Abstract
במהלך זיהום ודלקת, מונוציטים במחזור לעזוב את זרם הדם ונודדים לרקמות, שבו הם להתמיין מקרופאגים. המקרופאגים לבטא קולטנים משטח-כמו אגרה (TLRs), אשר מזהים דפוסים מולקולריים נשמרים באמצעות אבולוציה במגוון רחב של מיקרואורגניזמים. TLRs לשחק תפקיד מרכזי בהפעלת מקרופאג אשר בדרך כלל משויכת לשינוי ביטוי גנים. המקרופאגים הם קריטיים במחלות רבות וצמחו כיעדים אטרקטיביים לטיפול. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים הליך לבודד מקרופאגים הצפק עכברי באמצעות מדיום thioglycollate של ברואר. האחרון יהיה להגביר את הגירת מונוציטים לצפק, בהתאם זה יעלה תשואת מקרופאג ידי פי 10. מספר מחקרים בוצעו באמצעות מח עצם, טחול או מקרופאגים הצפק נגזר. עם זאת, מקרופאגים הצפק הוצגו להיות בוגר יותר על בידוד ויציב יותר בהם תפקודיity ופנוטיפ. לפיכך, מקרופאגים מבודדים מחלל הצפק עכברי להציג אוכלוסיית תא חשובה שיכול לשמש במחקרים חיסוניים וחילוף חומרים שונים. ברגע בודד, מקרופאגים היו מגורה עם ligands TLR שונה וכתוצאה מכך ביטוי גנים הוערך.
Introduction
מערכת phagocytic הרטיקולואנדותליאלית מורכבת מתאים ברקמות שונות ואיברים כמו מוח עצם, דם, כבד וטחול. המקרופאגים מופצים באופן נרחב ברחבי הגוף, שבו הם בעיקר להשתתף במולד אדפטיבית תגובות חיסוניות לשלוט וזיהומים ברורים. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, מקרופאגים גם לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצעים ובשמירה על הומאוסטזיס רקמות 1,2. יתר על כן, מקרופאגים הם לא רק חשובים לתפקוד מערכת חיסון, אלא גם להשתתף באופן פעיל בברזל הומאוסטזיס 3. בגוף, כ -80% מברזל נמצאים בהמוגלובין בתוך אריתרוציטים, שכאשר הם מזדקנים phagocytosed ידי מקרופאגים 4. יומי, מקרופאגים אלה למחזר 25 מ"ג של ברזל המופק כדורית אדומה ולספק התחבורה שלה לפלזמה 5. יתר על כן, במהלך זיהום ודלקת, מקרופאגים פרו-דלקתיים לעקל ברזל בסרום להפחתת availabili הברזלטאי לפתוגנים, בשתי הרמות המערכתיות ומקומיות 6-8. כמו כן, מחקרים הראו כי מקרופאגים ובעיקר hepatocytes לייצר פפטיד מיקרוביאלית שם hepcidin שנחשב הרגולטור הראשי של ברזל חילוף חומרים 9, 10. Hepcidin הוא גדל בעיקר על ידי גירויים דלקתיים, והוא אחראי באופן חלקי לקיבוע ברזל במקרופאג על דלקת כרונית 11-13. כביטוי hepcidin במקרופאגים אינו מובן היטב, שחקרנו את התפקיד האפשרי של קולטני-כמו אגרה (TLRs) בתקנה זו. TLRs נמצא בעיקר במקרופאגים ולשחק תפקיד מרכזי בהפעלתם. בנוסף, ביטוי hepcidin המושרה LPS בכבד תלוי בTLR4 13. לכן, כדי לבצע המחקר שלנו, השתמשנו בשיטה המבוססת על הבידוד של מקרופאגים הצפק עכברי.
שורות תאי מקרופאג משמשות באופן נרחב בהרבעת מקרופאגies; בכל זאת תרבות המורחבת יכולה לעורר אובדן גן וירידה בתפקודים חיסוניים בשורות תאים אלה. לפיכך, בידוד של מקרופאגים מחלל הצפק הוא קריטי.
