Abstract
Enfeksiyon ve inflamasyon sırasında dolaşımdaki monositler kan dolaşımına bırakın ve onlar makrofajlar içine ayırt dokulara, göç. Makrofajlar mikroorganizmaların geniş bir yelpazede evrimle korunmuş moleküler şekilleri tanıyan yüzey Toll-benzeri reseptörler (TLR), ifade eder. TLR genellikle gen ekspresyonu değiştirilmesi ile ilişkili makrofaj aktivasyonunda önemli bir rol oynar. Makrofajlar pek çok hastalıkta önemli ve tedavisi için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol, bira, tiyoglikolat vasatı kullanılarak sıçan periton makrofajları, izole edilmesi için bir prosedür açıklanmaktadır. İkincisi buna göre bu 10 kat makrofaj verim çıkaracağız, periton içine monosit göçü artıracak. Pek çok çalışma, kemik iliği, dalak veya periton türetilmiş makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, periton makrofajlar izolasyon üzerine daha olgun olduğu gösterilmiştir ve bunların fonksiyonel olarak daha kararlı edildiSığ ve fenotip. Böylece, fare periton boşluğuna izole makrofajlar farklı immünolojik ve metabolik çalışmalarda hizmet verebilir önemli bir hücre popülasyonu sunuyoruz. İzole bir kez, makrofajlar farklı TLR ligandları ile uyarıldı ve dolayısıyla gen ifadesi değerlendirildi.
Introduction
retiküloendotelyal fagositik sistemi, kemik iliği, kan, karaciğer ve dalak gibi çeşitli dokularda ve organlarda hücrelerden oluşmaktadır. Makrofajlar yoğun bunlar, özellikle doğuştan katılmak ve kontrol bağışıklık tepkilerini ve net enfeksiyonları uyarlamalı vücudun etrafında dağıtılır. Host savunmasında rollerine ilave olarak, makrofajlar, yara iyileşmesi ve doku homeostazını 1,2 muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, makrofajlar bağışıklık işlevi sadece önemli değil, aynı zamanda aktif demir homeostazda 3 katılacak. Vücutta demir yaklaşık% 80'i yaşlanmış makrofajlar tarafından fagosite 4 hangi zaman, eritrositler içinde hemoglobin bulunur. Günlük, bu makrofajlar eritrosit kaynaklı demir 25 mg geri dönüşüm ve plazma 5 içine ulaşım sağlamaktadır. Ayrıca, enfeksiyon ve enflamasyon sırasında, pro-inflamatuar makrofajlar demir availabili azaltmak için serum demir çekilmekhem sistemik ve yerel düzeylerde 6-8 patojenlerin için ty. Makrofajlar ve özellikle hepatositler demir metabolizmasının 9, 10 master regülatörü olarak kabul edilir hepsidin adında bir antimikrobiyal peptid üretmek Yanı sıra, çalışmalar göstermiştir. Hepsidin esas inflamatuar uyaranlara artmış ve kronik inflamasyon 11-13 üzerine makrofaj demir haciz kısmen sorumludur. Makrofajlarda hepcidin ifadesi çok iyi anlaşılamamıştır, biz bu yönetmelikte Toll benzeri reseptörler olası rolünü (TLR) okudu. TLR'ler öncelikle makrofajlar üzerinde bulunan ve aktivasyon merkezi bir rol oynarlar. Buna ek olarak, karaciğer LPS kaynaklı Hepsidin sentezleme TLR4 13 bağlıdır. Bu nedenle, çalışma çalıştırmak için, Sıçan peritonal makrofajları izolasyonu dayanan bir yöntem kullanılır.
Makrofaj hücre dizileri genel olarak, makrofaj saplama kullanılanler; yine genişletilmiş kültür geni kaybını kışkırtmak ve bu hücre hatlarında bağışıklık fonksiyonları azalmış olabilir. Bu nedenle, periton boşluğundan makrofajların izolasyonu önemlidir.
