Introduction
سرطان المثانة هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي، مع ما يقرب من 75،000 حالة جديدة كل عام في الولايات المتحدة الأمريكية 1. تتطلب معدلات عالية من تكرار مدى الحياة المتابعة، مما يجعل سرطان المثانة واحدة من أغلى أنواع السرطان لعلاج. علاج الذهب القياسية لعالية الجودة NMIBC هو بتر عبر الإحليل، تليها العلاج المناعي إينترفسكل مع BCG. على الرغم من أن الآلية الدقيقة للنشاط المضادة للورم من BCG يبقى أن توضح تماما، ومن المتفق عليه أن تفعيل استجابة بوساطة الخلايا المناعية المخصب في T المساعد (ث) 1 والسامة للخلايا T (ح) 1 الخلايا هو أمر حاسم ل نجاح العلاج 2.
على الرغم من أن BCG يبقى العلاج الأمثل لNMIBC، وهي نسبة عالية من المرضى لا يستجيبون للعلاج. علاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يسبب عددا من الآثار الجانبية: حوالي 70٪ من الأورام تعامل تتكرر بعد مرور بعض الوقت والتقدم ~ 15٪ إلى النموذج العضلات الغازية للالمرض. الآثار الجانبية الأخرى المرتبطة العلاج BCG تشمل عسر البول، التهاب المثانة والتهاب الكلى 3-6.
تطوير استراتيجيات علاجية جديدة يجب أن تأخذ في الاعتبار استخدام نماذج ما قبل السريرية، بعد الأولي في المختبر التقييم؛ هذا أهمية خاصة في الأورام التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير تنميتها والاستجابة للعلاج المكروية.
على مدى العقد الماضي، ونحن قد تناولت جوانب متعددة من النشاط تحوير المناعة من HP-NAP، وهو بروتين تنتجه بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري، حدد في البداية بأنه قادر على تعزيز التصاق الخلايا البطانية النوى (PMNs) 7. هيكليا، HP-NAP ينتمي إلى البروتين لحماية الحمض النووي في ظل ظروف التجويع (DPS) الأسرة (8) ويتكون من 12 مفارز متطابقة مرتبة في قذيفة dodecameric.
لقد أثبتنا أن HP-NAP هومستقبلات تول مثل (TLR) 2 ناهض، مع نشاط تحوير المناعة القوي التي تقف وراء تمايز اللمفاويات التائية نحو النمط الظاهري TH1، سواء في المختبر والمجراة 10/09. في فضيلة لهذا النشاط، HP-NAP غير قادرة على توجيه الاستجابة المناعية TH2 في الاستجابة أكثر فائدة TH1 في نموذج الفئران من الربو التحسسي 11.
لتقييم القدرة المضادة للورم TH1 التي تعتمد من HP-NAP، اتخذنا الاستفادة من نموذج الفأر من سرطان المثانة وضعت قبل عدة سنوات من قبل أودونيل وزملاؤه (12) لتقييم أثر إدارة BCG.
مع هذا البروتوكول، علينا أن نبرهن على HP-NAP لديها امكانات المضادة للورم قوية ضد سرطان المثانة وأن فعالية إدارة HP-NAP يوازي تراكم كبير، داخل الورم والغدد الإقليمي العقد، كل من Th1 و TC1 الخلايا الليمفاوية إنتاج الانترفيرون ( IFN) -γ 13
يقدم هذا التقرير بروتوكول stepbystep، تفاصيل إعداد الحيوانات، قسطرة الإحليل، وحرق الكيميائية اللازمة لمرفق من الخلايا إلى الغشاء المخاطي المثانة، وحقن الخلايا السرطانية. نحن أيضا وصف الإدارة الموضعية من HP-NAP التي يمكن اعتبارها نموذجا أوليا من أي العوامل العلاجية المتقدمة لعلاج سرطان المثانة. الأدلة التي تم الحصول عليها عن طريق مقارنة أورام معزولة عن السيطرة وHP-المعالجة NAP الحيوانات ويؤكد ليس فقط حقيقة أن HP-NAP يمكن أن يكون مرشحا جيدا للعلاج مناعي سرطان المثانة، ولكن أيضا فعالية العامة للالتجريبية اقامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات من قبل وزارة الصحة الإيطالية (DM 204/2011-B).