חלל הצפק העכבר מציג אתר אידיאלי למסוק מקרופאגים 13-15. מקרופאגים הצפק עכברי מבודדים נוחים לכמה מחקרים לגבי התפקוד החיסוני שלהם. עם זאת, מספר מקרופאגים בהצפק אינו מספיק למחקרים מקיפים והערכה הוא סביב 1 x 10 6 מקרופאגים לכל עכבר. לכן, כדי להעלות את תפוקת מקרופאג, סוכן לעורר סטרילי כגון thioglycollate הוזרק לתוך חלל הצפק שקדמו לבציר התא. לאחר הזרקת thioglycollate, התשואה של מקרופאגים לכל עכבר שעלתה בפי 10. למרות העלייה בתשואת מקרופאגים, המעשים בינוניים thioglycollate של ברואר כמטרד שגורם תגובה דלקתית, וכתוצאה מכך הגיוס של מקרופאגים, שmay אבל לא הכרחי משפיע על ביטוי גנים. לפיכך, קבוצת שליטה בהיקף של מקרופאגים שאינם מטופלים חייבת להיות כלולה בכל ניסוי. בידיים שלנו, ביטוי hepcidin שהמגורה מאוד על ידי דלקת לא זוהה בthioglycollate שאינו מטופלים שהושרו מקרופאגים הצפק. יתר על כן, מחקרים הראו כי thioglycollate של ברואר מגייס מקרופאגים רבים, אבל לא להפעיל אותם 16. מצד השני, thioglycollate של ברואר שהושרו מקרופאגים הראו עלייה באנזים lysosomal אבל ירידה בהרג מיקרואורגניזמים בלע 17. עם זאת, יכולת phagocytic לא הושפעה בהשוואה למקרופאגים-הושר לא 16.
ברגע תרבותי במנות, מקרופאגים הצפק להיות חסיד, ובכך מאפשרים הפרדתם מסוג אחר של תאים מבודדים מחלל הצפק. בהמשך לכך, מקרופאגים המבודדים היו תיגר עם אגוניסטים TLRs שונים.לבסוף, mRNA היה שחולץ מהתאים בתרבית וביטוי גנים נותח באמצעות תגובת שרשרת כמותי הפוכה transcriptase-פולימראז (qRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים בוצעו בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לאחר אישור הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים של מרכז דה משוכלל ונדיר du המרכז הרפואי de l'אוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM).
1. בידוד, זיהוי, ותרבות של Murine הצפק המקרופאגים
- הכן בינוני thioglycollate של 3.8% ברואר. לשם כך, להשעות 38 גרם של thioglycollate בינוני ב1,000 מיליליטר של מים מזוקקים. להביא פתרון לרתיחה לפזר הבינוני לחלוטין. לעקר ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחסן עד 3 חודשים בחושך, בRT 18.
הערה: בטל אם עכירות מפתחת המצביעה על זיהום חיידקים. הפתרון יכול להיות כל הזמן לעד שנה בחושך אם שמר סטרילי. - שימוש 1 מיליליטר מזרקים מצורפים 23 מחטי G, להזריק 1 מיליליטר של 3.8% ברואר thioglycollate בינוניים לתוך חלל הצפק של כל mouSE ולחכות 3 ימים. השתמש מזרק ומחט חדשים לכל עכבר.
- להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של נתרן pentobarbital (100 מ"ג / קילוגרם) ולהרדים עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם. לאשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת קצב הנשימה. בדרך כלל נשימות מהירות מצביעות על כך שהעכבר לא מורדם עמוק.
- שטוף את הבטן של כל עכבר עם 70% אתנול. באמצעות מספריים, לבצע חתך לרוחב לאורך קו האמצע התחתון של הצפק.
- בעזרת מלקחיים, למשוך בחזרה את עור הבטן כדי לחשוף את עור הצפק השקוף. שימוש במזרקים 5 מיליליטר מצורף 20 מחטי G, להזריק 5 מיליליטר של DPBS הקר לתוך חלל הצפק של כל עכבר.
- לבצע עיסוי עדין בחלל הצפק ולאחר מכן לשאוב את הנוזל בזהירות מבלי ניקוב כל איבר. הסר את המחט ולוותר נוזל הצפק לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 400 XG בצנטריפוגה בקירור.תאים חייבים להישאר קרים במהלך כל התהליך. בטל supernatant ו resuspend תא גלולה במדיום RPMI 1640.