Fare periton boşluğu makrofajlar 13-15 hasat için ideal bir siteyi sunuyor. İzole fare periton makrofajlar onların immünolojik fonksiyonu ile ilgili çeşitli çalışmalar için uygundur. Ancak, periton makrofajların sayısı geniş çalışmalar için yetersiz ve fare başına yaklaşık 1 x 10 6 makrofajlar tahmin edilmektedir. Bu nedenle, makrofaj üretimini artırmak için, örneğin tiyoglikolat gibi steril ortaya çıkarma maddesi, hücre hasat Yukarıdaki periton boşluğu içine enjekte edilmiştir. Tiyoglikolat enjeksiyonundan sonra, fare başına makrofajların verimi 10-kat artmıştır. Makrofajlar verim, makrofajlar alımı, MA içinde elde edilen, bir enflamatuvar yanıtı indükleyen bir tahriş edici olarak Brewer, tiyoglikolat vasatı eylemleri artışa rağmeny, ancak gerekli değildir, gen ekspresyonunu etkiler. Bu nedenle, muamele edilmemiş makrofaj oluşan bir kontrol grubudur, her bir deney içinde dahil edilmelidir. Bizim ellerde, çok inflamasyon ile uyarılır hepsidin ifade periton makrofajlar ortaya dışı muamele tiyoglikolatın saptanmadı. Ayrıca, çalışmaların Bira tiyoglikolat sayıda makrofajların, fakat bunlara 16 aktive etmediğini göstermiştir. Öte yandan, Bira tiyoglikolat makrofajlar lizozomal enzim bir artış ancak yutulur mikroorganizmaları öldürme 17 azalma gösterdi ortaya çıkardı. Olmayan tetiklenen makrofajlar 16 ile karşılaştırıldığında, ancak, fagositik kapasitesi etkilenmedi.
Yemekler kültürlenen sonra peritoneal makrofajlar nedenle periton boşluğu izole diğer hücre türünden bunların ayrılmasına izin veren, yapışkan hale gelir. Daha sonra izole edilmiş makrofajlar, farklı TLR agonistleri ile tehdit edildi.Son olarak, mRNA, kültürlenmiş hücrelerden ekstrakte edildi ve gen ekspresyonu kantitatif ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak analiz edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (CRCHUM) tarafından onaylandıktan sonra Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre yapıldı.
1. İzolasyon, Kimlik ve Kültür Kemirgen Periton Makrofagların
- % 3.8 bira tiyoglikolat orta hazırlayın. Bunu yapmak için, damıtılmış su içinde 1000 ml tiyoglikolat vasatı içinde 38 g askıya almak için. Tamamen orta çözmek için kaynamaya çözüm getirin. 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ile sterilize edin. RT 18 at, karanlıkta 3 aya kadar saklayabilirsiniz.
NOT: Bulanıklık bakteriyel kontaminasyon işaret eden gelişirse atın. Steril tutulması durumunda çözüm karanlıkta bir yıla kadar muhafaza edilebilir. - Her MZ'nin periton boşluğu içine% 3.8 Brewer, tiyoglikolat vasatı 1 ml enjekte edilir, 23 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarakse 3 gün bekleyin ve. Her fare için yeni şırınga ve iğne kullanın.
- Sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile fareler anestezi ve servikal dislokasyon ile farelerin euthanize. Solunum hızı kontrol ederek uygun anesthetization onaylayın. Genellikle hızlı Solunum fare derin anestezi yapılmadan olduğunu göstermektedir.
- % 70 etanol ile her bir farenin karın yıkayın. Bir makas kullanarak, periton alt orta hat boyunca bir yanal kesi yapmak.
- Bir forseps kullanarak, şeffaf periton cilt ortaya çıkarmak için karın cilt geri çekin. 20 G iğne takılı 5 mi şırınga kullanarak, her bir farenin karın boşluğu içine soğuk DPBS 5 ml enjekte edilir.
- Periton boşluğuna üzerinde yumuşak bir masaj yapın ve sonra herhangi bir organı delinmesiyle olmadan dikkatlice sıvıyı aspire. İğneyi çıkarın ve 50 ml konik santrifüj tüplerine periton sıvısı dağıtmak.
- Soğutuculu santrifüj 400 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.Hücreler tüm prosedür sırasında soğuk kalmalıdır. RPMI ortamı 1640 süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın.
- Bir hemasitometre kullanarak, hücrelerin sayısı ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğuna kadar ayarlayın.
