Introduction
Рак мочевого пузыря является одним из самых распространенных видов рака мочеполовой тракт, с почти 75000 новых случаев каждый год в США 1. Высокие темпы рецидива нуждаются в пожизненной последующей деятельности, что делает рак один из самых дорогостоящих видов рака для лечения мочевого пузыря. Золотым стандартом лечения для полноценного NMIBC транс уретры резекция с последующим внутрипузырной иммунотерапии БЦЖ. Хотя точный механизм противоопухолевой активности БЦЖ остается полностью выяснены, считается, что активация клеточного иммунного ответа, обогащенной Т-хелперов (Th) 1 и цитотоксических Т (Тс) 1 клетки имеет решающее значение для Успех терапии 2.
Несмотря на то, что БЦЖ остается препаратом выбора для NMIBC, высокая доля пациентов не реагируют на терапию; Кроме того, это может вызвать ряд побочных эффектов: около 70% пролеченных опухолей повторяются через какое-то время, и ~ 15% прогресса в мышечно-инвазивного видеБолезнь. Другие побочные эффекты, связанные с лечением БЦЖ включают дизурия, цистит и почечную инфекцию 3-6.
Разработка новых терапевтических стратегий необходимо принимать во внимание использование доклинических моделях, после первоначального пробирке оценки в; Это особенно актуально в опухолях которых микросреда может существенно повлиять на их развитие и реагирования на обращения.
За последнее десятилетие, мы обратились несколько аспектов иммунной модуляции деятельностью HP-NAP, белок, вырабатываемый бактерией Helicobacter Pylori, изначально определены как способные стимулировать эндотелия адгезию полиморфноядерных клеток (PMNs) 7. Конструктивно HP-NAP относится к ДНК-белок защиты при условиях голодали (DPS) семейства 8 и состоит из 12 идентичных субъединиц, расположенных в виде dodecameric оболочки.
Мы показали, что НР-НПДToll-подобный рецептор (TLR) 2 агонистом, с сильным иммуномодулирующее активностью, ответственной за рулем дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону фенотипа Th1, как в пробирке и в естественных 9-10. В силу этого активности, HP-NAP способен перенаправить иммунный ответ Th2 в более выгодным ответ Th1 в мышиной модели аллергической астмы 11.
Чтобы оценить Th1-зависимого потенциал анти-опухоли HP-NAP, мы воспользовались мышиной модели рака мочевого пузыря, разработанной несколько лет назад О'Доннел и коллег 12 для оценки влияния администрации БЦЖ.
С этого протокола, мы показали, что НР-NAP имеет большой потенциал анти-опухолевого против рака мочевого пузыря, и что эффективность управления HP-NAP параллельно значительное накопление в пределах опухоли и регионарных лимфатических узлов, обоих Th1 и Tc1 лимфоцитов, продуцирующих интерферон ( ИФН) -γ 13
Настоящий доклад обеспечивает протокол stepbystep, подробно подготовку животных, их уретры катетеризации, необходимого для прикрепления клеток к слизистой оболочки мочевого пузыря химический горение, и инъекции опухолевых клеток. Мы также описывают местное применение HP-NAP, что можно рассматривать как прототип любых терапевтических агентов, разработанных для лечения рака мочевого пузыря. Доказательства, полученные путем сравнения опухоли, выделенные из контроля и HP-NAP лечение животных подчеркивает не только тот факт, что HP-NAP может быть хорошим кандидатом для иммунотерапии рака мочевого пузыря, но и вообще эффективность экспериментальной установки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для обработки животного были утверждены Министерством здравоохранения Италии (DM 204/2011-Б).
1. Животные
- Растут C57BL6 / J самок мышей до 8-недельного возраста в отдельности вентилируемых клетках с microisolation фильтров.
Примечание: Женщины являются предпочтительными, поскольку анатомическое конформации их внешнего мочеполовой аппарат оказывает катетеризации легче, чем у мужчин.
2. Культура клеток
- Поддержание мыши уротелиальную клеточной линии карциномы MB49 в RPMI 1640 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг / мл гентамицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2.
- Растут MB49 клетки в Т-75 колб до 80% слияния. Trypsinize и ресуспендируют в 0,5 × 10 5 - 0,5 × 10 6 клеток на 150 мкл PBS перед имплантацией в мышей.
3. Внутрипузырная опухоли Имплантат
- Обезболить мышей, используя смесь в zoletil анестетиков и xylor (33 мг / кг и 20 мг / кг, соответственно), вводили внутрибрюшинно.
- Поместите животных в лежачем положении и зафиксировать задние ноги на площадку скотчем. Лапы должны быть достаточно отделены, чтобы оказать проход уретры хорошо видимый и легко доступный для вставки в катетер.
- Примечание: Для катетеризации, 24 г педиатрической венозный катетер подходит для 8 до 10 недель-старых мышей. Выбор катетера очень важно, чтобы избежать утечки жидкости между стенкой уретры и катетера. Большие катетеры расточки должна использоваться для больших или старых мышей.