- באמצעות hemocytometer, לספור תאים ולהסתגל לצפיפות תאים 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- לאפיין את הפנוטיפ של תאים מבודדים על ידי cytometry זרימה באמצעות 1 x 10 6 תאים לכל עכבר וantibodie נגד F4 / 80 (אנטיגן שטח הביע במקרופאגים).
2. טיפולים סלולריים
- ישירות, לאחר בידוד, להוסיף 1 x 10 6 תאים לכל אחד. השאר את מקרופאגים הצפק עכברי לדבוק לתוך צלחות 6-היטב על ידי culturing אותם ל1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הסרת תאים שאינם חסיד בעדינות על ידי שטיפת 3 פעמים עם PBS החם.
- בהמשך לכך, תאי תרבות בסרום ללא DMEM 900 μl למשך 24 שעות בנוכחות ligands TLR הבא: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (מ"ג 0.5 / מיליליטר); פולי (אני: C) -TLR3 (10 מ"ג / מיליליטר) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 מיקרוגרם / מיליליטר); ODN1826-TLR9 (1 מיקרומטר).
הערה: הכן לכל יגנד פתרון 10x המניה. להוסיפם של אלה 100 μl היטב כל אחד, ובכך מבצע דילול של פי 10.
בידוד 3. RNA
- הסר את כל התאים בינוניים וlyse ישירות בצלחות שש היטב על ידי הוספת 1 מיליליטר TRIzol היטב כל אחד ועובר lysate התא מספר פעמים באמצעות פיפטה. דגירה דגימות homogenised במשך 5 עד 10 דקות ב RT, על מנת לאפשר לניתוק של מתחמי nucleoprotein המלא.
- העבר את lysate לתוך 1.5 מיליליטר RNase- וצינורות microcentrifuge ללא DNase. להוסיף 0.2 מיליליטר כלורופורם לTRIzol 1ml. Shake צינורות במרץ ביד במשך 15 שניות ודגירתם על RT במשך 5 עד 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שים לב לתערובת מפרידה לשלב אדום (פנול, כלורופורם) נמוך, הביניים ושלב מימיים עליון חסר צבע. RNA נשאר אך ורק בשלב המימי.
- טראןספיר בזהירות את השלב מימי העליון לצינור טרי מבלי להפריע הביניים. לזרז את הרנ"א מזה על ידי ערבוב עם 0.5 מיליליטר של אלכוהול איזופרופיל. דגירה דגימות ב RT במשך 10 דקות ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. RNA משקעים יוצר גלולה לבנה בצד והחלק התחתון של הצינור.
- הסר supernatant. שטוף את כדור פעם אחת RNA עם 1 מיליליטר של אתנול 75%. מערבבים את הדגימות על ידי vortexing ו צנטריפוגות ב 7500 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. בקצרה לייבש את RNA (אוויר יבש במשך 10 דקות). לפזר RNA ב 0.1 מיליליטר DEPC (מים חופשיים RNAse) ודגירה של 10 דקות על 55 מעלות צלזיוס.
- לכמת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי לעשות זאת, לדלל דגימות במי DEPC 100 פעמים ולקרוא באורכי גל של 260 ננומטר. אז ריכוז RNA יהיה: OD 260 x 40 ng ul x גורם לדילול /.
- להשוות ריכוזי RNA וסינתזה cDNA לפי הוראות יצרן באמצעות מערכת RT-PCR לערכת ראשון סטרנד cDNA סינתזה. כלפי הוראות יצרן, למדוד את רמות ה- mRNA של הגן על ידי בזמן אמת PCR (45 מחזורים) במערכת זיהוי DNA בזמן אמת. לנרמל את רמות ביטוי גנים עם גן שני משק למשל β-אקטין וGAPDH.
