Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.
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Artículo de método
Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante la infección y la inflamación, los monocitos circulantes abandonan el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos, donde se diferencian en macrófagos. Los macrófagos expresan receptores de superficie de tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una amplia gama de microorganismos. TLRs jugar un papel central en la activación de macrófagos que generalmente se asocia con la alteración de la expresión génica. Los macrófagos son críticos en muchas enfermedades y se han convertido en objetivos atractivos para la terapia. En el siguiente protocolo, se describe un procedimiento para aislar los macrófagos peritoneales murinos utilizando medio de tioglicolato de Brewer. Este último será impulsar la migración de monocitos en el peritoneo, en consecuencia esto elevará el rendimiento de los macrófagos por 10 veces. Varios estudios se han llevado a cabo utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Sin embargo, los macrófagos peritoneales se mostró a ser más maduro tras el aislamiento y son más estables en su funcionaldad y fenotipo. Por lo tanto, los macrófagos aislados de la cavidad peritoneal murino presentan una importante población de células que pueden servir en diferentes estudios inmunológicos y metabólicos. Una vez aislado, los macrófagos fueron estimulados con diferentes ligandos de TLR y en consecuencia se evaluó la expresión génica.
Introducción
El sistema reticuloendotelial fagocítica se compone de células en diversos tejidos y órganos tales como la médula ósea, la sangre, el hígado y el bazo. Los macrófagos se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo, donde principalmente participan en innata y adaptativa la respuesta inmune para controlar las infecciones y claros. Además de su papel en la defensa del huésped, los macrófagos también juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido 1,2. Además, los macrófagos no sólo son importantes para la función inmune, pero también participan activamente en la homeostasis del hierro 3. En....
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices después de la aprobación por el Comité institucional Cuidado de Animales del Centre de recherche du Centre Hospitalier de la Universidad de Montreal (CRCHUM).
1. El aislamiento, identificación, y Cultura de Murino macrófagos peritoneales
- Preparar medio tioglicolato 3,8% de cerveza. Para ello, suspender 38 g de tioglicolato medio en 1000 ml de agua destilada. Llevar a hervir solución para disolver completamente el medio. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Almacene hasta 3 meses en la oscuridad, a tem....
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Resultados
En primer lugar, caracterizamos los macrófagos peritoneales murinos aislados por citometría de flujo. Para ello, hemos utilizado (F4 / 80) anticuerpos que reconocen específicamente marcadores única expresadas por los macrófagos. Se requiere esta caracterización para determinar el porcentaje de aislado de macrófagos y distinguirlos entre células obtenidas durante el proceso de aislamiento. Como se muestra en la (Figura 1), el porcentaje de células que expresan el antígeno F4 / 80 fue encontrado consisten.......
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Discusión
Los macrófagos son cruciales para la supervivencia y proporcionan un objetivo tentador para manipular el anfitrión de objetivos inmunológicos. El descubrimiento de TLRs y otras moléculas de reconocimiento han llevado a cabo los macrófagos para el centro de debate inmunológica. Los macrófagos responden a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, moléculas de daño asociado moleculares patrón (20) amortigua y moléculas asociadas con grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respuestas diferentes e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, conceder ninguna 298.515-2011). AL es el destinatario de un Ph.D. beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y MS fue apoyado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, subvención no. MOP123246).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 ratones | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, EE. UU.) | 475 | |
| Tioglicolato | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% etanol | |||
| 10% pentobarbital sódico (utilizado para la anestesia en ratones (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (DPBS), colocada en hielo y servirá para recolectar macrófagos | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Suplemento con penicilina, estreptomicina, L-glutamina y 10 % de suero fetal de ternero). | WISENT INC Canadá (QC) | 350-000-CL | |
| Jeringas de 1 y 5 ml | BD USA (NJ) | ||
| placas de 6 pocillos | Corning Incorporated (NY, EE. UU.) | MCT-150-C | |
| Lipoproteína bacteriana Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | TLRL-PM25 | |
| Poliionosina– ácido policitidílico (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | TLRL-PIC | |
| LPS de Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | L2880 | |
| Flagelina purificada de Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoproteína sintética FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | TLR-FSL | |
| ssRNA derivado de la repetición terminal larga del VIH-1 ssRNA40 (1 μ g/ml) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | TLR-LRNA-40 | |
| Tipo B CpG oligonucleótido ODN1826 (1 μ M) | InvivoGen (San Diego, EE. UU.) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canadá) | 15596-026 | |
| Agujas de 20 G y 23 G | BD USA (NJ) | ||
| Pinzas | |||
| tijera | |||
| 50 ml tubos cónicos colocados en hielo | Sarstedt (Newton, MA, EE. UU.) | 62.547.205 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Centrífuga | |||
| Hemocitómetro | |||
| F4/80 anticuerpo | BIO-RAD ( CA, EE. UU.) | ||
| Anticuerpos CD16/CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Citómetro | de flujoMostrador Coulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL, EE. UU.) | ||
| 1,5 ml Tubos Eppendorf | Axygen Scietific (CA, EE. UU.) | 3516 | |
| Cloroformo | Fisher Scientific (ON, Canadá) | UN1888 | |
| Alcohol isopropílico | JT Baker (PA, EE. UU.) | 70566 | |
| Etanol al 75% (en agua tratada con DPC) | Commercial Alchohols (QC, Canadá) | 17394 | |
| 0.01% de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (dejar reposar durante la noche y autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Sistema de RT-PCR Omniscript | Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canadá) | ||
| Kits de PCR QuantiTect SYBR Green I | Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá) | 204141 |
Referencias
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
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Reimpresiones y permisos