1. الحيوانات
- تنمو C57BL6 / J الفئران الإناث إلى 8 أسابيع من العمر في أقفاص التهوية بشكل فردي مع مرشحات microisolation.
ويفضل الإناث لأن التشكل التشريحي للجهاز-البولية التناسلية الخارجية لها يجعل قسطرة أسهل مما كانت عليه في الذكور: مذكرة.
2. خلية ثقافة
- الحفاظ على الماوس الظهارة البولية خط خلية سرطان MB49 في RPMI 1640 متوسطة تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين على 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2.
- زراعة خلايا MB49 في T-75 قوارير إلى 80٪ التقاء. يعرض للتريبسين و resuspend عند 0.5 × 10 5-0،5 × 10 6 خلايا في 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل الزرع في الفئران.
3. إينترفسكل الأورام زراعة
- تخدير الفئران باستخدام مزيج من zoletil التخدير وxylor (33 ملغ / كغ و 20 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق.
- وضع الحيوانات في موقف ضعيف وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي. الكفوف وإلى أن يفصل بما فيه الكفاية لجعل الصماخ الإحليل مرئية بشكل جيد ويمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال القسطرة.
- ملاحظة: بالنسبة للقسطرة، 24 G القسطرة الوريدية للأطفال هي مناسبة للفئران 8-10 أسابيع من العمر. اختيار القسطرة مهم للغاية من أجل تجنب تسرب السائل بين الجدار مجرى البول والقسطرة. يجب استخدام القسطرة تجويف أكبر للفئران أكبر أو كبار السن.
- باستخدام كلاب صغيرة، قرصة حافة واحدة من الجزء الخارجي من مجرى البول وتطويعه بلطف شديد نحو "نهاية الرأس" من الفئران. هذا العمل يعرض الصماخ الإحليل.
- إزالة الإبرة الداخلية للالقسطرة وتضاف هذه الأخيرة في مجرى البول في زاوية من 45 درجة مئوية، موجهة قليلانحو "ذيل" من الفئران. لا قوة مدخل القسطرة. في حالة المقاومة، مجرد تحريف القسطرة بلطف شديد، حتى أنه ينزلق داخل مجرى البول. عندما حول 0،5-0،8 سم من القسطرة في مجرى البول، ضع بعناية بالتوازي القسطرة إلى ذيل الفئران وأدخله تماما.
- باستخدام حقنة 1 مل، الإبرة التي لابد من إدراجها في القسطرة، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
- ملاحظة: عندما حقن PBS، فإن المثانة تملأ وسوف تورم تكون واضحة بين رجليه الخلفيتين من الفئران. هذا يؤكد أن القسطرة هي الصحيحة. معظم القسطرة لديها حجم القتلى التي يجب أخذها في الاعتبار عند حساب حجم الحقن.
- باستخدام معقمة 1 مل حقنة، وضخ 200 ميكرولتر من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. ملء المثانة من أجل حرق الجدار بأكمله. بعد 10 ثانية، وإزالة جميع الحامض وneutrali فورازي عن طريق حقن 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم مع محقنة معقمة. في حالة حقن أكبر عدد من الخلايا (0.5 × 10 6)، ولا يشترط الخطوة التحميض.
- نضح كل السائل المتبقي وعلى الفور بمسح تجويف مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- إفراغ المثانة بواسطة الشفط، وحقن 150 ميكرولتر من PBS تحتوي على خلايا MB49 (المدى 0.5 × 10 5-0،5 × 10 6) في المثانة. ترك الحقنة تجميعها لالقسطرة لتجنب تسرب الخلايا. فمن الأفضل لتأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
- بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول، ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج حتى مستيقظا: هذا يحدث عادة بين 1 و 2 ساعة بعد نهاية العلاج.
4. التسليم إينترفسكل من HP-NAP
- ملاحظة: لا يقل عن 3 أيام بعد تقطير الخلية، فمن الممكن أن يبدأالعلاج.
- يقثطر كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،4. في هذه المرحلة، فإنه ليس من الضروري لحرق جدار المثانة مع حمض الهيدروكلوريك.
- باستخدام حقنة 1 مل، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
- حقن 50 ميكروغرام من HP-NAP في 150 PBS ميكرولتر في المثانة. ترك الحقنة التي تعلق على القسطرة لتجنب تسرب من الحل البروتين. تأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
- بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج، حتى يستيقظ.