- F4 / 80 karşı fare ve Antikorların başına 1 x 10 6 hücreleri kullanılarak akış sitometrisi ile izole edilmiş hücrelerin fenotipini karakterize (bir yüzey antijeni makrofajlar üzerinde ifade edilir).
2. Hücre Tedavileri
- Doğrudan, izolasyondan sonra, her kuyuya 1 x 10 6 hücre ekleyin. 37 ° C'de 1 saat ila 2 içinde kültürlenmesi ile 6-çukurlu plakalara yapışmaya sıçan periton makrofajları, bırakın. Hafifçe sıcak PBS ile 3 kez yıkanarak yapışmayan hücreler çıkarın.
- Daha sonra, 900 ul serum içermeyen DMEM içinde kültür hücreleri, şu TLR ligandlar varlığında, 24 saat süre ile (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 mg / ml); Poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) LPS-TLR4 (100 ng / ml); flagellin'e TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
NOT: Her ligand 10x stok solüsyonu için hazırlayın. Bu şekilde, bir 10-kat seyreltme yapılarak, her bir ikincisi, 100 ul ekle.
3. RNA İzolasyon
- Bir pipet ile birkaç kez her kuyuya, 1 ml Trizol eklenmesi ve hücre lizatı geçen altı oyuklu plakalar içinde doğrudan tüm orta ve lize hücreleri çıkarın. Nükleoprotein kompleksinin tam bir ayrışma izin vermek için, oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca homojenize örnekleri inkübe edin.
- 1.5 ml lizat transfer RNase- ve DNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpleri. 1ml TRIzol başına 0.2 ml kloroform ekleyin. 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde tüpleri çalkalanır ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin. Bir düşük değerli kırmızı renkte bir faz (fenol-kloroform) ayrılarak karışımı, bir faz ve renksiz bir üst sulu faz dikkate alınmalıdır. RNA, sulu faz içinde özel olarak kalır.
- Traninterfazda bozmadan, yeni bir tüpe Sfer dikkatle üst akıcı faz. Izopropil alkol, 0.5 ml ile karıştırılarak bu RNA hızlandırabilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 x g'de 10 dakika santrifüj boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. RNA tüpün yan ve alt beyaz pelet oluşturan çökeltileri.
- Süpernatantı. % 75 etanol içinde bir kez 1 mL RNA pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'de vorteks ve santrifüj ile örnekleri karıştırın. Kısaca RNA (10 dakika boyunca hava kuru) kurutun. 0.1 mi DEPC (RNaz içermeyen su) içinde RNA eritin ve 55 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
- Bir spektrofotometre kullanılarak RNA niceliğini. Bunu yapmak için numuneler DEPC su içinde 100 kez seyreltilmesi ve 260 nm dalga boyunda okundu. RNA konsantrasyonu daha sonra olacak: OD 260 x 40 ng / ul x seyreltme faktörü.
- RNA konsantrasyonları eşitlemek ve İlk Strand cDNA Sentezi Kit RT-PCR Sistemi kullanılarak üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez. Olaraküreticinin talimatlarına göre gerçek zamanlı PCR, bir gerçek zamanlı DNA tespit sisteminde (45 devir) ile gen mRNA seviyelerini ölçer. Örnek β-aktin ve GAPDH için iki temizlik geni ile gen ekspresyon düzeyleri Normale.
NOT: ml 500 ug / RNA konsantrasyonu Normale ve cDNA sentezi için 0.5 ug kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk akış sitometrisi ile izole edilmiş sıçan periton makrofajları, karakterize edilir. Bunu yapmak için, özellikle yalnızca makrofajlar tarafından ifade edilen markerler tanır (F4 / 80) antikorları kullanılmıştır. Bu karakterizasyon izole makrofaj yüzdesini belirlemek için ve izolasyon işlemi sırasında elde edilen hücreler arasında onları ayırmak için gereklidir. (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücrelerin yüzdesi F4 / 80 sürekli olarak% 95 üzerinde olduğu tespit edilmiştir antijeni eksprese eden. Daha sonra, makrofajlar gen ifadesini incelemek için, izole edilmiş hücreler, birkaç TLR ligandları ile muamele edilmişlerdir: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) ve FSL1 (TLR6 / 2). Daha sonra, Hepsidin (Hamp), ilgi konusu eden genin mRNA düzeyleri RT-PCR ile ölçülmüştür. TLR1 / 2 (Şekil 2) gösterildiği gibi, TLR4 ve TLR6 / 2 ligandları sıçangil makrofaj 19 Hepsidin mRNA uyarabilen edildi. Birlikte, bu sonuçlar başarılı bu protokolün yararlılığını göstermektedirly fare periton makrofajlar izole ve hassas gen ifadesinin moleküler düzenlenmesini araştırmak.
