorigénesis puede abordarse mediante el tratamiento con siRNA específico de PADI2.

Las PADI son enzimas dependientes del calcio que modifican las proteínas después de la traducción convirtiendo los residuos de arginina cargados positivamente en citrulina cargada neutramente en un proceso conocido como citrulinación o deiminación^3-5. Recientemente hemos descubierto que la peptidilarginina deiminasa 2 (PADI2) puede funcionar como un nuevo biomarcador de cáncer de mama y que los inhibidores de PADI representan terapias candidatas para los cánceres de mama en fase temprana⁶. Por ejemplo, hemos demostrado previamente que un inhibidor "pan-PADI", Cl-amidina, suprime la proliferación de células de cáncer de mama utilizando monocapas 2D y que el inhibidor suprime el crecimiento de esferoides tumorales 3D⁶. En este informe, ampliamos estos estudios y destacamos la utilidad del ensayo de agar blando, al probar la eficacia de un nuevo inhibidor de PADI, BB-CLA, en la supresión del crecimiento de MCF10DCIS colonias de cáncer de mama⁷. Observamos que utilizamos células MCF10DCIS para este experimento porque son derivados oncogénicos de células MCF10A humanas no transformadas y porque contienen altos niveles de estado estacionario de la proteína PADI2⁸. Nuestra hipótesis es que la actividad enzimática de PADI2 desempeña un papel clave en la tumorigénesis de esta línea celular y que la inhibición de la actividad de PADI2 mediada por BB-CLA suprimirá la progresión del cáncer.

1. Preparación de 3% 2-hidroxietil agarosa

1. En un frasco de vidrio de 100 ml limpio y seco, añadir 0,9 g de 2-hidroxietilo agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada.
2. Microondas la mezcla durante 15 segundos y suavemente remolino. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelve totalmente.
3. Autoclave la botella que contiene solución durante 15 min.
4. Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Guarde la solución a temperatura ambiente.

2. Preparación de la capa inferior: 0,6% en gel de agarosa

1. Pre-caliente varias 5 ml y 10 ml pipetas en una incubadora a 37 ° para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación.
2. Parcialmente aflojar la tapa de la botella y microondas la solución de agarosa pre-hechos 3% 2-hidroxietil durante 15 s. Luego, agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al girar el agarosolución en sí porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede extenderse.
3. Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más.
4. Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C durante los próximos pasos para prevenir la solución de agarosa se solidifique antes de tiempo.
5. Medios MCF10DCIS caliente en un 37 ° C baño de agua. Nota: los medios de comunicación MCF10DCIS consta de DMEM / F12, 5% de suero de caballo, 5% de penicilina estreptomicina.
6. Transferencia de 3 ml de la solución de agarosa al 3% utilizando las pipetas pre-calentado en un tubo cónico de 50 ml estéril.
7. Añada inmediatamente 12 ml de medio MCF10DCIS cálidos e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Trate de no formar las burbujas, ya que interfiere con la colonia contar después.
8. Añadir con cuidado 2 ml de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin formar burbujas de aire.
9. Incubar el 6 pocillos horizonta placa de cultivoLLY sobre una superficie plana a 4 ° C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique.
10. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 30 min. La capa inferior está ahora listo para su uso.

3. Preparación de la capa que contiene Cell-: 0,3% en gel de agarosa

1. Células trypsinize MCF10DCIS y diluir a una concentración de células de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Tome 2 ml de la agarosa 3% utilizando pipetas pre-calentado y transferir a un tubo cónico de 50 ml estéril.
3. Inmediatamente añadir 8 ml de medio MCF10DCIS al tubo cónico e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios. Evite la formación de burbujas.
4. Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) y tratar con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
5. En una dilución 1: 1, mezclar las células con la agarosa 0,6%.
6. Tomar 1 ml de la mezcla de células de agarosa y agregar suavemente sobre la capa inferior de la 6-p pocillo de cultivotardías (2 x 10 ⁴ células / ml).
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la capa superior se solidifique.
8. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37 ° durante una semana antes de añadir la capa de alimentación.

4. Preparación de la capa de alimentación: 0,3% en gel de agarosa

1. Microondas el 2-hidroxietil solución de agarosa pre-hechos del 3% durante 15 s. agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg.
2. Equilibrar la botella de solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C.
3. Calentar los medios MCF10DCIS en un baño de agua a 37 ° C.
4. Mezclar 1 ml de solución de agarosa al 3% con 9 ml de medio MCF10DCIS caliente en un tubo cónico de 50 ml e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Evitar la formación de burbujas de aire.
5. Tratar la mezcla con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
6. Añadir suavemente 1 ml de esta mezcla (sin paraming burbujas) en cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene la parte inferior y capas blandas.
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la mezcla se solidifique.
8. Después de la capa de alimentación solidifica, coloque la placa en una incubadora a 37 °.
9. Repita este procedimiento de alimentación semanal mediante la superposición de 1 ml de solución de agarosa / medio / tratamiento de 0,3% en la capa de alimentación existente para reponer las células con nuevos medios de comunicación hasta que se observa la formación de colonias. Nota: Agar en las capas blandas y el alimentador es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes añadidos de la capa de alimentación se difundirán fácilmente en la capa que contiene la célula a llegar a las células.