הערה: נרמל ריכוז RNA 500 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשתמש 0.5 מיקרוגרם לסינתזת cDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מאופיינים ראשון מקרופאגים הצפק עכברי המבודדים על ידי cytometry זרימה. לשם כך, השתמשנו (F4 80 /) נוגדנים שבמיוחד להכיר סמנים לידי ביטוי רק על ידי מקרופאגים. אפיון זה נדרש כדי לקבוע את אחוז מקרופאג המבודד וכדי להבדיל ביניהם בין תאים המתקבלים בתהליך הבידוד. כפי שניתן לראות ב( איור 1), אחוז התאים המבטא את האנטיגן F4 / 80 נמצא באופן עקבי להיות מעל 95%. בשלב הבא, ללמוד ביטוי גנים במקרופאגים, טופלו התאים המבודדים עם כמה ligands TLR: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) וFSL1 (TLR6 / 2). בהמשך לכך, רמות ה- mRNA של Hepcidin (האמפ), הגן של ענייננו, נמדדו על ידי RT-PCR. כפי שניתן לראות ב( איור 2), TLR1 / 2, / 2 ligands TLR4 וTLR6 היו מסוגל גירוי mRNA hepcidin במקרופאגים עכברי 19. יחד, תוצאות אלה ממחישות את התועלת של פרוטוקול זה למוצלחly לבודד מקרופאגים הצפק עכברי ולחקור דווקא הרגולציה המולקולרית של ביטוי גנים.
אפיון איור 1. תאים מבודדים מחלל הצפק. ההעשרה של מקרופאגים התאוששו אושר על ידי ניתוח התזרים cytometric באמצעות נוגדן F4 / 80 לאחר חסימת מכתים ספציפי עם נוגדנים / CD32 CD16 ונמצא באופן עקבי להיות מעל 95%.
איור 2. TLR ligands לגרום ביטוי hepcidin במקרופאגים הצפק עכברי. לאחר בידוד עכברי הצפק מקרופאגים וגירוי עם TLR1 / 2, TLR4 וTLR6 / 2 ligands, רמות ה- mRNA hepcidin נחקרו על ידי תגובת שרשרת כמותי הפוכה transcriptase-פולימראז. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM;nd (לא ניתן לגילוי); * P <0.05 לעומת שליטה (Ctrl). תוצאות הן נציג של 3 ניסויים דומים בוצעו באופן עצמאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המקרופאגים הם חיוניים להישרדות ולספק יעד מפתה כדי לתפעל את המארח למטרות חיסוניות. הגילוי של TLRs ומולקולות הכרה אחרות שנערך מקרופאגים למרכז דיון חיסוני. המקרופאגים להגיב למגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מולקולות הקשורים נזק מולקולרי דפוס (damps) 20 ומולקולות הקשורות לקבוצות של פתוגנים (PAMPs) 21. תגובות לגירויים שונות אלה מייצגים במהלך הפעלת מקרופאגים, והם בדרך כלל קשורים בשינויים פתאומיים בביטוי גנים 22.
בתנאים שאינם תנאים דלקתיים, רוב מקרופאגים מתגוררים במקומות אסטרטגיים בגוף. ניתן למצוא אותם בכל הרקמות וכמחזור מונוציטים בדם. לכן, מקרופאגים נמצאים באתרים הרגישים ביותר לפלישת חיידקים.
הגנת המארח מתוארת כאניתגובת nflammatory לחיסול של פתוגנים תאיים הקשורים בהפעלת מקרופאג קלסית. ההפעלה הקלסית של מקרופאגים מושרה על ידי מוצרים של חיידקים כגון lipopolysaccharides בסביבת ציטוקינים Th1 שיביא לקיטוב M1-מקרופאגים פרו-דלקתי. ההתמדה של תוצאות דלקת בנזק לרקמות והפיתוח של מנגנונים אנטי-דלקתיים הכרחיים להישרדותה של המארח. לכן, ציטוקינים Th2 יאפשר לאחר מכן את המבוא של קיטוב M2-מקרופאגים אנטי דלקתי אשר מעכב ומסדיר את תגובת M1, וגם מקדמים תיקון רקמות. בפרוטוקול המתואר במאמר זה, thioglycollate הזרקה בחלל הצפק מגרה את המפל הדלקתי הקלאסי ומובילה לגיוס של מקרופאגים M1.