- С помощью небольшой щипцы, щепотка один край наружной части уретры и крутить его очень осторожно к "головной части" мышей. В этом случае за мочеиспускательного канала.
- Удалить внутреннюю иглу катетера и вставки последних в мочеиспускательный канал под углом 45 °, слегка ориентированныхк "хвосте" мышей. Не заставить вход катетера; в случае сопротивления, просто крутить катетер очень осторожно, пока она не скользит внутри мочеиспускательного канала. При приблизительно 0,5-0,8 см катетера в мочеиспускательный канал, тщательно место катетера параллельно хвоста мышей и вставить его полностью.
- Использование 1 мл шприц, иглы, который должен быть вставлен в катетере, мыть мочевого пузыря от остаточной мочи путем введения 200-300 мкл стерильной PBS и аспирации всей жидкости из мочевого пузыря.
- Примечание: При инъекции PBS, мочевого пузыря будет заполнить и отек будет виден между задних ног у мышей; это подтверждает, что катетеризация является правильным. Большинство катетеры имеют мертвый объем, который необходимо учитывать при расчете объема впрыска.
- Используя стерильный шприц 1 мл, вводят 200 мкл 0,1 N HCl. Заполните пузыря, чтобы сжечь всю свою стену. После 10 сек, удалить все кислоту и сразу neutraliZE путем инъекции 200 мкл 0,1 N NaOH со стерильным шприцем. В случае инъекции наибольшее количество клеток (0,5 × 10 6), стадии подкисления не требуется.
- Отберите все остаточную жидкость и немедленно промойте полость 300 мкл стерильной PBS.
- Опорожнить мочевой пузырь путем аспирации, и вводят 150 мкл PBS, содержащие клетки MB49 (диапазон 0,5 × 10 5 - 0,5 · 10 6) в мочевой пузырь. Оставьте шприц, смонтированный на катетере, чтобы избежать утечки клеток. Лучше, чтобы обеспечить шприц, фиксируя его на площадку скотчем.
- После 1 часа, осторожно извлечь катетер из уретры, и поместить мышей в клетке, под лампы накаливания, пока они не будить: это обычно происходит между 1 и 2 ч после окончания лечения.
4. Внутрипузырная Доставка HP-NAP
- Примечание: По крайней мере, через 3 дня после закапывания клеток, можно начатьЛечение.
- Катетер, как описано в шагах от 3,1 до 3,4. На этой стадии, не нужно, чтобы сжечь стенки мочевого пузыря с HCl.
- Используя 1 мл шприц, мыть мочевого пузыря от остаточной мочи путем введения 200-300 мкл стерильной PBS и аспирации всей жидкости из мочевого пузыря.
- Вводят 50 мкг HP-NAP в 150 мкл PBS в мочевой пузырь. Оставьте шприц прикреплен к катетеру, чтобы избежать утечки раствора белка. Безопасный шприц, фиксируя его на площадку скотчем.
- После 1 часа, осторожно извлечь катетер из уретры и место мышей в клетке, под лампы накаливания, пока они не будить.
5. Опухоль Экспланты и Гистологический анализ
- В конце лечения, жертвовать животных, поместите их в положении лежа позиции и зафиксировать задние ноги на площадку скотчем.
- Использование хирургического скальпеля, сделать вертикальный разрез длиной около 1,52 см через кожу ибрюшины, начиная чуть выше наружных половых органов в "головном конце" мышей. Чтобы свести к минимуму риск повреждения мочевого пузыря, обратить особое внимание на глубину реза.
- Мочевого пузыря будет располагаться в центральной левой части разреза и опухоль будет видна как темная масса розовый / фиолетовый. По его удаления, поместите всю мочевого пузыря в гистологической клетке и зафиксировать 10% буферном формалине, прежде чем вложение в парафин.
- Для гистологических и гистохимических иммунной анализа, подготовки серийных срезов мочевого пузыря (46 мкм толщиной) с использованием стандартного микротом.
- Пятно секции гематоксилином / эозином и приступить к расчету размера опухоли (D ж ^ 2) и определения процентного содержания некроза в площади поперечного сечения с помощью компьютера помощь анализатора изображений.
- Для подсчета сосуда, перейдите окрашиванием разделы для эндотелия маркер CD31 / PECAM, используя стандартную технику иммунопероксидазой. Сканирование разделыт малой мощности (4 ×), чтобы определить область наибольшей плотности сосудов. В этом регионе, рассчитывать индивидуальные микрососудов в пяти отдельных случайных полей при высокой мощности (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает технику катетеризации; мыши катетер и привили с 0,5 × 10 6 клеток MB49. Лечение HP-NAP запускается через 3 дня после инъекции опухолевых клеток, чтобы дать им возможность приложить к стенке мочевого пузыря и размножаются. Все животные, принадлежащие к контрольной группе разработать опухоли; некоторые из них могут умереть до конца 13-дневного периода из-за закупорки уретры.