5. الأورام إإكسبلنتس وتحليل النسيجي
- في نهاية العلاج، والتضحية الحيوانات، ووضعها في مواقف مستلق وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي.
- باستخدام مشرط جراحي، وجعل شق عمودي عن 1.52 سم من خلال الجلد والبريتوني، بدأت للتو فوق الأعضاء التناسلية الخارجية إلى "نهاية الرأس" من الفئران. للحد من مخاطر الإضرار المثانة، إيلاء اهتمام خاص لعمق القطع.
- سيتم وضع المثانة في يسار الوسط لقطع وسوف الورم تكون واضحة كما مظلمة كتلة الوردي / البنفسجي. على الختان لها، ضع المثانة بالكامل في قفص النسيجي وإصلاح في 10٪ من الفورمالين مخزنة قبل التضمين في البارافين.
- لالنسيجية وتحليل النسيجية المناعي، وإعداد أقسام المسلسل من المثانة (46 سماكة ميكرون) باستخدام مشراح القياسية.
- وصمة عار على المقاطع مع haematoxylin / يوزين والمضي قدما في حساب حجم الورم (D XD 2) وتحديد نسبة نخر في منطقة مستعرضة باستخدام بمساعدة الكمبيوتر محلل الصورة.
- لسفينة العد، المضي قدما في طريق تلطيخ أقسام للعلامة البطانية CD31 / PECAM، وذلك باستخدام تقنية المناعي القياسية. مسح المقاطع لر طاقة منخفضة (4 ×) لتحديد منطقة أعلى كثافة الأوعية الدموية. داخل هذه المنطقة، عد microvessels الفردية في خمسة حقول عشوائية منفصلة في قوة عالية (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل (1) وتقنية القسطرة. ومقسطر الماوس وتغرس مع 0.5 × 10 6 MB49 الخلايا. بدأ العلاج مع HP-NAP 3 أيام بعد حقن الخلايا السرطانية، لتمكينهم من تعلقها على جدار المثانة وتتكاثر. كل الحيوانات التي تنتمي إلى مجموعة مراقبة تطور الورم. البعض منهم قد يموتون قبل نهاية فترة 13 يوما بسبب انسداد مجرى البول.
بعد الحقنة الأولى مع HP-NAP، يتم التعامل مع الحيوانات كل ثلاثة أيام، ليصبح المجموع أربعة الحقن. في نهاية التجربة، في يوم ثلاثة عشر، يتم التضحية الحيوانات وقربة جمع للتحليل النسيجي والمناعي النسيجية. كما هو مبين في الشكل 2A، وحجم الورم داخل المثانة من الفئران التي عولجت HP-NAP هو أصغر بكثير من الورم من الفئران المعالجة السيارة (220 ± 62 مم 3 مقابل 830 ± 180 ملم 3).
المثير للاهتمام، في حين أنه في الحيوانات المعالجة السيارة الورم يغزو الأنسجة الدهنية الأساسية، في 7 من 8 الحيوانات تعامل HP-NAP-يقتصر الورم داخل جدار المثانة (الشكل 2B). وأخيرا، يتم تقليل الأوعية الدموية وزيادة مدى نخر في الفئران التي عولجت HP-NAP، فيما يتعلق بمكافحة الحيوانات (الشكل 2B و C).
الشكل 1. الفئران قسطرة. إناث الفئران هي تخدير ومقسطر باستخدام قنية معقمة 24 G. اللوحة اليمنى هي التكبير الصندوق الأسود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. النشاط المضادة للورم من HP-NAP. الفئران، مزروع في اليوم 0 مع MB49 الخلايا (0.5 × 10 6)، يتم التعامل مع 50 ميكروغرام من HP-NAP أو برنامج تلفزيوني (مركبة) في أيام 3 و 6 و 9 و و12. جميع الحيوانات قتل في يوم 13. (A) التحليل النسيجي الممثل على قربة معزولة عن السيطرة على الفئران والحيوانات المعالجة HP-NAP، وحجم الورم الكمي. (B) التكبير من أقسام وحة ألف ونسبة النخر في المجموعتين من الحيوانات. (C) قربة مقطوعة، الملون لCD31 / PECAM. وأظهرت مقاطع تمثيلية من السيطرة والحيوانات المعالجة HP-NAP. الكمي للكثافة microvessel (C، اللوحة اليمنى). HPF والحقول highpower. تمثل البيانات يعني ± SD. ن = 8 الفئران في المجموعة. تم تحديد الدلالة الإحصائية التي كتبها الطالب ر -test (** p <0.01). الشكل المعدل من Codolo وآخرونآل 13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم السلف في علاج السرطان تتطلب اختبارات في النماذج الحيوانية قبل بدء التجارب السريرية. إمكانية دراسة بيولوجية الورم في الجسم الحي، والاستفادة من النماذج الحيوانية، يمثل أداة حاسمة للباحثين التحقيق التسبب بالسرطان، مما يتيح تقييم أساليب علاجية مختلفة. لا تزال نماذج مثلي معيار الذهب 14-15، وذلك بسبب كمية هائلة من خطوط الخلايا المتاحة لإعداد نموذج الورم، ولأنها تحاكي البيئة الورم طبيعيا 16.