עד כה, מספר מחקרים בוצעו באמצעות מח עצם, טחול או מקרופאגים הצפק נגזר. מקרופאגים אלו מייצגים heterogeneאוכלוסיות היחידות הארגוניות עם פעילויות שונות. בהתבסס על מאפייני המורפולוגיה ופני שטח מולקולרי שלהם, המחקרים קבעו כי מקרופאגים הצפק הם בוגרים יותר ממח עצם וטחול מקרופאגים נגזר 23. שלא כמו טחול והצפק מקרופאגים נגזרו, מקרופאגים נגזרו מח העצם להציג יכולת מרשימה בpahgocytosis ושגשוג ויכולים להיות מובחנים לחלוטין מתאי מקרופאג 20,24,25. בנוסף, הבידוד של מקרופאגים מח העצם מציג תשואה הומוגנית עם תוחלת חיים ארוכות. מצד השני, מקרופאגים אלו אינם מתאפיינים באופן מלא והשימוש בם במחקרי ניסויים מציג סיבוכים בשל ההפכפכות של פנוטיפ ומתפקד 26. שלא כמו מקרופאגים מח עצם נגזרים, טחול ומקרופאגים הצפק נראה להיות יותר פונקציונלי ויציב 23 phenotypically.
לפיכך, את בידודה של ג מקרופאגים הצפק עכברילשרת מחקרים חיסוניים שונים וניתוח ביטוי גנים. בנוסף, חלל הצפק העכבר מאפשר אתר אידיאלי למקרופאגים תושב קציר 27. עם זאת, המספר שהושרו הוא מתון ומוערך בסביבות 1 x 10 6 מקרופאגים לכל עכבר. לכן, כדי להגדיל את היבול של מקרופאגים, לעורר סוכנים כגון thioglycollate הוזרק בחלל הצפק 3 ימים לפני תא בידוד 28. סוכן זה יגרום לתגובה דלקתית ובהתאם להגדיל יבול מקרופאג.
זה הכרחי כדי לבצע עיסוי עדין בחלל הצפק לפני הנסיגה לאט את נוזל הצפק ללא ניקוב כל איבר. מושך את הנפח המקסימאלי האפשרי נדרש כדי לאסוף את המספר הגדול ביותר של התאים. במקרה של זיהום בדם, מאגר תמוגה ניתן להשתמש בסוף ההליך להשליך תאי דם אדומים. אז יכולים להיות מאופיינים מקרופאגים שהושרו על ידי זרימת cytometr y באמצעות נוגדנים נגד אנטיגנים ייחודיים למקרופאגים כF4 / 80.
לאורך כל ההליך, לוודא שכל חומרים כימיים הם רעלן פנימי ללא כל בעלי החיים ושוכנו באופן קבוע בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים. ביצוע הליך זה בתנאי הפתוגן ללא הוא קריטי משום שגירוי מקרופאג לפני הניסויים הממשמש ובא ישנה באופן משמעותי את ניתוח התוצאות.
ברגע בודד, ניתן להשתמש מקרופאגים הצפק במספר מחקרים, כוללים ייצור של ציטוקינים דלקתיים, phagocytosis, איתות תא, ביטוי גנים, chemotaxis וטוקסיקולוגיה 29. לדוגמא, לאחר גירוי עם ligands TLR שונה, שחקרנו במקרופאגים שהושרו רגולציה המולקולרית של רגולטור מרכזי של hepcidin שם מטבוליזם הברזל. 24 שעות לאחר טיפולי תא, רנ"א הכל היה מבודד עם מגיב TRIzol, וביטוי גנים נותח באמצעות qRT-PCR.
_content "> כפי שאנו לומדים הפעלת TLRs וביטוי גנים, השימוש בסרום ללא DMEM מומלץ. מדיום חופשי בסרום מפחית את התואר של מזהמים ולחסל כל מקור אפשרי של חומרים מזהמים.אם כי בידוד RNA נראה תהליך פשוט, יש להימנע RNase וזיהום DNA כדי למנוע השפלה RNA ולהשיג תוצאות qRT-PCR מדויקות. הדרך הטובה ביותר לזהות זיהום הדנ"א היא לכלול '-RT מינוס "שליטה עבור כל דגימת RNA בניסוי RT-PCR. אם מוצר ה- PCR שנוצר ממדגם RNA שלא להפוך עיבד לאחר מכן את המוצר היה מוגבר מזיהום DNA. במקרה של זיהום DNA, השימוש בטיפול DNase אפשרי. עם זאת, DNase חייב להיות מובטל לחלוטין לפני RT-PCR, כך שזה לא לבזות DNA מסונתז חדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC, מענק לא 298,515-2011). AL הוא הנמען של דוקטורט מלגה ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC), ו- MS נתמכה ממענק מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, להעניק אין. MOP123246).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
