Simultánea de imágenes PET / RM Durante cerebral del ratón hipoxia-isquemia

A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y una causa importante de discapacidad ^1. La cascada de acontecimientos bioquímicos y fisiológicos que se producen durante y después de un evento agudo accidente cerebrovascular se produce rápidamente y con implicaciones para la viabilidad del tejido y en última instancia resultado ^2. Cerebral por hipoxia-isquemia (HI), que conduce a la encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI), se estima que afecta hasta el 0,3% y el 4% de los a término y prematuros nacidos, respectivamente ^3,4. La tasa de mortalidad en recién nacidos con EHI es de aproximadamente 15% a 20%. En el 25% de los sobrevivientes de HIE, complicaciones permanentes surgen como consecuencia de la lesión, incluyendo retraso mental, déficit motor, parálisis cerebral y epilepsia ^3,4. Intervenciones terapéuticas anteriores no han demostrado ser dignos de adopción como estándar de atención, y el consenso aún no se ha llegado a que los métodos más avanzados, basados ​​en la hipotermia, están reduciendo efectivamente la morbilidad ^3,5. Otras cuestiones of contención incluyen el método de administración de la hipotermia y paciente selección ^6. Por lo tanto, las estrategias de neuroprotección y neurorestoration siguen siendo un área fértil para la investigación ^7.

Modelos de rata de HI cerebral han estado disponibles desde la década de 1960, y posteriormente se adaptaron a los ratones ^8,9. Debido a la naturaleza del modelo y la ubicación de la ligadura, hay variabilidad inherente en el resultado debido a la diferencia en el flujo colateral entre los animales ^10. Como resultado, estos modelos tienden a ser más variable en comparación con modelos similares, tales como oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Medición en tiempo real de los cambios fisiológicos se ha demostrado con la flujometría láser Doppler, así como de difusión ponderada MRI ^11. La variabilidad intra-animal que se observó en el flujo sanguíneo cerebral durante e inmediatamente después de la hipoxia, así como en los resultados agudos tales como el volumen del infarto y neurológicodéficit, sugieren que la adquisición simultánea y correlación de datos multimodales sería beneficioso.

Los recientes avances en la tomografía por emisión de positrones simultánea (PET) y la resonancia magnética (MRI) han permitido nuevas posibilidades en la formación de imágenes preclínica ^12-14. Las ventajas potenciales de estos sistemas híbridos, combinados para aplicaciones preclínicos se han descrito en la literatura ^15,16. Mientras que muchas preguntas preclínicos pueden ser abordadas por imágenes de un secuencialmente animal individual o por imágenes de grupos de animales separados, ciertas situaciones - por ejemplo, cuando cada instancia de un evento como el derrame cerebral se manifiesta de forma única, con la rápida evolución fisiopatología - que sea conveniente e incluso necesario utilizar la medición simultánea. La neuroimagen funcional proporciona un ejemplo de ello, donde simultánea 2-desoxi-2- ⁽¹⁸ F) fluoro-ᴅ-glucosa ^([18 F] FDG) PET y Blood-nivel de oxígeno dependiente (BOLD) RM ha demostrado recientemente en la estimulación bigote rata estudia ^14.

Aquí, demostramos simultánea PET / RM de imagen durante el inicio de un derrame cerebral hipóxico-isquémica en la que la fisiología del cerebro no está en estado de equilibrio, pero en cambio, es rápida e irreversiblemente cambiando durante la simulación hipóxica. Los cambios en la difusión del agua, medida por resonancia magnética y cuantificados por el coeficiente de difusión aparente (ADC) derivado de imágenes de difusión ponderada (DWI), ha sido bien caracterizado para el accidente cerebrovascular en los datos clínicos y preclínicos ^17,18. En modelos animales, tales como MCAO, la difusión de agua en el tejido cerebral afectado cae rápidamente debido a la cascada de la bioenergética que conduce a edema citotóxico ^18. Estos cambios agudos en el ADC se observan también en modelos de roedores de isquemia cerebral por hipoxia ^{11,19. [18} F] FDG PET se ha utilizado en pacientes con ictus para evaluar los cambios en gl localesmetabolismo ucose ^20, y un pequeño número de estudios in vivo en animales también han utilizado ^[18 F] FDG ^21, incluido en el modelo de hipoxia-isquemia cerebral ^22. En general, estos estudios muestran una disminución de la utilización de glucosa en las regiones isquémicas, aunque un estudio usando un modelo con reperfusión encontró ninguna correlación de estos cambios metabólicos con el desarrollo de miocardio posterior ^23. Esto está en contraste a los cambios de difusión que se han asociado con el núcleo dañado irreversiblemente ^21. Por lo tanto, es importante ser capaz de obtener la información complementaria derivada de ^[18 F] FDG PET y DWI de manera simultánea durante la evolución del accidente cerebrovascular, ya que es probable que el rendimiento información significativa acerca de la progresión de la lesión y el impacto de intervenciones terapéuticas. El método que describimos aquí es fácilmente susceptible de usar con una variedad de trazadores de PET y secuencias de RM. Por ejemplo, ^[15 O] H ₂ O PETimágenes, junto con DWI y las imágenes de perfusión ponderada (PWI) de la RM puede ser utilizado para explorar aún más el desarrollo de la penumbra isquémica y validar las técnicas actuales en el campo de la imagen derrame cerebral.