Periton boşluğundan geri makrofajların. Zenginleştirilmesi izole hücrelerin Şekil 1. Karakterizasyonu CD16 / CD32 antikorları ile spesifik olmayan boyama engelleme sonra F4 / 80 antikoru kullanılarak akış sitometrik analizi ile teyit edildi ve sürekli olarak% 95 üzerinde olduğu tespit edilmiştir.
Şekil 2. Toll benzeri reseptör murin periton makrofajlarında Hepsidin ekspresyonunu indüklemek ligandları. TLR1 / 2 fare peritoneal makrofajlar izolasyonu ve uyarımın ardından TLR4 ve TLR6 / 2 ligandlar hepcidin mRNA seviyelerinin niceliksel ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile. Veri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır;nd (tespit edilemez); * P <0.05, kontrole karşılık (CTRL). Sonuçlar bağımsız gerçekleştirilen 3 benzer deneyler temsilcisi vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofajlar hayatta kalmak için çok önemlidir ve immünolojik hedefler için ana işlemek için cazip bir hedef sağlar. TLR ve diğer tanıma moleküllerinin keşfi immünolojik tartışmaların merkezine makrofajlar yaptık. Makrofajlar sitokinler, hasar ile ilişkili molekül model molekülü (DAMPS), 20 ve patojenlerin (PAMPs) 21 grupları ile ilişkili moleküller de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara, yanıt. Bu farklı uyaranlara yanıt makrofaj aktivasyonu seyrini temsil etmektedir ve genellikle gen ekspresyonu 22 ani değişiklikler ile ilişkilidir.
Iltihabı olmayan koşullarda, makrofajlar çoğunluğu gövdesinin stratejik konumlarda bulunur. Tüm dokularda ve kanda dolaşan monositlerde olarak bulunabilir. Bu nedenle, makrofajlar mikrobik istila için en hassas sahaları mevcuttur.
konak savunma bir i olarak tarif edilirKlasik makrofaj aktivasyonu ile bağlantılı hücre içi patojenler arasında ortadan kaldırılması nflammatory yanıt. makrofajlar klasik aktivasyonu, proenflamatuar M1-makrofaj polarizasyon yol bir Th1 sitokin ortamında lipopolisakkaritler gibi mikrobiyal ürünler tarafından indüklenir. doku hasarına inflamasyon sonuçlarının sebat ve konağın yaşaması için gerekli olan anti-inflamatuar mekanizmaların geliştirilmesi. Bu nedenle, Th2 sitokinleri, daha sonra inhibe eder ve M1 tepkisini düzenler, anti-enflamatuar, M2-makrofaj polarizasyon giriş sağlar ve aynı zamanda doku onarımını teşvik etmektedir. Bu yazıda anlatılan protokolde, periton boşluğuna tiyoglikolat enjeksiyon klasik inflamatuar kaskad uyarır ve M1 makrofajlar istihdamına yol açar.
Bugüne kadar, bir çok çalışma, kemik iliği, dalak veya periton türetilmiş makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu makrofajlar Heterojen temsilFarklı aktivitelerle lı popülasyonları. Onların morfoloji ve yüzey moleküler özelliklerine dayanarak, çalışmalar periton makrofajlar kemik iliği ve dalak kökenli makrofajlar 23 daha olgun olduğunu kurduk. Türetilmiş makrofajlar dalak aksine ve periton, kemik iliği kökenli makrofajlar pahgocytosis ve çoğalmasında kayda değer bir yetenek sunmak ve tamamen makrofaj progenitör hücrelerden 20,24,25 ayırt edilebilir. Buna ek olarak, kemik iliği makrofajlar izolasyonu uzun ömrü ile homojen bir verim sunuyor. Diğer yandan, bu makrofajlar tam olarak karakterize edilmedi ve deneysel çalışmalarda kullanılmaları fenotip değişkenlik nedeniyle komplikasyonlar sunulur ve 26 çalışır. Kemik iliğinden elde edilen makrofajlar, dalak ve periton makrofajlar aksine daha işlevsel ve 23 fenotipik kararlı görünmektedir.