После первой инъекции с HP-NAP, животные лечатся каждые три дня, в общей сложности четыре инъекции. В конце эксперимента, в день тринадцать, животных умерщвляют и пузыри собирали для гистологического и иммунной гистохимического анализа. Как показано на фиг.2А, объем опухоли в мочевом пузыре из HP-NAP обработанных мышей значительно меньше, чем опухоли, обработанных носителем мышах (220 ± 62 мм 3 против 830 ± 180 мм 3).
Интересно, что в то время как в обработанных носителем животных опухоль прорастает основной жировой ткани, у 7 из 8 HP-NAP-обработанных животных опухоль ограничена в пределах стенки мочевого пузыря (фиг.2В). Наконец, васкуляризация снижается и степень некроза увеличивается в HP-NAP обработанных мышей по отношению с контрольными животными (фиг.2В и С).
Рисунок 1. Мыши катетеризации. Самки мышей под наркозом и катетер с использованием 24 г стерильного канюли. Правая панель является увеличение черного ящика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Анти-опухоли деятельность HP-NAP. Мыши, имплантированных в день 0 MB49 клеток (0,5 × 10 6), обрабатывают 50 мкг HP-NAP или PBS (транспортного средства) на 3, 6, 9 и 12. Все животные погибли на 13-й день (A) представитель гистологического анализа на пузырях, изолированные от контрольных мышей и HP-NAP лечение животных, а объем опухоли количественной оценке. (Б) Увеличение секций панели А и процент некроза в двух группах животных. (С) Резецированная пузыри, окрашенные для CD31 / PECAM; представительные участки от контроля и HP-NAP лечение животных показали. Количественная плотность микрососудов (C, правая панель); ФВЧ, HighPower поля. Данные представляют собой среднее ± SD; N = 8 мышей на группу. Статистическая значимость определялась Стьюдента т Испытайте (** р <0,01). Рисунок редактировался Codolo дрдр. 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство достижений в лечении рака требуют испытания на животных моделях перед началом клинических испытаний. Возможность изучения биологии опухоли в естественных условиях, воспользовавшись животных моделях, представляет собой важнейшую инструмент для исследователей, изучающих патогенез рака, позволяющих оценить различные терапевтические подходы. Ортотопическая модели остаются золотой стандарт 14-15, и из-за огромного количества клеточных линий, доступных создать модель опухоли и потому, что они имитируют среду в природе опухоли 16.
Кроме того, создание Ортотопическая модели рака в сингенных мышей, как описано здесь, является особенно актуальным в случае исследований, направленных на изучение новых терапевтических стратегий, основанных на иммунотерапии, поскольку последние не возможно в иммунодефицитных мышей, которые подвергаются xenoimplants.
Методология изображен в этом протоколе описываются тон катетеризации женского мочеиспускательного канала мыши, который позволяет как прививку опухолевых клеток и администрации терапевтических агентов в полость мочевого пузыря.
Преимущество предварительной подготовки стенки мочевого пузыря через химические ожоги (как описано выше, вместо других подходов, таких как использование трипсина или поли-лизин), является то, что содействовать развитию больших и высоко инвазивных опухолей. Напротив, предварительной подготовки трипсином и поли-лизина, приводит к меньшим и менее инвазивных опухолей, вероятно, из-за пагубного влияния остатков этих веществ на жизнеспособность опухолевых клеток 17. Химические ожоги, также предпочли другой предварительной подготовки системы, основанной на электрическом прижигания, потому что последний может привести к перфорации стенки мочевого пузыря и распространение опухоли в брюшину 18.
Протокол был оптимизирован для краткосрочных исследований (~ 13 дней). Имплантация прOper количество клеток имеет решающее значение, так как большее количество клеток приведет к более быстрого роста опухоли и, возможно, потери животных из-за большого бремени опухоли. Кроме того, до тех пор, пока пользователь не станет уверенным в технике, есть определенная степень риска в ущерб уретры или мочевого пузыря, тем самым вызывая гибель животных. По нашему опыту, однако, если животные адекватно работать (и, таким образом, не умирают во время процедуры), они живут без страданий в течение экспериментов (13 дней). Кроме того, за счет уменьшения количества вводимых клеток, можно увеличить продолжительность эксперимента.
Мы использовали эту модель для оценки противоопухолевой активности белка HP-NAP производимого Helicobacter Pylori, с целью улучшения, и в конечном итоге заменить, текущий терапии, основанной на БЦЖ с новым наделен высокими выгода / побочных эффектов Соотношение. В целом, этот экспериментальный подход может быть принят во всех предварительно Клиникал оценки, которые требуют доставки терапевтических агентов в полость мочевого пузыря.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Associazione Italiana в Ла-суль-Ricerca Рак, итальянского министерства университетов и исследований, проектов и расходные к Progetti ди-ди-Ricerca Ateneo, грант № ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, предоставить N ° 2011-0485 в MDB, и Finanziamento Джовани Studiosi Падуанского университета, в Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