Todo el manejo y procedimientos de los animales descritos en este documento, y de acuerdo a la Investigación Animal: Reporte experimentos in vivo (llegar) directrices, se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Asociación para la Evaluación de Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) Internacional acreditado Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de California, Davis. Cirugía apropiada no debe dar lugar a signos de dolor o malestar en el animal, pero las medidas adecuadas se deben tomar si se observan estos síntomas, incluyendo la administración de analgésicos o en algunos casos, la eutanasia. El lado derecho de los animales fue elegido arbitrariamente por el procedimiento unilateral descrito.

1. Unilateral arteria carótida común (CCA) Ligadura

1. Preparar campo estéril con herramientas quirúrgicas esterilizadas y materiales colocados convenientemente. Asegurar almohadilla térmica se calienta a 37 ° C, con sonda de temperatura colocado de forma segura en la almohadilla. & #160; Asegúrese de usar un paño estéril para cubrir el lugar de la cirugía.
2. Anestesiar animales (isoflurano, 1.3% en aire a 0,5-1 L / min), y coloque animal en posición supina con la cola de espaldas. Compruebe anestesia apretando el dedo del pie - esto debería provocar ninguna reacción si el animal está anestesiado correctamente. Aplicar pomada oftálmica para los ojos.
3. Aplicar crema de depilación a parte inferior del cuello a la zona superior del pecho de 1-2 hisopos de algodón. Espere 03.01 min y, a continuación, eliminar el vello y la crema usando gasa o alcohol hisopos húmedos. Área de Swab incisión con Betadine en forma circular de dentro a fuera, y luego cambiar en guantes quirúrgicos estériles.
4. Con unas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media de la parte inferior del cuello. Separe con cuidado la piel externa de la fascia que rodea el uso de tijeras quirúrgicas.
5. El uso de dos McPherson fórceps iris micro de sutura, separar la arteria carótida común derecha desde fascia, teniendo cuidado de evitar dañar las venas o disturBing el nervio vago.
6. Usando las pinzas de la derecha, exteriorizar el CCA derecha en una posición estable. Aplique varias gotas de solución salina para prevenir el secado. Pasar una longitud adecuada (2-3 cm) de 6-0 sutura de seda por debajo de la CCA derecha y ligar con un nudo doble cuadrado. Opcionalmente, ligar de nuevo utilizando una segunda longitud de sutura de seda 6-0.
7. Vuelva a colocar la derecha CCA y limpiar el exceso de líquido de la apertura con una esponja estéril con punta de algodón. Cierre la incisión con sutura de seda 6-0. Aplicar la lidocaína por vía tópica hasta 7 mg / kg.
8. Deje que el animal se recupere de la anestesia hasta ambulatoria (aproximadamente 30 min) y realizar el monitoreo post-quirúrgica, hasta los animales está listo para la imagen.