Sıçan peritonal makrofajları c Dolayısıyla, izolasyonBir farklı immünolojik çalışmalar ve gen ifadesi analizi hizmet vermektedir. Buna ek olarak, fare peritoneal kavite hasat yerleşik makrofajlar 27 için ideal sitesi elde edilir. Ancak, ortaya çıkardı sayı orta ve fare başına 1 x 10 6 makrofajlar etrafında tahmin olduğunu. Bu nedenle, tiyoglikolat 3 gün hücre izolasyonu 28 önce periton boşluğu içine enjekte edilmiştir gibi maddeler ortaya çıkarmak, makrofajlar hasat geliştirmek için. Bu ajan, bir iltihabi tepki doğurmaz ve buna bağlı olarak, makrofaj kırpma artacaktır.
Herhangi bir organı delinmesiyle olmadan yavaş yavaş periton sıvısı çekilerek önce periton boşluğuna üzerinde yumuşak bir masaj yapmak için zorunludur. Maksimum olası hacmi çekerek büyük hücre sayısını toplamak için gereklidir. Kan kirlenme durumunda, bir parçalama tamponu kırmızı kan hücreleri atmak için prosedürün sonunda kullanılabilir. ortaya makrofajlar da akış cytometr ile karakterize edilebilir Y F4 / 80 olarak makrofajlar özgü antijenlere karşı antikorlar kullanılarak.
Süreci boyunca, tüm reaktifler endotoksin içermeyen ve bütün hayvanlar sürekli olarak belirli bir patojen içermeyen koşullar altında barındırılmıştır olduğundan emin olun. Önce yaklaşan deneylere makrofaj stimülasyon ölçüde sonuç analizi değiştirecek çünkü patojen içermeyen koşullar altında bu işlemi gerçekleştirmeden önemlidir.
Bir kez izole peritoneal makrofajlar enflamatuar sitokinler, fagositoz, hücreler arası iletimde, gen ekspresyonu, kemotaksi ve toksikoloji 29 üretimi de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda, kullanılabilir. Örneğin, farklı bir Toll benzeri reseptör ligandları ile stimülasyon sonra ortaya makrofajlarda demir metabolizması adlandırılan Hepsidinin anahtar düzenleyicisi moleküler de araştırıldı. Hücre işlemlerinden sonra 24 saat, toplam RNA, TRlzol tepkin maddesi ile izole edildi, ve gen ekspresyonu QRT-PCR ile analiz edildi.
_content "> biz TLR aktivasyonu ve gen ifadesini okuyan gibi, serum serbest DMEM kullanılması tavsiye edilir. Serum serbest ortam kirletici derecesini azaltır ve enfeksiyöz ajanların olası kaynağını ortadan kaldırmak.RNA izolasyonu basit bir süreç gibi görünüyor olsa RNaz ve DNA kontaminasyonu RNA bozulmasını önlemek ve doğru QRT-PCR sonuçları elde etmek için kaçınılmalıdır. DNA kontaminasyonu tespit etmek için en iyi yolu, bir RT-PCR deneyinde, her RNA numunesi için 'eksi RT kontrolünü eklemektir. PCR ürünü daha sonra, ters transkribe değildi ürün DNA karışmasını büyütülmüştür bir RNA numunesinin elde edilirse. DNA kontaminasyonu durumunda, DNaz tedavi kullanımı mümkündür. Bu yeni sentezlenmiş DNA bozmadığı Ancak, böylece DNaz önce tamamen RT-PCR inaktive edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi bir hibe ile desteklenmiştir (NSERC, hayır 298515-2011 hibe). AL doktora almıştır Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve MS burs (hayır verin. MOP123246 CIHR), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri bir hibe desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S.
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C.
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C.
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