وعلاوة على ذلك، ووضع نماذج مثلي من السرطان في الفئران مسانج، كما هو موضح هنا، هو ذات أهمية خاصة في حالة الدراسات التي تهدف إلى تحقيق استراتيجيات علاجية جديدة تعتمد على العلاج المناعي، لأن هذه الأخيرة ليست ممكنة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة التي تخضع xenoimplants.
منهجية مبين في هذا البروتوكول يصف رانه قسطرة من مجرى البول الماوس الإناث التي تسمح لكل من التلقيح من الخلايا السرطانية وإدارة العوامل العلاجية في تجويف المثانة.
ميزة شروط مسبقة جدار المثانة من خلال حرق حمض (كما هو مبين أعلاه، بدلا من المناهج الأخرى، مثل استخدام التربسين أو بولي يسين)، هو أن تعزيز نمو الاورام الكبيرة والغازية للغاية. على العكس من ذلك، شروط مسبقة مع التربسين وبولي يسين، والنتائج في أورام أصغر حجما وأقل الغازية، وربما يرجع ذلك إلى تأثير ضار من مخلفات هذه المواد على بقاء الخلايا السرطانية 17. ويفضل حرق حمض أيضا إلى نظام آخر شروط مسبقة على أساس الكي الكهربائي لأن هذا الأخير قد يسبب ثقب في جدار المثانة ونشر الورم في الصفاق 18.
وقد تم تحسين بروتوكول للدراسات على المدى القصير (~ 13 يوما). غرس العلاقات العامةعدد أوبرا الخلايا أمر بالغ الأهمية، لأن عدد الخلايا العالي سوف يؤدي إلى مزيد من نمو الورم السريع وفقدان الحيوانات وربما يعود ذلك إلى عبء الورم كبير. وعلاوة على ذلك، حتى يصبح المستخدم ثقة مع هذه التقنية، وهناك درجة معينة من المخاطر في الإضرار مجرى البول أو المثانة، مما تسبب في وفاة الحيوانات. في تجربتنا، ومع ذلك، إذا تم تشغيلها بشكل كاف الحيوانات (وبالتالي لا يموت أثناء العملية)، يعيشون دون معاناة لمدة التجارب (13 يوما). وعلاوة على ذلك، من خلال تقليل عدد الخلايا حقن، فمن الممكن لإطالة مدة التجارب.
استخدمنا هذا النموذج لتقييم النشاط المضادة للورم من البروتين HP-NAP التي تنتجها هيليكوباكتر بيلوري، بهدف تحسين وبديلا في نهاية المطاف، فإن العلاج الحالي على أساس BCG بأخرى جديدة هبت مع ارتفاع الفوائد / الآثار الجانبية النسبة. أكثر عموما، يمكن اعتماد هذا المنهج التجريبي في جميع ما قبل كلينيتقييمات كال التي تتطلب إيصال العوامل العلاجية في تجويف المثانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل ASSOCIAZIONE الإيطالية في لا يسر كل من Ricerca سول Cancro، الوزارة الإيطالية للجامعة والبحوث والمشاريع نسخ م وPROGETTI دي يسر كل من Ricerca دي أتينيو، منح N ° CPDA137871، FONDAZIONE Cariplo، منح N ° 2011-0485 إلى MDB، وFinanziamento جيوفاني Studiosi، جامعة بادوا، لغايا Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