2. Preparación para la proyección de imagen: Verificaciones del sistema y hardware

1. Configurar el hardware y el software para los sistemas de RM y PET y comprobar su funcionalidad como sigue. Asegúrese de que todas las conexiones físicas son seguras y configuración del software se seleccionan adecuadamente.
   1. Sistema de montaje de PET en el interior del agujero de resonancia magnética, la alineación del campo de visión (FOV) centros que utilizan desplazamientos axiales conocidos PET y la RM. Montar la bobina de MRI en el interior del orificio del sistema de PET y el centro de la bobina con el sistema PET y centros de imán de MRI.
   2. A su vez en la electrónica de PET para el poder y la tensión de polarización (Nota: los pasos variarán por instrumento). Realizar un análisis rápido (5 min) usando un cilindro ^{de 68 Ge} y comprobar el sinograma resultante para asegurar que todos los detectores están en funcionamiento.
   3. Opcionalmente adquirir datos que se utilizarán para una matriz de transformación de PET / RM para fines del co-registro: Llenar un fantasma en tres dimensiones (por ejemplo, tres esferas rellenas) con 200 Ci de ¹⁸ solución acuosa F y adquirir durante 15 minutos con PET. Adquirir anatómica datos de resonancia magnética: en la ventana de Scan Control, seleccione la multicorte secuencia multi-eco (MIPYME) (véase el cuadro 1
2. Compruebe los ajustes de la bomba de infusión y operación. Ajuste la bomba al 4,44 l por minuto, que a 45 minutos de infusión constante entrega un volumen total de 200 l, el límite recomendado típico para la inyección intravenosa en un 20 g animal.
3. Compruebe el funcionamiento del calentador y confirme que la salida de temperatura es suficiente para mantener el calentamiento de los animales (37 ° C). Compruebe que la temperatura y la monitorización respiratoria es operativa en la preparación para la colocación de los animales en la cama animal.
4. Compruebe el funcionamiento de los O ₂ y N ₂ caudalímetros (para 0,5 L / min: _O 2 a 57,2 mg / min y _N2 a 0,575 g / min) por encender ambos con la fuente de aire comprimido fuera y O ₂ y N ₂ fuentes sucesivamente. Para evitar el riesgo de dañar los medidores de flujo, no encenderlos sin la suficiente presión de entrada.
5. Asegúrese de que el isoflurano vaporizer está suficientemente llena. Antes de la formación de imágenes, iniciar el flujo de la anestesia con isoflurano al 1-2% y de 0,5 a 1 L / min.
6. Preparar la cama de animales, garantizando que los de anestesia, almohadilla respiratoria y sistemas calentadores están colocados de forma segura y funcional. Para PET / MRI exactitud adicional co-registro, marcadores de referencia (por ejemplo, tubos capilares llenos de radiotrazador a una concentración similar a la inyecta para formación de imágenes) se pueden unir a la cama de los animales dentro del campo de visión.

Flujo de trabajo 3. Imaging

Después de todas las revisiones de los equipos necesarios se hayan completado, proceder a la imagen de la siguiente manera:

1. Anestesiar al animal con isoflurano y insertar catéter de la vena de la cola (28 G aguja, PE-10 tubos de menos de 5 cm) rellena con solución salina heparinizada (0,5 ml de heparina, 1000 USP / ml, en 10 ml de solución salina). Calentando el animal y / o la cola puede mejorar la precisión del catéter de inserción. Opcionalmente colocar una gota de adhesivo de cianoacrilato en el sitio de la inserciónpara asegurar la línea IV.
2. Traslado al animal a la cama preparados para animales. Asegúrese de que la cabeza del animal es seguro, con incisivos superiores garantizados por el bar y oído bares de dientes en su lugar si se está utilizando.
3. Aplicar pomada oftálmica para los ojos para evitar que se seque. Inserte el termómetro sonda rectal. Asegúrese de que la temperatura y las lecturas de respiración son funcionales.
4. Extraer la dosis radiotrazador (alrededor de 600 Ci en 200 l) para ser inyectada en heparinizada PE-10 tubo de longitud apropiada - de aproximadamente 3 m para PE-10 tubos y un volumen de 200 l. Conecte un extremo de este tubo a la jeringa de la bomba de infusión, y el otro a la línea de catéter de vena de la cola, con cuidado de no crear perforaciones en el tubo.
5. Deslizar la cama de los animales hacia delante en el orificio del imán, asegurándose de no perturbar el posicionamiento de la bobina de resonancia magnética y las líneas o cables, especialmente el tubo de la anestesia. Asegúrese de que el centro del cerebro está alineado con los centros de la MBobina de RI, sistema PET y la RM imán.
6. Realizar la sintonización y la congruencia de la bobina de MRI mediante la rotación de los botones de ajuste en la bobina, lo que minimiza la impedancia (verifique las especificaciones de bobina) y frecuencia (300 MHz ^durante 1 hora a 7 Tesla) desajustes mediante la observación de la pantalla del preamplificador de alta potencia.
7. (RM) Después de ajuste y adaptación, adquirir una imagen del explorador: seleccione una secuencia TriPilot RARO y ejecutar la secuencia de la ventana de Control Scan. Compruebe posicionamiento del animal, pasos 3.5 y 3.6 según sea necesario repetir. Restablecer cuñas de valor cero.
8. (RM) Adquirir una exploración localizada punto de resolverse la espectroscopia (PRENSA) en un volumen en el cerebro: Ejecutar una secuencia PRESS (ver Tabla 1) en un volumen rectangular con unas dimensiones de 3,9 mm x 6 mm x 9 mm. Compruebe el ancho de línea de agua utilizando el comando de macro CalcLineWidth. Si la anchura total a la mitad del máximo (FWHM) valor es aceptable (por ejemplo, 0,2 ppm), continúe con el paso 3.10. Si no es así, vaya al paso 3.9.
9. (RM) Adquirir un mapa de campo: Ejecutar una secuencia FieldMap (ver Tabla 1). Utilice los datos resultantes de una proyección cuña de múltiples ángulos (MAPSHIM) mediante la ejecución del comando de macro MAPSHIM y seleccionando lineales y de segundo orden (z ²⁾ ajustes locales. Repita el paso 3.8.
10. (RM) Coloque el plan de la rebanada para la exploración DWI (ver Tabla 1): mediante el Editor de Geometría, asegúrese de que la adquisición FOV está en condiciones de adquirir el volumen deseado de interés dentro del cerebro. Si el plan rebanada resultante esté alineada lo deseas, copiar este plan rebanada en la ventana Scan Control para todos los análisis posteriores de DWI. Comience adquisición.
11. (PET) Con la adquisición PET preparado y listo para comenzar, iniciar la bomba de infusión. Después del retardo de pre-determinado en el que se ha inyectado solución salina desde el catéter, comenzar la adquisición PET (véase la Tabla 1) con el fin de capturar la entrada de radiotrazador. Vigilar la tasa de recuento y buscarse un aumento gradualen el recuento de indicativos de una inyección de éxito.
12. Después de 10-15 minutos, iniciar el concurrente simulación hipóxica con el paso 3.12. Para iniciar la simulación hipóxica, apague el flujo de aire médica y de inmediato el poder sobre el O ₂ y N ₂ caudalímetros con los ajustes predeterminados para entregar 8% de oxígeno y 92% de nitrógeno, y reducir isoflurano al 0,8%. No encienda caudalímetros sin la presión de entrada.
13. (MRI) Al mismo tiempo que en la etapa 3.12, comience adquisición DWI preparado en la etapa 3.10 (escanear "H1").
14. (RM) Comience adquisición DWI (scan "H2"), preparado en el paso 3.10, inmediatamente después de la exploración H1 se ha completado. Terminar simulación hipóxica apagando caudalímetros, restaurando el flujo de aire medicinal, y volviendo la concentración de isoflurano a un valor adecuado basado en el monitoreo fisiológico.
15. (RM) Adquirir un DWI post-hipoxia scan preparado en el paso 3.10. Apague la bomba de infusión después de esta exploración se ha completado.
16. (RM) anat Adquiririmágenes omical en la axial y sagital. En la ventana de Control Scan - seleccionar la secuencia MIPYME (ver Tabla 1). Uso del editor de la geometría, asegúrese de que la adquisición FOV cubre el cerebro.
17. Retire animal, volver a la jaula cuando ambulatoria y vigilar los signos de morbilidad, la eutanasia si es necesario con la administración de CO ₂ seguido por dislocación cervical como método secundario.

La Figura 1 muestra el resultado de una ligadura apropiada de la arteria carótida común, antes de cerrar la herida con sutura de seda 6-0.

En este método, los datos obtenidos a partir de imágenes es altamente dependiente de la disposición temporal del experimento, que a su vez dicta y también está dictada por limitaciones experimentales incluidos los sistemas de adquisición de imágenes y la configuración del equipo. Estas y otras consideraciones se exploran más en la sección de debate. Con el protocolo descrito en el presente documento, la configuración física del equipo (Figura 2A) permite la adquisición de imágenes multi-modal ininterrumpida antes, durante, y después (Figura 2B) rápida introducción de la simulación hipóxica (Figura 2C).