5. Recolección de Datos

1. Después de 2,5 semanas de crecimiento celular en el agar suave, contar el número de colonias en cada pocillo utilizando un microscopio de luz. Para facilitar la cuantificación, imprima una rejilla sobre una transparencia y adjuntar la red a laPlaca de 6 pocillos para ayudar a localizar donde las células son durante el conteo. Desde tamaño de la colonia (cuantificada por el diámetro de cada colonia) variará, predefinir un tamaño de la colonia de referencia para determinar qué colonias se marcarán. Por ejemplo, incluir tamaños de colonia de 70 micras o más grande en el análisis de datos.
2. Almacenar las muestras a 4 ° C para evitar una mayor formación de colonias y para el recuento futuro. Selle la placa de cultivo de 6 pocillos con Parafilm para evitar que los geles se sequen.

El ensayo de formación de colonias en agar blando se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones que documentan la tumorigenicidad de las células cancerosas. Una ventaja principal de esta técnica es que la matriz semi-sólido favorece selectivamente el crecimiento de células que pueden proliferar en una manera independiente de anclaje. Este rasgo se exhibe principalmente por las células cancerosas, pero no por las células normales. Utilizamos principalmente esta técnica para probar la eficacia de inhibición del crecimiento tumoral por las drogas y para probar el efecto de la sobreexpresión o el agotamiento de nuestros genes de interés, incluyendo genes PADI, en la tumorigenicidad de células de cáncer de mama. Aquí, se evaluó el efecto de la BB-CLA en la inhibición tumorigénico de PADI2 sobreexpresan células MCF10DCIS (Figura 1 y 2).

Los resultados demuestran que BB-CLA inhibe significativamente la formación de colonias de células derivadas de MCF10DCIS. Figura 3 muestra que, en presencia de un inhibidor de PADI t, aquí fue una reducción tanto en la formación de colonias y el tamaño de colonia en comparación con el control de DMSO. [Nota:. BB-CLA se disolvió en DMSO y por lo tanto, DMSO se usó como control] El tamaño de las colonias para BB-CLA células tratadas MCF10DCIS eran predominantemente dentro del intervalo de 20 a 100 micras mientras que el tamaño de las colonias para el DMSO de control exhibió un mayor rango de 70 a 150 micras después de 2,5 semanas de crecimiento.

Las colonias más grandes que 70 micras se contaron y se analizaron (Figura 4). Hubo un promedio de 3.536 colonias en el control de DMSO mientras que sólo 1.967 colonias se observaron en el grupo tratado BB-CLA después de 2,5 semanas de cultivo de agar blando. Esto representa una disminución del 44% en la formación de colonias promedio en presencia de 1 mM BB-CLA, lo que indica una inhibición significativa tumorigénico de células de cáncer de mama (células MCF10DCIS) por el inhibidor de PADI.

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Figura 1. Estructura química de BB-CLA.

Figura 2. Esquema general del Protocolo para el ensayo de formación de colonias en agar blando. Cada pocillo de las placas de cultivo de 6 pocillos se revistió primero con gel de agarosa al 0,6% (capa inferior). Después una mezcla en gel de agarosa 0,3% que contenía las células MCF10DCIS y, o bien el inhibidor de BB-CLA (1 M) o DMSO (control) se estratificó en la parte superior del gel 0,6%. Una vez por semana, se añadió la mezcla de gel de agarosa al 0,3% (que contiene BB-CLA) en la parte superior de la capa suave. Después de 2 a 4 semanas, se observó la formación de colonias y contó para el análisis de datos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Imágenes de formación de colonias en las células tratadas MCF10DCIS-BB-CLA. MCF10DCIS células se hicieron crecer en agar blando en presencia (1 M BB-CLA) o ausencia de BB-CLA (0 M DMSO). Después de 2,5 semanas, las colonias fueron imágenes utilizando un microscopio invertido para imágenes de baja magnificación y un microscopio de luz para imágenes de alta magnificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cuantificación de MCF10DCIS número de colonias después de las células BB-CLA tratamiento. MCF10DCIS se cultivaron en agar blando a diferentes concentraciones de BB-CLA (0 mM (DMSO), o 1 M BB-CLA). Después de 2,5 semanas, las colonias individuales más grande THSe contaron un 70 micras. Los experimentos se repitieron 4 veces (n = 4). La significación estadística de la diferencia total de recuento de células entre las muestras de control y tratamiento se determinó mediante la prueba t de dos muestras de Student (* p <0,005).

Los autores no tienen nada que revelar.