En este modelo animal, como con muchos modelos de accidente cerebrovascular isquémico, los cambios en la difusión son detectables rápidamente después de insulto (véase la Figura 3A para una representative ejemplo). Como nuestro método no altera fundamentalmente el modelo HI cerebral, cambios de difusión puede ser reproducida de forma robusta - Figura 3B demuestra las diferencias evolutivas ciento en ADC z (ADC en la dirección z) entre la contralateral (no ocluida, izquierda) y ipsilateral (ocluido, derecha) lados del cerebro, LR%, (n = 6 para la exploración H2, n = 5 para el resto de los puntos de tiempo). Como era de esperar, los valores de ADC en el lado ocluido de la disminución cerebro como la lesión progresa. La Figura 3C muestra un ejemplo rebanada coronal de la secuencia DWI, así como una rebanada sagital que demuestra la extensión axial limitada del FOV (8 mm) para el secuencia utilizada. Los detalles relativos a las limitaciones impuestas a la secuencia de imágenes de eco planar (EPI) utilizado por DWI se describen en la sección de debate. En definitiva, la calidad de imagen obtenida con el marco de imagen propuesto depende de las características de rendimiento del sistema, y ​​EPI-basa secuencias DWI en particular puede exponer subóptima condiciones de hardware o parámetros de adquisición (véase la figura 5B). Eso se observaron diferencias significativas entre los valores iniciales y posteriores ADC% LR (p <0,05, unpaired t-test) sugiere que se trata de un parámetro robusta para interrogar utilizando nuestra configuración experimental.

Simultáneamente con los cambios en la ADC, se observaron diferencias hemisféricas en la captación de [18 F] FDG después de comenzar el desafío hipóxico y durante H2 de exploración (11% LR diferencia de medias, n = 3). En dos de los tres casos, ipsilateral captación de [18 F] FDG disminuyó en relación con la captación contralateral después de la hipoxia (véase la Figura 4 para un ejemplo representativo), aunque esto no era cierto en todos los casos probablemente debido a la variabilidad de los animales. La Figura 5A muestra un ejemplo en el la diferencia relativa de [18 F] FDG captación entre los dos hemisferios no fue el esperado en un animal (azul). Figura5A también muestra un ejemplo en el que, mientras que [18 F] FDG captación fue como se esperaba después de la hipoxia, el animal murió al final de H2 exploración.

Figura 1. Ejemplo de la arteria carótida común derecha se ligó con sutura de seda 6-0. El animal está en posición supina con su cabeza apuntando hacia la parte inferior de la imagen. El área alrededor de la incisión se ha depilado, y la incisión se mantiene abierto con una pinza para la visualización. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. (A) Diagrama de Representante de la disposición física de equipo. El inserto de PET se coloca en la cavidad del imán, y la bobina de MRI es a su vez posicionado en el ánima del inserto PET. La cama animal, junto con la monitorización fisiológica (almohadilla de respiración no se muestra), la línea de la anestesia, y el catéter IV se ejecuta en el taladro como se muestra. El anillo de puntos indica un margen de seguridad para el campo magnético perdido -. Puede ser necesario colocar equipos con componentes magnéticos fuera de esta región, pero dentro de la sala de resonancia magnética (siguiendo todas las medidas de seguridad) (B) Diagrama que resume la progresión temporal del experimento . (C) Los resultados representativos de los cambios iniciales en el nivel de O 2 entregados al animal inmediatamente después del comienzo del desafío hipoxia. Dentro de aproximadamente 1 min, condiciones de hipoxia se puede lograr, según lo medido por un medidor de O 2 colocado en una caja de inducción 0.5 L (no se muestra), en línea con el sistema de anestesia. rge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. (A) Ejemplo de mapas z ADC paramétricas adquiridos al inicio del estudio ya través de post-hipoxia. (B) Parcela mostrando% de diferencia LR en ADC z desde el inicio hasta post-hipoxia. Los asteriscos indican una diferencia significativa (p <0,05, unpaired t-test) en comparación con el valor basal. Las barras de error representan +/- una desviación estándar. (C) Ejemplo de una adquisición EPI-DWI (axiales y sagitales, en 3D para mostrar el alcance de la FOV). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. (A) Corte coronal y transversal de una muestra de animales [18 F] FDG captación. La imagen PET está en el primer plano y se ha registrado y se fundió una imagen anatómica de resonancia magnética en el fondo para la visualización con. Los datos de PET se suman en todos los fotogramas. (B) En el mismo animal, [18 F] FDG curva de actividad de tiempo para el hemisferio contralateral (azul) y el hemisferio ipsilateral (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Curvas de la Figura 5. (A) de actividad Tiempo de contralateral (sólido) y ipsilateral (de puntos) hemisferio [18 F] FDG - se muestra en el mismo eje, son ejemplos de un inesperado momento [18 F] FDGcurva de actividad (azul) y la muerte de los animales al final de H2 (a 45 min, verde). artefactos (B) Ghosting debido a posibles fallos de RF basados ​​en hardware. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. MRI parámetros de la secuencia de impulsos para las exploraciones que se describen en el protocolo, y la adquisición de PET, histograma, y los parámetros de reconstrucción.

JM y SW son empleados de Genentech.